ESET通過lncRNA GMDS-AS1調控肝癌細胞增殖、凋亡、糖酵解的研究

黃俊玲，鐘騰猛，黃森平，高鑫艷

作者單位：1右江民族醫學院附屬醫院消化內科，廣西壯族自治區 百色533000；2百色市人民醫院肝膽外科，廣西壯族自治區 百色533099；3右江民族醫學院臨床醫學院，廣西壯族自治區 百色533000

肝細胞癌（HCC）是世界范圍內最常見的人類癌癥之一，其死亡率居所有癌癥之首［1］。HCC的發病是由于表觀遺傳的改變導致癌基因的激活和抑癌基因的失活，進而誘導的肝細胞癌［2］。表觀遺傳的改變包括異常甲基化、組蛋白修飾和核糖核酸（RNA）干擾，這不會改變遺傳密碼，但會影響mRNA的轉錄［3］。組蛋白甲基轉移酶集合域分叉1（SET domain， bifurcated 1，ESET）基因位于染色體1q21上，編碼143 kDa的蛋白質，具有多個功能域。大量研究證明，ESET在多種惡性腫瘤中高度表達，與腫瘤細胞的增殖、侵襲緊密相關［4］。ESET的過度表達與HCC進展、腫瘤侵襲性和HCC病人的低生存率顯著相關，ESET的失活降低HCC細胞的增殖和遷移能力，表明ESET是HCC中的重要癌基因。遺憾的是，ESET發揮作用的潛在調控機制研究甚少。長鏈非編碼RNA（lncRNA）起初被認為作為是多余的，現在很多研究已證實，lncRNA在生物功能調控中具有重要作用，尤其肝細胞癌［5］。多種多樣的lncRNA在腫瘤的發生和轉移中起關鍵作用［6］，但仍有部分新發現的lncRNA的作用仍不完全清楚。lncRNA甘露糖4，6-脫水酶反義RNA1（GDP-Mannose 4，6-Dehydratase Antisense RNA1，lncRNA GMDS-AS1）是近期在肺腺癌中新發現的lncRNA［7］，其在肝癌中的作用尚未可知。本研究擬以肝癌細胞為研究對象，觀察ESET、lncRNA GMDS-AS1在肝癌組織中的表達及對肝癌細胞增殖、凋亡、糖酵解的作用，揭示ESET、lncRNA GMDS-AS1在肝癌細胞中發揮調控作用的潛在關系，為肝癌的治療提供新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 樣本來自右江民族醫學院附屬醫院和百色市人民醫院2019年1月至2020年1月期間接診的行肝癌手術切除的49例病人的癌組織及對應的癌旁組織。所有病人均簽署知情同意書，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

人永生化正常肝細胞THLE-2、肝癌細胞HepG2購自美國菌種保藏中心；DMEM培養液、胎牛血清購自美國Gibco；Lipofectamin 3000試劑購自美國Thermo Fisher Scientific；TRIzol液購自美國Invitrogen；反轉錄試劑盒、定量聚合酶鏈反應（qPCR）試劑盒購自日本Takera；鼠抗ESET（A-1）單抗、ESET siRNA質粒購自美國圣克魯斯生物；兔抗細胞增殖抗原標志物Ki-67單抗、兔抗葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）多抗、兔抗乳酸脫氫酶A（LDHA）單抗、兔抗活化胱天蛋白酶-3（C-caspase-3）單抗均購自Cell Signaling Technology；HRP標記的二抗購自北京索萊寶公司；細胞計數試劑盒（CCK8）購自上海東仁化學研究所；膜聯蛋白-V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翌圣生物；RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）試劑盒購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 THLE-2、HepG2細胞使用混有10%胎牛血清的DMEM培養液培養。培養條件為37 ℃、5%二氧化碳的恒溫細胞培養箱中培養，隔天更換一次培養液。

