大鼠腎皮質(zhì)淋巴管內(nèi)皮微通道

馬巧英 潘偉人 曾凡強 栗峣 馬傳響 劉志安

腎淋巴管是腎臟脈管系統(tǒng)的一部分，在生理和病理過程中，其在收集細胞間質(zhì)液并將其返回循環(huán)系統(tǒng)方面發(fā)揮著重要作用[1]。雖然近幾十年來文獻已報道了在人體和各種動物的生理和病理條件下腎臟的血管系統(tǒng)、淋巴分布和形態(tài)學特征[1-7]，但一些問題尚未解決。例如，淋巴是如何從腎間質(zhì)進入淋巴-循環(huán)系統(tǒng)的，淋巴的微通道在形態(tài)學上是什么樣子的？一些研究表明，淋巴通路可以以某種方式在其內(nèi)皮細胞之間找到[8-13]，但是，事實上腎臟的“真正”淋巴內(nèi)皮微通路尚未在形態(tài)學上得到權(quán)威證實，這不僅阻礙了生物技術(shù)研究的進展，還影響了精準醫(yī)學的發(fā)展，尤其是腎臟生物工程和三維（3D）組織打印[14]。

近年來，免疫熒光（IF）染色和組織清除的組合方法已被應用于檢測3D 組織結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)[15-17]，此法的應用得以使這些結(jié)構(gòu)在動物模型的生理和病理狀況下全面展現(xiàn)。因此，如果使用相同的方法來檢測腎臟厚組織切片中的淋巴結(jié)構(gòu)，可能會獲得相同的結(jié)果。最近，有報道顯示在小鼠腎臟皮質(zhì)厚組織切片中顯示了淋巴管的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并在其管壁上發(fā)現(xiàn)了“隧道”樣開口[18]。

本研究旨在通過組織學切片、HE 染色、免疫組化（IHC）染色以及掃描電子顯微鏡（SEM）等技術(shù)，探尋大鼠腎皮質(zhì)中淋巴管的分布并揭示其內(nèi)皮微通道的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

本實驗由徐州醫(yī)科大學動物倫理委員會批準（L20210226466，中國江蘇），并根據(jù)徐州醫(yī)科大學實驗動物管理和使用指南進行。

1.1 主要實驗試劑及儀器

水合氯醛（CAS#302-17-0，BBI 生命科學有限公司）；LYVE-1 抗體（NB600-1008，Novus Biologicals，美國）；二抗（Goat Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody VC002，Novus Biologicals，美國）；組織切片機（Leica RM2125 RTS，Leica Microsystems P/L，德國）；掃描電鏡（HT7700，Hitachi High-Technologies Co.Ltd，日本）。

1.2 實驗動物及取材前準備

成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠6 只，體質(zhì)量250～350 g，由徐州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。取腎前，每只大鼠接受10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉。

1.3 取材

從4 只大鼠中獲取8 個腎臟，每個腎臟按其水平面切取2 mm 厚的組織塊，作為HE 染色和免疫組化檢測的組織切片標本，置入4%多聚甲醛（PFA）溶液中固定保存。腎組織獲取后，供體大鼠斷頸處死。

另2 只大鼠獲得4 個腎臟，并即刻從每個腎臟水平切面切取1 mm×2 mm×2 mm 厚組織，作為掃描電鏡檢測的標本，快速置入2% 戊二醛與4%多聚甲醛混合液中固定，放入冰箱保存。腎組織獲取后，供體大鼠斷頸處死。

1.4 組織石蠟包埋

腎組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定2 d 后，取出，PBS 清洗3 次，置入不同濃度的乙醇梯度脫水：50%乙醇2 h、75%乙醇2 h、80%乙醇2 h、90%乙醇1 h、95%乙醇30 min、無水乙醇30 min 2 次、無水乙醇+二甲苯1 : 1 20 min，二甲苯透明30 min，浸蠟2 h 后進行石蠟組織包埋。

1.5 HE 染色觀察

石蠟冷卻后切7 μm 薄片，48 ℃溫水中展片，載玻片撈片，50 ℃烤片30 min，再經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水（無水乙醇、90%、80%和70%乙醇各5 min，蒸餾水洗），蘇木精溶液中浸染10 min，清洗2 min，移入1%鹽水乙醇20 s，流水清洗30 min，0.6%氨水返藍，流水沖洗5 min，移入伊紅液浸染3 min，水洗，梯度脫水（95%乙醇5 min 2 次，無水乙醇5 min 2 次），二甲苯（5 min 2 次）透明后，中性樹膠封片，觀察和拍照。

1.6 免疫組織化學顯色觀察

石蠟切片后經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水（同1.4）、3%H2O2孵育、檸檬酸鹽溶液高溫修復抗原，加LYVE-1 抗體，1 : 800 濃度4 ℃過夜，次日復溫加二抗，1 : 2 000 濃度室溫下孵育50 min，切片溫箱烘干，經(jīng)二甲苯透明、封片、觀察后拍照。

1.7 掃描電鏡（SEM）檢測

固定標本送掃描電鏡檢測，PB 漂洗（3～4 h）、置入1% 鋨酸溶液再固定、漂洗、梯度脫水、臨界點干燥、組織塊粘托、鍍膜后尋找和觀察目標結(jié)構(gòu)，并拍照留存。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色與免疫組織化學顯色

