氣道高反應(yīng)性疾病動物模型研究進展*

張雯婧，代向東，劉帥，張晗，2，李霖，2

（1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

氣道高反應(yīng)性（AHR）是指機體對非特異性刺激（物理、化學或藥物）表現(xiàn)出過度的支氣管收縮，從而導(dǎo)致氣道狹窄和氣道阻力增加的一種病理特征[1]。近年來，國內(nèi)外眾多學者對AHR 的相關(guān)機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)其影響因素主要包括氣道變應(yīng)性炎癥、氣道重塑、黏液分泌過度與機體免疫反應(yīng)失衡等[2-3]，見圖1。AHR 是支氣管哮喘的主要特征之一，乙酰甲膽堿支氣管激發(fā)試驗（MBPT）作為檢測和量化AHR 的主要方法，在支氣管哮喘的臨床診斷中具有重要意義[4]。除此之外，慢性阻塞性肺疾病（COPD）、胃食管反流病（GERD）、新型冠狀病毒感染等疾病亦可見AHR 現(xiàn)象，導(dǎo)致MBPT 陽性[5]。以往對AHR 的研究多采用哮喘動物模型，模型較為單一且不具有特異性。建立不同的AHR 疾病動物模型，有利于深入研究AHR 的發(fā)病機制，為臨床診治AHR 的藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)。因此，本文論述了AHR 的常用檢測指標，并總結(jié)了近年來支氣管哮喘、COPD、GRED、新型冠狀病毒感染4 種疾病的造模方法及模型評價方法，為AHR 疾病的研究提供一定參考。

圖1 AHR 發(fā)生機制

1 AHR 檢測指標

肺功能檢測是目前AHR 測定最普遍的方法。通過給予從低至高濃度的實驗動物支氣管激發(fā)藥物乙酰甲膽堿（mACh），檢測動物的各項肺功能指標，來反映AHR[6]。以下論述了體外非侵入性檢測及體內(nèi)侵入性檢測兩種方法。

1.1 體外非侵入性檢測 全身體積描記法（WBP）是將動物置于密閉體描箱內(nèi)，體描箱與通向體描箱外的感應(yīng)器連接。動物呼吸時，其胸廓的起伏使體描箱內(nèi)容積發(fā)生改變，經(jīng)計算機處理后，可計算出呼吸間歇（Penh）、吸氣時間（Ti）、呼氣時間（Te）、潮氣量（TV）、呼氣中期流速（EF50）等相關(guān)參數(shù)。其中，Penh 為非侵入性指標，與胸膜內(nèi)壓有較好的相關(guān)性，能夠很好地反映支氣管收縮劑對下呼吸道的刺激作用，目前己被廣泛應(yīng)用[7]。該法可以對清醒自由活動的小動物進行肺功能及氣道反應(yīng)相關(guān)的測試，避免創(chuàng)傷性氣管切開術(shù)及麻醉，可長時間重復(fù)進行肺功能檢測。

1.2 體內(nèi)侵入性檢測 體內(nèi)侵入性檢測指實驗過程中動物需要中度麻醉并進行氣管插管，一般行機械通氣，控制潮氣量（Vt）和呼吸頻率，多使用全面的有創(chuàng)動物肺功能測量系統(tǒng)[8]。此方法可獲得的參數(shù)有：總肺容量（TLC）、功能殘留容量（FRC）、呼吸阻力（Rrs）、肺阻力（RL）、呼氣氣道阻力（Re）、最大呼氣中期流速（MMF）、呼氣峰流速（PEF）、動態(tài)肺順應(yīng)性（Cdyn）、用力呼氣量（FEV）。其中，RL 和Cdyn是AHR 的經(jīng)典檢測指標，且能夠反映肺部的力學變化。該方法實驗動物需要麻醉和氣管插管，技術(shù)和時間要求較高，并且不能重復(fù)檢測以及動態(tài)觀察AHR 變化[9-10]。

2 AHR 疾病動物模型

2.1 支氣管哮喘動物模型 哮喘是一種由多因素引發(fā)的慢性氣道炎癥性疾病，伴有不同程度的AHR和氣流阻塞[11]。研究表明，針對AHR 治療可以更有效地控制哮喘，同時減輕慢性氣道炎癥[12]。