1.2.2 細胞轉染與分組 正常培養的THLE-2、HepG2細胞設為THLE-2、HepG2組。將HepG2細胞分為空白組（不做任何處理）、空載體組（轉染pcDNA或si-con）、敲減ESET組（轉染si-ESET）、過表達lncRNA GMDS-AS1組（轉染pcDNA-GMDS-AS1）。具體的轉染方法：使用3倍的Lipofectamin 3000轉染試劑與各組待轉染物質（DNA或質粒）混合與HepG2細胞共轉染8 h，更換新培養液繼續培養。實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）或蛋白質印跡法確認轉染效率。

1.2.3 qRT-PCR實驗檢測ESET、lncRNA GMDSAS1的表達 收集細胞，Trizol液提取總RNA，反轉錄試劑盒合成互補DNA（cDNA），-20 ℃保存待用。以cDNA為模板qPCR實驗的模板，按照qPCR試劑盒要求操作，檢測分析ESET、lncRNA GMDS-AS1的表達。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，2-ΔΔCt法計算ESET、lncRNA GMDS-AS1的表達水平。儀器程序設置為：95 ℃，2 min；95 ℃，30 min；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；72 ℃，5 min，41個循環。ESET，正向引物5'-AAGACCAGAAGCTCCGTGAA-3'，反向引物5'-CCTGGGAACTGCTCTTCTTG-3'；lncRNA GMDS-AS1，正向引物5′-AATGCTTTGAGGCCAAGCTA-3′，反向引物5′-TGGGTTCATAAGGGTTGCAT-3′；GAPDH，正向引物5'-GACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'，反向引物5'-GTGGCAGTGATGGCATGGA-3'。

1.2.4 蛋白質印跡法檢測ESET、Ki-67、GLUT-1、LDHA、C-caspase-3的蛋白表達 收集細胞或組織勻漿，冰上放射免疫沉淀法裂解30 min，提取總蛋白，測定蛋白濃度，變性。取變性后的蛋白上清做蛋白電泳上樣模板。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白電泳結束后，用轉膜儀將蛋白從凝膠轉移至NC膜，轉模環境需在0 ℃以下。使用含2.5%脫脂奶粉的封閉液對膜封閉處理（37 ℃孵育2 h）。洗膜3次，將膜浸入稀釋的一抗溶液中（鼠抗ESET（A-1）單抗，1∶800；兔抗Ki-67單抗，1∶1 000；兔抗GLUT-1多抗，1∶1 500；兔抗LDHA單抗，1∶1 000；兔抗C-caspase-3單抗，1∶2 000），4 ℃孵育過夜。充分洗膜，將膜轉入稀釋的二抗溶液中，37 ℃孵育2 h。洗膜，用ECL發光液顯影，曝光。Image J軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白灰度/內參GAPDH的灰度表示蛋白的表達量。

1.2.5 CCK8法檢測細胞活性 收集細胞，調至0.5×105個/毫升，取200 μL細胞接種至96孔板，更換新鮮培養液，分別培養24、48、72、96 h。取出培養24、48、72、96 h的各組細胞，向細胞中加入10 μL的CCK8反應液，避光孵育20 min。在490 nm波長下檢測細胞吸光度［D（λ）490］。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡 收集細胞，洗滌后用結合緩沖液制成懸液，取500 μL至于反應管，再依次加入Annexin V-FITC（5 μL）、PI（5 μL），避光孵育20 min，上流式細胞儀分析細胞凋亡。總凋亡率（%）=早期凋亡率（%）+晚期凋亡率（%）。

1.2.7 RIP實驗檢測ESET與lncRNA GMDS-AS1的相互作用 收集細胞，調至1×107個/毫升，取1.0 mL至EP管，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，加入裂解液冰上裂解。結束后，分別向EP管中加入5 μL異染色質相關小RNA、免疫球蛋白G（IgG）抗體、Argonaute 2蛋白（Ago2）抗體，再加入2.5 μL的RNA酶抑制劑，輕輕吹打混勻。4 ℃低溫離心10 min（12 000 r/min），洗滌3次，取上清置于磁珠中，4 ℃孵育過夜。用洗滌液洗滌磁珠3次，將磁珠結合復合物用于qRT-PCR實驗。

