甘草地上部分活性部位的急性毒性和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)研究*

劉海帆，冀祖恩，彭一峰，張麗，孫琰琴，羅恒磊，張薇

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.新疆甘草及制品研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，庫爾勒 841011；3.新疆全安藥業(yè)股份有限公司，庫爾勒 841011）

甘草地上部分為甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）的干燥莖葉，其資源豐富且總黃酮含量可達(dá)5.64%[1]。課題組前期研究表明甘草地上部分醇提物具有抗慢性非細(xì)菌性前列腺炎（CNP）的作用[2]，且黃酮類成分為其主要活性成分[3]。本研究對(duì)甘草地上部分醇提物進(jìn)一步富集黃酮后得到的活性部位進(jìn)行急性毒性和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)，為甘草地上部分活性部位在臨床上的安全應(yīng)用提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BC-2800vet 邁瑞獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（深圳雷杜生命科技）；Chemray800 全自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科技）；ME203E/02 電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KZ-Ⅱ高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；D3024R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京股份公司）；MX-F 渦旋混合器（武漢賽維爾生物科技有限公司）；EP-150-M 1.5 mL 離心管（武漢賽維爾生物科技有限公司）；KE0037273 1 000 μL 移液器、YE3K030591 200 μL 移液器、DS35110 50 μL移液器、KE0012951 10 μL 移液器（移液器均購自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京股份公司）；1012710P 載玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；Sw101-35 烤箱（上海蘇博儀器有限公司）；10212450C 蓋玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；EG11 組織包埋機(jī)（德國徠卡）；SYD-PK 切片烤片機(jī)（沈陽譽(yù)德電子儀器有限公司）；RM2245 切片機(jī)（德國徠卡）。

1.2 藥物與試劑 本實(shí)驗(yàn)樣品甘草地上部分是采自甘肅省酒泉市瓜州縣河?xùn)|鄉(xiāng)的9年生栽培甘草，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院王文全教授鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.，經(jīng)自然陰干后，粉碎過40 目篩，備用。甘草地上部分以70%乙醇回流提取，提取溫度75 ℃，液料比8∶1，提取時(shí)間90 min，提取2 次，濃縮、干燥成粉末。將甘草地上部分醇提物用10 倍量的去離子水溶解后靜置12 h，3 500 r/min 離心15 min（離心直徑為80 cm）得到上清，將上清溶液部分揮干，收集得到的上清浸膏為甘草地上部分活性部位，即本研究的受試物（出膏率為79.3%，黃酮含量為14.58%），受試物的制備方法依據(jù)本課題組前期研究得到的最佳醇提工藝[4]進(jìn)行微調(diào)；水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）；無水乙醇（分析純，北京化工廠）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，coolaber 公司）；二甲苯（北京化工廠）；中性樹膠（上海實(shí)驗(yàn)器材廠）；蘇木素染液（珠海貝素生物技術(shù)公司）；伊紅染液（珠海貝素生物技術(shù)公司）；S03030 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、S03040 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、S03038 堿性磷酸酶、S03043 白蛋白、S03022 總蛋白、S03036 尿素、S03076 肌酐、S03024 肌酸激酶、S03027 三酰甘油、S03042 總膽固醇、S03039 葡萄糖測(cè)定試劑盒（深圳市雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；C120 總膽紅素、C108 鈉、C013 氯、C068 鉀測(cè)定試劑盒（長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司）。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)昆明種雄性小鼠20 只，體質(zhì)量45～50 g（用于急性毒性實(shí)驗(yàn)）；SPF 級(jí)SD 雄性大鼠40 只，體質(zhì)量180～200 g（用于長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)），均購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)，保持恒溫24 ℃，12 h 光/暗周期下，接受標(biāo)準(zhǔn)飲食和水，自由采食。本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合中國倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則，急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠與長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)大鼠的倫理審查編號(hào)分別為SCXK（京）2016-0006、SLXD（京）-20200902021。

2 方法

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) 選取SPF 級(jí)昆明種雄性小鼠20 只，分為2 組，分別為實(shí)驗(yàn)組和空白組，每組10 只。實(shí)驗(yàn)組劑量為33.2 g/kg（最大給藥劑量），灌胃給藥，兩組均每日給藥2 次（間隔5 h），空白組給予等體積0.5%CMC-Na 溶液。給藥后連續(xù)觀察4～6 h，以后每日觀察1 次，持續(xù)觀察14 d。觀察小鼠的基本狀況（是否腹瀉、驚厥、嗜睡，是否出現(xiàn)被毛、皮膚、呼吸系統(tǒng)等異常），第14 天處死所有小鼠，進(jìn)行解剖觀察是否有臟器病變，實(shí)驗(yàn)期間的第0、7、11、14 天記錄小鼠體質(zhì)量。