支氣管哮喘最常用的動物模型為卵清蛋白（OVA）-氫氧化鋁（ALUM）誘導(dǎo)模型。模型建立分為致敏階段和激發(fā)階段，第一階段給予小鼠腹腔或皮下注射OVA-ALUM 溶液進行致敏，激發(fā)階段通常采用OVA 溶液滴鼻或OVA 溶液霧化激發(fā)。OVA 是誘導(dǎo)哮喘的經(jīng)典抗原，易使實驗動物產(chǎn)生AHR 和肺部炎性細胞浸潤[13]。Xiao 等[14]于實驗第1、7、14 天對小鼠腹腔注射混懸液（含100 μg OVA 與10 mg ALUM）進行致敏，于第21～29 天使用200 μg OVA連續(xù)滴鼻誘發(fā)支氣管哮喘。造模完成24 h 后，麻醉小鼠并進行氣管插管，使用不同濃度（0、6、12、24、48 mg/mL）的mACh 連續(xù)霧化6 min，每分鐘收集1 次氣道阻力（Rrs）。結(jié)果顯示每個濃度的mACh 較基線的Rrs 百分比增加，即模型組小鼠在所有濃度條件下都因吸入mACh 而表現(xiàn)出更高的Rrs。同時，模型組表現(xiàn)出明顯的肺部炎性浸潤，肺泡灌洗液中總細胞和嗜酸性粒細胞數(shù)量顯著增加，白細胞介素（IL）-4、IL-5 和IL-13 mRNA 表達水平升高。金光玉等[15]在實驗的第7、14、21 天對小鼠皮下注射致敏液（0.1 mg/L OVA），于第31、33、35 天使小鼠霧化吸入OVA 溶液（0.4 mg/L）激發(fā)支氣管哮喘，第38 天開始，每周2 次、連續(xù)12 周繼續(xù)對小鼠進行霧化吸入。造模完成24 h 后將小鼠麻醉，按濃度倍增法依次靜脈注射mACh（2.5、5、10、25、50 mg/mL），隨著mACh 濃度的成倍遞增，模型組與對照組的RL 均增加，當濃度到達10 mg/mL 以上時，模型組與對照組比較有統(tǒng)計學差異。模型組肺泡灌洗液和肺組織中IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）含量和蛋白表達明顯升高，Thl/Th2 平衡失調(diào)。

以上研究表明，OVA 溶液滴鼻激發(fā)或霧化激發(fā)，均可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)AHR。針對霧化和滴鼻激發(fā)兩種方法，Kim 等[16]比較了霧化吸入和鼻內(nèi)過敏原刺激對AHR 的影響。研究者記錄了基線和10 s 后暴露于不斷增加的甲基膽堿濃度的Rrs 和呼氣值（E 值），兩種激發(fā)方法的Rrs 值在12.5、25、50 mg/mL的甲基膽堿處理下顯著增加。在50 mg/mL 乙酰膽堿暴露條件下，霧化組的Rrs 值高于滴鼻組。與吸入生理鹽水對照組相比，吸入12.5、50 mg/mL 乙酰膽堿組E 值顯著升高。結(jié)果表明，霧化激發(fā)法比滴鼻法誘導(dǎo)的AHR 反應(yīng)更強烈。

2.2 COPD 動物模型 COPD 是一種與吸煙相關(guān)的慢性肺部疾病，其典型特征是慢性肺部炎癥、氣道重塑、肺氣腫[17]。目前，約2/3 的COPD 患者存在AHR，其氣道反應(yīng)性介于支氣管哮喘與正常人之間[18]。

COPD 常用動物模型有香煙煙霧（CS）誘導(dǎo)模型和香煙煙霧聯(lián)合脂多糖（CS-LPS）誘導(dǎo)模型。CS 已被證明是COPD 發(fā)病的危險因素，同樣也是研究中最常見的COPD 動物模型誘導(dǎo)因子[19]。脂多糖（LPS）屬于內(nèi)毒素，進入肺部時可刺激單核細胞、內(nèi)皮細胞合成并釋放一系列炎性介質(zhì)，使動物的肺部及其氣道出現(xiàn)炎癥。劉雪君等[20]將小鼠于香煙煙霧中暴露24 周，每周5 d，于第1、15 天經(jīng)鼻滴入LPS（150 μg/mL）。造模完成后使用WBP 系統(tǒng)檢測各組小鼠肺功能。結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠的FEV0.1/用力肺活量（FVC）、PEF、MMF 和Cdyn 均顯著降低，Re 升高，提示小鼠出現(xiàn)AHR。模型組氣道周圍膠原蛋白沉積增加，血清及肺組織中的IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達水平升高。Liu等[21]選用單純CS 誘導(dǎo)COPD 模型，每天2 次將小鼠全身暴露于CS 中，持續(xù)24 周。使用WBP 檢測小鼠肺功能，發(fā)現(xiàn)接觸CS 小鼠的Penh 顯著升高。蘇木精-伊紅（HE）染色結(jié)果顯示模型組平均線性截距增加，表明小鼠出現(xiàn)AHR 伴有肺氣腫。