1.3 統計學方法 實驗中的數據均用SPSS 22.0進行專業的統計分析。計量資料使用表示。兩組數據比較使用獨立樣本t檢驗，多組數據之間的比較使用單因素方差分析聯合LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織和癌旁組織中ESET mRNA和lncRNA GMDS-AS1表達的影響 與癌旁組織相比，肝癌組織中ESET的mRNA和蛋白表達均顯著升高，lncRNA GMDS-AS1的表達顯著降低（P＜0.05），肝癌組織中lncRNA GMDS-AS1的表達與ESET的表達之間呈負相關性，見表1。THLE-2組相比，HepG2組細胞ESET的mRNA和蛋白表達均顯著升高，lncRNA GMDS-AS1表達顯著降低（P＜0.05），見表2。

表1 ESET mRNA和lncRNA GMDS-AS1在肝癌組織和癌旁組織的表達/

表1 ESET mRNA和lncRNA GMDS-AS1在肝癌組織和癌旁組織的表達/

注：ESET mRNA為組蛋白甲基轉移酶集合域分叉1微小RNA，lncRNA GMDS-AS1為長鏈非編碼RNA甘露糖4，6-脫水酶反義RNA1。

lncRNA GMDS-AS1 1.02±0.31 0.63±0.20 7.57＜0.001組別癌旁組織肝癌組織t值P值例數49 49 ESET mRNA 0.99±0.33 5.18±0.94 29.44＜0.001 ESET蛋白0.23±0.07 0.69±0.14 20.57＜0.001

表2 ESET mRNA和lncRNA GMDS-AS1在THLE-2、HepG2中的表達/

表2 ESET mRNA和lncRNA GMDS-AS1在THLE-2、HepG2中的表達/

注：ESET mRNA為組蛋白甲基轉移酶集合域分叉1微小RNA，lncRNA GMDS-AS1為長鏈非編碼RNA甘露糖4，6-脫水酶反義RNA1，ESET為組蛋白甲基轉移酶集合域分叉1。

lncRNA GMDS-AS1 1.01±0.13 0.51±0.08 9.83＜0.001組別THLE-2組HepG2組t值P值重復次數9 9 ESET mRNA 1.00±0.17 4.15±0.32 26.08＜0.001 ESET蛋白0.24±0.03 0.67±0.10 12.36＜0.001

2.2 敲減ESET抑制肝癌細胞的增殖 與空載體組相比，敲減ESET組細胞ESET的mRNA和蛋白表達均顯著降低，Ki-67蛋白表達顯著降低，細胞在48、72、96 h的活性顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 敲減ESET抑制肝癌細胞增殖/

表3 敲減ESET抑制肝癌細胞增殖/

注：ESET為組蛋白甲基轉移酶集合域分叉1，Ki-67為細胞增殖抗原標志物。①與空載體組比較，P＜0.05。

組別空白組空載體組敲減ESET組F值P值細胞活性（A490）96 h 0.96±0.10 0.95±0.13 0.77±0.09①8.82 0.001重復次數48 h 0.46±0.08 0.44±0.06 0.32±0.06①11.38＜0.001 ESET mRNA 0.98±0.22 0.96±0.03 0.50±0.24①18.62＜0.001 ESET 9蛋白0.58±0.07 0.60±0.09 0.24±0.04①75.70＜0.001 Ki-67 0.70±0.11 0.69±0.05 0.35±0.11①40.15＜0.001 24 h 0.25±0.04 0.26±0.02 0.24±0.03 0.93 0.408 72 h 0.71±0.13 0.68±0.07 0.46±0.07①18.84＜0.001 9 9 9

2.3 敲減ESET對肝癌細胞糖酵解和凋亡的影響與空載體組相比，敲減ESET組細胞GLUT-1、LDHA的蛋白表達均顯著降低，C-caspase-3蛋白表達顯著升高，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。見表4，圖1。

圖1 敲減組蛋白甲基轉移酶集合域分叉1（ESET）的肝癌細胞凋亡圖及GLUT-1、LDHA、C-caspase-3的蛋白表達：A為肝癌細胞的凋亡圖；B為GLUT-1、LDHA和C-caspase-3的蛋白圖