2.2 長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn) 選取SD 雄性大鼠40 只，分為空白組、受試物8.3、16.6、33.2 g/kg 組，每組10 只，每日給藥1 次，每周連續(xù)給藥6 d，停藥1 d，共連續(xù)給藥90 d，空白組給予等體積0.5%CMC-Na 溶液。每日觀察動(dòng)物精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、毛色、二便等一般體征，每周稱取體質(zhì)量1 次，根據(jù)體質(zhì)量變化及時(shí)調(diào)整灌胃量，2 d 記錄1 次大鼠飲水量與攝食量，計(jì)算食物利用率（食物利用率=體質(zhì)量增加量÷進(jìn)食量×100%，表示大鼠攝入100 g 飼料增加的體質(zhì)量）。給藥中期（45 d）及末期（90 d）禁食不禁水16 h，麻醉后眼眶取血，制備全血及血清標(biāo)本，分別進(jìn)行血液學(xué)及血清生化指標(biāo)檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖取出臟器并稱取質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)，對(duì)臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對(duì)滿足正態(tài)性分布及方差齊性的數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

3.1.1 小鼠死亡與生存狀況分析 在灌服甘草地上部分活性部位后，各組均未出現(xiàn)小鼠死亡情況，未發(fā)現(xiàn)腹瀉、嗜睡、驚厥等行為，未發(fā)現(xiàn)被毛、皮膚等異常，實(shí)驗(yàn)組與空白組小鼠狀態(tài)無明顯差異。

3.1.2 小鼠體質(zhì)量與大體解剖情況分析 各組小鼠平均體質(zhì)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且實(shí)驗(yàn)組與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第14 天解剖小鼠后，兩組均未發(fā)現(xiàn)明顯臟器病變。見表1。

表1 甘草地上部分活性部位對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（±s）g

表1 甘草地上部分活性部位對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（±s）g

組別 動(dòng)物數(shù)第0 天第7 天第11 天第14 天空白組1046.40±2.42 50.80±1.60 51.00±1.48 54.40±1.96實(shí)驗(yàn)組1048.60±1.11 51.60±1.56 52.50±1.75 53.20±1.89

3.2 長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)

3.2.1 大鼠死亡與生存狀況分析 實(shí)驗(yàn)過程中，各組大鼠身體狀況良好，飲水與進(jìn)食正常，體質(zhì)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，大小便正常，全程未見實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡情況。

3.2.1.1 甘草地上部分活性部位對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響 各實(shí)驗(yàn)組與空白組大鼠體質(zhì)量均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，第1 周增長(zhǎng)較快，各劑量組及空白組動(dòng)物體質(zhì)量均未發(fā)現(xiàn)異常變化。見表2。

表2 甘草地上部分活性部位對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響（±s）g

表2 甘草地上部分活性部位對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響（±s）g

組別動(dòng)物數(shù)第1 周第2 周第3 周第4 周第5 周第6 周空白組10314.23±10.73361.34±21.09406.15±24.99443.88±27.77461.38±25.18484.55±22.34 8.3 g/kg 組10317.39±15.63362.67±21.71412.00±30.25452.47±37.02460.79±47.06480.51±51.58 16.6 g/kg 組10310.31±14.05351.36±24.64390.09±24.45430.01±30.70447.27±34.19469.67±35.36 33.2 g/kg 組10308.50±16.19351.36±23.11388.03±28.38426.30±33.70445.71±37.78466.34±43.98組別動(dòng)物數(shù)第7 周第8 周第9 周第10 周第11 周第12 周空白組10510.58±26.94535.22±26.92554.93±25.49575.75±25.65592.00±25.07601.25±31.04 8.3 g/kg 組10508.61±59.03527.45±67.67565.17±53.38587.62±58.22583.93±54.3638.00±64.22 16.6 g/kg 組10486.67±47.41513.35±37.92542.13±39.48565.31±38.21587.01±36.28598.14±36.12 33.2 g/kg 組10492.63±47.35518.81±44.92546.59±50.09566.01±53.56590.04±57.98606.80±59.78

3.2.1.2 甘草地上部分活性部位對(duì)大鼠食物利用率的影響 各組大鼠在90 d 實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)的食物利用率趨勢(shì)一致，均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，在同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠食物利用率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），認(rèn)為甘草地上部分經(jīng)口給藥90 d 對(duì)大鼠的正常進(jìn)食無不良影響。各組大鼠的食物利用率隨時(shí)間變化情況見表3。