為了評估單純CS 誘導(dǎo)與CS-LPS 誘導(dǎo)對AHR嚴重程度的影響，有研究者對這兩種方式進行了差異比較研究[22]。結(jié)果表明，CS 和CS-LPS 組的TLC、FRC 和吸氣阻力（RI）均高于對照組，而這兩組的FEV50/FVC 較低。此外，LPS-CS 組的RI 和FEV50/FVC 高于CS 組。肺組織的HE 染色結(jié)果表明，與對照組相比，CS 組和LPS-CS 組的平均肺泡截獲量和小氣道壁厚度更高，但與CS 組相比，LPS-CS 組的支氣管炎癥面積更大。

僅通過CS 暴露建立的COPD 小鼠模型能夠更好地模仿人類COPD 在穩(wěn)定期的基本特征。CS-LPS的聯(lián)合暴露建立COPD 模型可以更好地模擬人類COPD 在急性加重期的病理特征，AHR 相關(guān)指標更為嚴重。

2.3 GRED 動物模型 GERD 是臨床常見病，指胃或者十二指腸內(nèi)的物質(zhì)倒流，食管腔因過度接觸胃液而引起食管黏膜損傷[23]。胃酸是引起GERD 食管損傷的重要原因，反流進入氣管可直接刺激呼吸道黏膜，嚴重者可導(dǎo)致AHR 甚至哮喘[24-25]。研究證明，在小鼠模型氣道內(nèi)應(yīng)用酸性物質(zhì)會導(dǎo)致中性粒細胞氣道炎癥并增加AHR[26]。

GERD 動物造模方法主要分為3 類：食管內(nèi)灌注外源性酸法、手術(shù)法、微創(chuàng)法。食管內(nèi)灌注外源性酸法是指食管直接灌注外源性的酸和胃蛋白酶，通過化學刺激損傷食管黏膜，建立GERD 動物模型。研究表明，在使FEV1下降同樣標準的情況下，灌注生理鹽水組的乙酰膽堿濃度明顯高于鹽酸灌注組[27]。楊霞等[28]使用鹽酸溶液（0.1 mol/L，含0.5%胃蛋白酶）緩慢灌注豚鼠食管下端，持續(xù)20 min，每日1 次，連續(xù)14 d，建立GRED 模型，通過檢測不同濃度mACh 對豚鼠RL 和Cydn 的變化來評估氣道反應(yīng)性。結(jié)果表明，mACh 刺激濃度達到0.25 mmol/L和0.5 mmol/L 時，模型組肺阻力增加百分比和肺順應(yīng)性減少百分比大于對照組，氣道反應(yīng)性增高，差異具有統(tǒng)計學意義。模型組遠端食管黏膜出現(xiàn)潰瘍糜爛，炎癥表現(xiàn)明顯，氣管組織和肺組織炎癥明顯。Cheng 等[29]等研究表明，鹽酸灌注導(dǎo)致豚鼠對mACh的反應(yīng)性增高，當mACh 濃度為60～80 μg/kg 時，模型組氣道對mACh 的反應(yīng)性明顯高于對照組。過碘酸雪夫氏（PAS）染色及Masson 染色結(jié)果顯示鹽酸輸注導(dǎo)致杯狀細胞增生、膠原沉積增加。

目前，很少有研究者使用手術(shù)法和微創(chuàng)法來研究AHR 的變化，手術(shù)法和微創(chuàng)法是否能夠?qū)е翧HR 有待研究。食管內(nèi)灌注外源性酸法操作流程相對簡單，易產(chǎn)生AHR，有助于食管黏膜損害和防御機制的研究，適用于病理及病因?qū)W研究，并可用于評價藥物治療效果，是研究GERD 疾病中AHR 現(xiàn)象的較好選擇。但由于人體內(nèi)反流物成分復(fù)雜，而實驗灌注成分相對單一，無法精確模擬GERD 生理病理過程且不適于遠期臨床研究。

2.4 新型冠狀病毒感染動物模型 新型冠狀病毒屬于冠狀病毒科有包膜的正鏈單鏈RNA 病毒，其包膜上的刺突蛋白（S 蛋白）能與細胞表面特異性受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）結(jié)合[30]。新型冠狀病毒感染可導(dǎo)致毛細血管通透性增高，影響通氣功能，嚴重者會導(dǎo)致AHR 甚至急性呼吸衰竭[31-33]。