大鼠腎臟的HE 染色切片上除了可見腎小球、腎小管和動靜脈外，難以發(fā)現(xiàn)淋巴管管壁，但通過LYVE-1 的IHC 染色可見其散在地分布（圖1），外形不規(guī)則，管壁菲薄，在二維圖像中以不同的形狀及大小（管徑在10～30 μm）存在，有些細胞核突入管腔中。

圖1 大鼠腎皮質(zhì)內(nèi)淋巴管（標尺=20 μm）Fig.1 Lymphatic vessels in the kidney of the rat (Scale=20 μm)

2.2 掃描電子顯微鏡檢測

大鼠腎皮質(zhì)中淋巴管外表可見散在分布的內(nèi)皮微通道入口，包含半圓形的“穹隆頂部”和平坦的“底部”（圖2）。高度約為8 μm，寬約14 μm。代謝產(chǎn)物散布在其周圍，其中一些聚集在入口處。

圖2 大鼠腎皮質(zhì)淋巴管壁上內(nèi)皮微通道的SEM 觀察Fig.2 SEM observation of the endothelial microchannel in the wall of the lymphatic vessel of the renal cortex in the rat

3 討論

腎淋巴管在收集細胞間液和大分子代謝產(chǎn)物等返回循環(huán)系統(tǒng)、腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫活動中發(fā)揮著非常重要的作用[1]。對于腎淋巴管解剖的認識始于早期的水銀灌注研究[19]，以及隨后的間接注射染料混合物的研究[2-5，8-10，20-21]，其僅顯示了腎臟周圍淋巴管的分布和引流，但腎內(nèi)淋巴管的分布及詳細超微結(jié)構(gòu)尚未完全被顯示。最近的報道顯示，利用IF 染色、組織清除和掃描電子顯微鏡（SEM）技術(shù)，在小鼠厚腎組織切片中揭示了腎內(nèi)淋巴管（特別是內(nèi)皮微通道）的三維分布和細節(jié)[18]。在本研究中，我們通過組織切片、HE 染色、IHC 染色和掃描電子顯微鏡（SEM）技術(shù)，揭示了大鼠腎內(nèi)淋巴管（尤其是內(nèi)皮微通道）的細節(jié)。

此外，將本實驗結(jié)果與本研究團隊已報道的小鼠實驗結(jié)果相比較[18]，我們注意到大鼠與小鼠的腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)相似，由于腎皮質(zhì)內(nèi)的淋巴管排列無序，腔內(nèi)淋巴液充盈程度的不同，因此組織切面上可見大小不一、形狀各異的淋巴管的形態(tài)學表現(xiàn)（圖1）。從SEM 的結(jié)果對照來看，大、小鼠的腎皮質(zhì)淋巴管壁上內(nèi)皮微通道入口的微觀形態(tài)特征相同（圖3），都包含一個半圓形的“穹隆頂部”和平坦的“底部”（圖2、3）。代謝產(chǎn)物散布在其周圍，其中一些聚集在入口處。不同之處在于它們的寬度和高度。由于本研究作為一個前期報道，掃描電鏡的標本僅為4 例，數(shù)量不夠用作統(tǒng)計學處理，所以直接測量此入口的寬度和高度并引入本文。本研究組將努力收集數(shù)據(jù)，待數(shù)據(jù)（此入口在開放和/或閉合情況下）積累到一定數(shù)量再作詳細的統(tǒng)計學處理和報道。

既往研究表明，毛細淋巴管的細胞間隙被認為是細胞間質(zhì)液和大分子代謝產(chǎn)物等進入淋巴管的主要通道[1-2，7，10-13，22]，我們在發(fā)現(xiàn)小鼠腎皮質(zhì)淋巴管壁存在淋巴內(nèi)皮微通道后（圖3B），同樣在大鼠的腎皮質(zhì)淋巴管壁發(fā)現(xiàn)相似結(jié)構(gòu)（圖2），即：其入口由半圓形的“穹隆屋頂”和平坦的“底部”形成（圖3）。我們假設這種特殊的結(jié)構(gòu)可以被視為內(nèi)皮微通道的“門”，用于控制間質(zhì)液和代謝產(chǎn)物的進入。當淋巴管充滿淋巴時，管腔內(nèi)壓力增加，“底部”升高，“門”被關閉（圖4A）。相反，在淋巴被排空到較大的淋巴管后，管腔內(nèi)壓力降低，“底部”下降，“門”被打開，間質(zhì)液和代謝物進入淋巴管腔（圖4B）。這一過程可能是淋巴管清除腎組織間液和代謝產(chǎn)物的機制。

最后，有必要提出一些問題和猜測，以期通過進一步研究得以證實：①內(nèi)皮微通道是否可以在其他器官或組織的淋巴管中發(fā)現(xiàn)？②人體中是否存在類似的結(jié)構(gòu)？③病理條件是否會導致結(jié)構(gòu)變化？

4 結(jié)論

本文介紹了大鼠腎皮質(zhì)淋巴管內(nèi)皮微通道的形態(tài)結(jié)構(gòu)，可為進一步的基礎科學研究、組織工程、3D 組織打印以及臨床應用提供實驗動物的形態(tài)學理論基礎。