表3 甘草地上部分活性部位對(duì)大鼠食物利用率的影響（±s）%

表3 甘草地上部分活性部位對(duì)大鼠食物利用率的影響（±s）%

組別動(dòng)物數(shù) 第1 周 第2 周 第3 周 第4 周 第5 周 第6 周 第7 周 第8 周 第9 周 第10 周 第11 周 第12 周空白組1031±230±416±614±213±212±216±315±312±312±48±1.01±0.3 8.3 g/kg 組1039±521±428±523±38±110±314±515±314±411±17±1.53±0.8 16.6 g/kg 組1043±425±329±623±216±221±49±217±218±112±29±1.71±0.2 33.2 g/kg 組1043±526±630±422±212±312±214±119±620±110±111±2.01±0.2

3.2.1.3 甘草地上部分活性部位對(duì)大鼠飲水量的影響 空白組與各實(shí)驗(yàn)組在90 d 實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)的飲水量變化趨勢(shì)基本一致，第10 周時(shí)均出現(xiàn)下降趨勢(shì)，在第11 周恢復(fù)，可能是由于第10 周時(shí)受環(huán)境因素影響，動(dòng)物房溫度升高或者環(huán)境出現(xiàn)異常所致。但各給藥組與空白組趨勢(shì)一致，所以認(rèn)為甘草地上部分活性部位經(jīng)口給藥90 d 對(duì)大鼠的正常飲水無不良影響。各組大鼠的飲水量隨時(shí)間變化情況見表4。

表4 甘草地上部分活性部位對(duì)大鼠飲水量的影響（±s）g

表4 甘草地上部分活性部位對(duì)大鼠飲水量的影響（±s）g

組別動(dòng)物數(shù) 第1 周第2 周第3 周第4 周第5 周第6 周第7 周第8 周第9 周第10 周第11 周第12 周空白組1056.00±3.64 54.17±6.24 65.63±9.51 52.29±5.36 52.32±4.69 51.46±5.46 38.75±5.41 42.93±4.16 46.25±6.54 27.37±6.28 37.96±4.82 36.25±7.46 8.3 g/kg 組1056.17±5.84 64.00±6.91 54.11±6.24 68.10±8.91 62.86±6.39 61.67±5.91 58.57±9.81 72.53±9.82 70.83±10.19 39.77±4.82 50.78±5.49 53.72±4.10 16.6 g/kg 組1051.20±3.26 67.02±5.91 50.71±3.56 55.83±8.51 50.92±5.96 50.00±6.81 51.29±3.61 56.02±4.92 46.50±4.92 36.35±5.61 38.24±4.19 37.90±4.79 33.2 g/kg 組1045.43±4.39 51.55±8.64 44.38±5.26 48.10±4.69 44.80±4.62 42.74±4.92 42.14±7.91 53.79±5.08 51.57±8.19 37.71±4.00 35.65±2.79 37.81±8.21

3.2.2 大鼠臟器及組織病理學(xué)分析

3.2.2.1 大體解剖觀察 與空白組比較，各實(shí)驗(yàn)組大鼠大體解剖和臟器與體質(zhì)量比例結(jié)果未見明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。主要指標(biāo)見表5。

表5 甘草地上部分經(jīng)口給予90 d 對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響（±s）%

表5 甘草地上部分經(jīng)口給予90 d 對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響（±s）%

組別空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組動(dòng)物數(shù)10 10 10 10胸腺指數(shù)心臟指數(shù) 肺臟指數(shù) 脾臟指數(shù) 腎上腺指數(shù) 腎臟指數(shù) 附睪指數(shù) 睪丸指數(shù)前列腺指數(shù)肝臟指數(shù) 腦指數(shù)0.000 66±0.000 17 0.23±0.004 0.30±0.02 0.17±0.009 0.011±0.001 0.64±0.06 0.22±0.06 0.72±0.04 0.13±0.03 2.90±0.25 0.39±0.01 0.000 65±0.000 19 0.24±0.050 0.26±0.07 0.17±0.040 0.009±0.002 0.67±0.15 0.25±0.04 0.64±0.09 0.12±0.04 3.20±0.82 0.36±0.07 0.000 57±0.000 21 0.23±0.030 0.27±0.03 0.16±0.030 0.023±0.037 0.59±0.09 0.27±0.04 0.68±0.08 0.12±0.03 2.72±0.50 0.35±0.04 0.000 52±0.000 15 0.25±0.040 0.31±0.04 0.18±0.030 0.012±0.003 0.66±0.08 0.23±0.04 0.63±0.09 0.12±0.04 3.01±0.43 0.35±0.05