目前，通過靶向ACE2 建立了多種新型冠狀病毒感染動物模型。在此分為轉(zhuǎn)基因動物模型及非轉(zhuǎn)基因動物模型。嚙齒類（小鼠、大鼠）動物由于ACE2在353 位含有組氨酸，不能作為新型冠狀病毒的有效受體[34]，人源ACE2（hACE2）轉(zhuǎn)基因小鼠“應(yīng)時而生”。表達hACE2 的轉(zhuǎn)基因小鼠對新型冠狀病毒非常敏感，鼻腔或胃內(nèi)接種新型冠狀病毒毒株后，在其肺部、氣管和腦組織中都可以看到強大的病毒RNA 復(fù)制。免疫染色表明，在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和微膠質(zhì)細胞中也可以檢測到病毒S 蛋白表達[35]。非轉(zhuǎn)基因動物模型指靈長類（恒河猴）和其他哺乳動物（雪貂、貓、犬）ACE2 能與新型冠狀病毒S 蛋白緊密結(jié)合。此類模型感染病毒后出現(xiàn)體溫升高、體質(zhì)量減輕的現(xiàn)象，病毒于動物的呼吸道高效復(fù)制，引起了肺部病變。該模型克服了轉(zhuǎn)基因小鼠制作過程中建模時間長、操作難度大等困難[36]。

以上兩種模型均使用新型冠狀病毒感染動物，但新型冠狀病毒活病毒的分離、培養(yǎng)、動物接種等實驗活動均要求在生物安全三級實驗室內(nèi)進行，對實驗室要求較高，存在生物安全隱患。近期有研究表明，LPS 霧化吸入誘導(dǎo)的急性肺損傷動物模型可以最大限度表征新型冠狀病毒引發(fā)的肺損傷[37]。LPS霧化吸入致使小鼠RL 升高，中性粒細胞數(shù)量增加，誘發(fā)了嚴重的急性炎癥反應(yīng)[38]。

目前對新型冠狀病毒感染動物模型的研究大多止步于評估病毒復(fù)制程度、肺部病理，較少研究者使用動物模型評估新型冠狀病毒感染的肺功能。臨床數(shù)據(jù)表明，肺功能異常和肺彌漫功能損害在嚴重的急性新型冠狀病毒感染患者中更常見，且此類患者在康復(fù)后仍可能存在AHR[39-40]。非轉(zhuǎn)基因動物模型臨床表現(xiàn)輕微且肺部病毒滴度相對較低[41]，故此類模型不適用于研究AHR。相對來說，轉(zhuǎn)基因動物模型以及LPS 霧化致急性肺損傷動物模型更適于AHR 的研究。

3 結(jié)語

AHR 是支氣管哮喘的主要病理生理和診斷指標，是COPD、GRED、新型冠狀病毒感染等疾病的臨床表現(xiàn)之一[42-44]。AHR 發(fā)病機制復(fù)雜，與氣道炎癥、氣道重塑和黏液分泌過多有著千絲萬縷的聯(lián)系，但其具體分子機制至今仍不明確。動物模型作為人類疾病研究中不可或缺的工具，為AHR 疾病的發(fā)病機制研究提供了實驗基礎(chǔ)。如上所述，4 種疾病的動物模型可不同程度地再現(xiàn)AHR，總結(jié)與歸類見表1。由此可見影響AHR 的因素復(fù)雜多變，煙霧、粉塵、細菌及病毒刺激均可導(dǎo)致AHR，并與機體免疫息息相關(guān)。為了更深入地研究AHR 的發(fā)病機制，實驗設(shè)計者必須要明確各種動物模型的特點，在試劑選擇、試劑用量以及造模周期等方面反復(fù)推敲，注意在不同疾病動物模型中AHR 檢測指標的差異性，結(jié)合實際情況遴選恰當?shù)脑u價指標，以構(gòu)建與臨床AHR 疾病更加吻合的動物模型。

表1 4 種AHR 疾病動物模型總結(jié)

值得注意的是，西醫(yī)AHR 疾病動物模型已較為完備，但中醫(yī)證候模型較少。AHR 疾病是一種難治性的慢性疾病，單純西醫(yī)治療療程較長，疾病容易反復(fù)發(fā)作，中醫(yī)藥在對AHR 疾病的治療上顯示出獨特的優(yōu)勢。中醫(yī)認為AHR 多發(fā)作于痰瘀交阻，AHR 狀態(tài)下，機體為保證一定的肺通氣血流比例，使得氣管、血管收縮，血液黏滯度增加，血流的壅滯不暢導(dǎo)致滲出增多、炎癥反應(yīng)加劇[45]。現(xiàn)代學者通過動物實驗論證了中醫(yī)方劑、中藥提取物對于治療AHR 的療效，并且進一步研究了其作用機制，但都采用了西醫(yī)制作動物模型的方法，在病證結(jié)合方面研究較少，目前也尚無統(tǒng)一的標準與規(guī)范[46-47]。因此，在已有動物模型的基礎(chǔ)上，結(jié)合中醫(yī)特點，復(fù)制中醫(yī)病證結(jié)合模型方法及評價是今后AHR 疾病動物模型研究的重要發(fā)展方向。