表4 敲減ESET對肝癌細胞糖酵解和凋亡的影響/

表4 敲減ESET對肝癌細胞糖酵解和凋亡的影響/

注：ESET為組蛋白甲基轉移酶集合域分叉1，GLUT-1為葡萄糖轉運蛋白1，LDHA為乳酸脫氫酶A，C-caspase-3為活化胱天蛋白酶-3。①與空載體組比較，P＜0.05。

組別空白組空載體組敲減ESET組F值P值凋亡率/%4.19±0.59 3.74±0.51 14.41±1.5①329.97＜0.001重復次數9 9 9 GLUT-1 0.66±0.04 0.64±0.08 0.47±0.10①16.35＜0.001 LDHA 0.72±0.13 0.76±0.05 0.43±0.10①29.79＜0.001 C-caspase-3 0.25±0.04 0.27±0.02 0.45±0.18①9.53 0.001

2.4 過表達lncRNA GMDS-AS1對肝癌細胞增殖的影響 與空載體組相比，過表達lncRNA GMDSAS1組細胞lncRNA GMDS-AS1的表達顯著升高，Ki-67蛋白表達顯著降低，在48、72、96 h的活性顯著降低（P＜0.05）。見表5。

表5 過表達lncRNA GMDS-AS1抑制肝癌細胞的增殖/

表5 過表達lncRNA GMDS-AS1抑制肝癌細胞的增殖/

注：lncRNA GMDS-AS1為長鏈非編碼RNA甘露糖4，6-脫水酶反義RNA1，Ki-67為細胞增殖抗原標志物。①與空載體組比較，P＜0.05。

組別空白組空載體組過表達lncRNA GMDS-AS1組F值P值細胞活性（A490）96 h 1.03±0.11 0.98±0.12 0.72±0.08①22.73 0.001重復次數48 h 0.45±0.08 0.46±0.06 0.34±0.06①8.80＜0.001 lncRNA GMDS-AS1 1.00±0.14 1.10±0.09 5.19±0.43①725.89＜0.001 Ki-67 0.65±0.09 0.63±0.08 0.42±0.06①24.25＜0.001 24 h 0.29±0.04 0.28±0.05 0.27±0.03 0.54 0.590 72 h 0.68±0.09 0.65±0.08 0.47±0.07①17.95＜0.001 9 9 9

2.5 過表達lncRNA GMDS-AS1對肝癌細胞糖酵解和凋亡的影響 與空載體組相比，過表達lncRNA GMDS-AS1組細胞GLUT-1、LDHA的蛋白表達均顯著降低，C-caspase-3蛋白表達顯著升高，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。見表6，圖2。

圖2 過表達長鏈非編碼RNA甘露糖4，6-脫水酶反義RNA1（lncRNA GMDS-AS1）的肝癌細胞凋亡圖及GLUT-1、LDHA、C-caspase-3的蛋白表達：A為過表達lncRNA GMDS-AS1的肝癌細胞凋亡圖；B為GLUT-1、LDHA、C-caspase-3的蛋白圖

表6 過表達lncRNA GMDS-AS1抑制肝癌細胞糖酵解、誘導細胞凋亡/

表6 過表達lncRNA GMDS-AS1抑制肝癌細胞糖酵解、誘導細胞凋亡/

注：lncRNA GMDS-AS1為長鏈非編碼RNA甘露糖4，6-脫水酶反義RNA1，GLUT-1為葡萄糖轉運蛋白1，LDHA為乳酸脫氫酶A，C-caspase-3為活化胱天蛋白酶-3。①與空載體組比較，P＜0.05。

凋亡率/%3.89±0.84 3.92±0.86 14.67±1.94①200.23＜0.001組別空白組空載體組過表達lncRNA GMDS-AS1組F值P值重復次數9 9 9 GLUT-1 0.61±0.04 0.60±0.08 0.42±0.10①17.15＜0.001 LDHA 0.74±0.11 0.75±0.09 0.43±0.07①35.61＜0.001 C-caspase-3 0.21±0.04 0.23±0.05 0.49±0.08①62.74 0.001

2.6 ESET與lncRNA GMDS-AS1的結合 與空載體組相比，過表達ESET組Ago2抗體的細胞中lncRNA GMDS-AS1表達顯著升高（P＜0.05）。見表7。

表7 RIP實驗結果/

表7 RIP實驗結果/

注：RIP為RNA結合蛋白免疫沉淀，lncRNA GMDS-AS1為長鏈非編碼RNA甘露糖4，6-脫水酶反義RNA1，IgG為免疫球蛋白G，Ago2為Argonaute 2蛋白，Input為異染色質，ESET為組蛋白甲基轉移酶集合域分叉1。

Input 8.84±0.39 8.79±0.92 0.15 0.883組別空載體組過表達ESET組t值P值重復次數Ago2 2.14±0.21 4.97±0.52 15.14＜0.001 lncRNA GMDS-AS1 IgG 0.89±0.10 0.91±0.13 0.37 0.719 9 9

3 討論

ESET是人類肝癌中表達上調最顯著的表觀遺傳調節因子，ESET的上調與肝癌病人的轉移形成、預后較差密切相關［8-9］。近期，Shao等［10］在肝癌的研究中報道，ESET在肝癌組織和細胞中低表達，作為miR-621的下游靶基因調控肝癌的放射敏感性，揭示miR-621/ESET通路通過激活p53信號通路的活性提高肝癌細胞的放射敏感性。本研究發現，ESET在肝癌組織中的表達異常升高，并且敲減ESET具有抑制肝癌細胞增殖、糖酵解，促進凋亡的作用，這均與前人的研究相呼應。但是ESET發揮致癌作用的潛在機制仍需繼續研究。此研究還發現了lncRNA GMDS-AS1在肝癌組織中的表達與ESET的表達具有明顯的負相關性，于是猜測ESET在肝癌細胞中的作用可能與lncRNA GMDS-AS1有一定關系。

lncRNA已被證明是癌癥進展的重要調節因子，包括肝細胞癌［11-12］。lncRNA DEAD/H盒蛋白11反義RNA 1調控肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲、糖代謝和凋亡過程［13］。lncRNA遠端同源框6反義RNA1（lncRNA DLX6-AS1）的沉默，可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進凋亡的發生［14］。但是，lncRNA GMDS-AS1在肝癌中的作用仍有待進一步研究。Zhao等［15］在肺腺癌的研究中發現新的失調lncRNA，lncRNA GMDS-AS1作為腫瘤抑制基因在肺腺癌中低表達，過表達lncRNA GMDS-AS1能夠在體內外抑制癌細胞的增殖并促進凋亡；深入研究還發現，GMDS-AS1是miR-96-5p的靶基因，GMDS-AS1與miR-96-5p相關，調節LUAD細胞的增殖和凋亡，說明lncRNA GMDS-AS1作為肺腺癌治療的潛在靶點的前景。但是，lncRNA GMDS-AS1作為新發現的癌癥調控因子，其在肝癌中的功能尚未有人研究。本研究使用qRT-PCR實驗檢測了肝癌組織和癌旁組織中lncRNA GMDS-AS1的表達發現，lncRNA GMDS-AS1在肝癌組織中表達下調，這與Zhao在肺腺癌中的研究結果相吻合［16］。進一步研究，通過構建過表達lncRNA GMDS-AS1的肝癌細胞，檢測細胞增殖、凋亡、糖酵解發現，過表達lncRNA GMDS-AS1抑制了癌細胞的增殖、糖酵解，促進癌細胞的凋亡，說明lncRNA GMDS-AS1在肝癌中也扮演抑癌基因的角色［17］。此研究還通過RIP實驗發現，ESET與lncRNA GMDS-AS1之間存在結合力［18］。

綜上所述，甲基轉移酶ESET促進肝癌細胞的增殖、糖酵解，抑制凋亡，發揮促進癌癥惡化的作用，產生這種作用的潛在機制與負向調節抑癌因子lncRNA GMDS-AS1相關，為肝癌的精準治療提供新靶點。