3.2.2.2 組織病理學(xué)檢查 各實(shí)驗(yàn)組大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、腎上腺、附睪、睪丸、前列腺、腦組織結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)完整，未見明顯病理改變。蘇木精-伊紅（HE）染色結(jié)果見圖1。

圖1 大鼠組織病理學(xué)HE 染色結(jié)果（×400）

心肌細(xì)胞排列正常，形態(tài)結(jié)構(gòu)無紊亂；肝臟組織病理切片可見肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞及血竇清晰無異常，肝竇未見充血，肝匯管內(nèi)無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；脾臟組織切片中紅髓區(qū)和白髓區(qū)界限清晰，小梁結(jié)構(gòu)無異常；肺泡組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)清晰，肺泡無塌陷及破裂，肺泡充盈適度，肺泡囊管壁結(jié)構(gòu)完整；腎小體結(jié)構(gòu)完整，腎小球位于小體中央且結(jié)構(gòu)完整；胸腺皮髓界限清楚，小葉明顯，皮質(zhì)部成熟淋巴細(xì)胞較多，髓質(zhì)部可見明顯的胸腺小體；腎上腺皮質(zhì)與髓質(zhì)分界明顯；皮質(zhì)部網(wǎng)狀帶、球狀帶、束狀帶的細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；附睪細(xì)胞排列緊密，界限清晰，附睪管內(nèi)含有大量成熟精子；睪丸曲細(xì)小管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞發(fā)育良好；前列腺體未見萎縮，間質(zhì)無水腫，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡上皮排列整齊無增生現(xiàn)象；腦組織結(jié)構(gòu)正常，皮質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，白質(zhì)部神經(jīng)纖維染色均勻，為淡粉色，排列整齊，紋理清晰。

3.2.3 甘草地上部分活性部位對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

3.2.3.1 實(shí)驗(yàn)45 d 血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)45 d 時(shí)，與空白組比較，部分實(shí)驗(yàn)組的檢測(cè)指標(biāo)出現(xiàn)變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中8.3 g/kg 組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞數(shù)、血小板計(jì)數(shù)以及16.6 g/kg 組的血小板計(jì)數(shù)降低。實(shí)驗(yàn)45 d時(shí)各組大鼠的血液學(xué)指標(biāo)見表6。

表6 甘草地上部分活性部位經(jīng)口給予45 d 對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響（±s）

表6 甘草地上部分活性部位經(jīng)口給予45 d 對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05。

白細(xì)胞檢測(cè)紅細(xì)胞檢測(cè)組別動(dòng)物數(shù)白細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L）淋巴細(xì)胞數(shù)（×109/L）單核細(xì)胞數(shù)（×109/L）中性粒細(xì)胞數(shù)（×109/L）淋巴細(xì)胞百分比（%）單核細(xì)胞百分比（%）中性粒細(xì)胞百分比（%）紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（×1012/L）血紅蛋白（g/L）空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10 13.85±1.6311.68±1.460.30±0.001.88±0.3384.23±2.032.23±0.2913.55±1.807.21±0.14 138.75± 3.70 10.07±0.61*8.87±0.530.15±0.05*1.05±0.22*87.97±2.011.83±0.2710.20±1.936.79±0.92 135.67± 9.64 11.63±2.6710.08±2.140.22±0.091.33±0.5486.95±2.722.00±0.2911.05±2.476.62±1.30 135.67±13.56 10.50±2.759.10±2.400.23±0.091.17±0.3486.80±1.062.15±0.8711.05±0.626.60±1.81 127.00± 8.49紅細(xì)胞檢測(cè)血小板檢測(cè)組別動(dòng)物數(shù)平均紅細(xì)胞體積（fL）紅細(xì)胞壓積（%）43.20±0.83 40.68±4.48 41.37±7.10 39.94±9.07平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（pg）平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（g/L）紅細(xì)胞分布寬度（%）血小板計(jì)數(shù)（×109/L）平均血小板體積（fL）血小板分布寬度（%）血小板壓積（%）空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10 60.03±1.0819.23±0.28 60.32±3.4220.20±2.15 62.98±3.3220.95±2.74 62.45±5.3618.88±1.05 245.50±30.49 335.00±23.76 282.67±21.36 367.60±99.29 15.25±0.54 16.03±0.37 15.83±0.46 16.08±0.43 1 184.25±827.00 741.80± 96.65*691.33±168.01*849.60±119.19 6.15±0.32 6.83±0.63 6.57±0.37 6.38±0.63 16.78±0.77 18.47±1.04 18.25±0.79 17.88±1.31 0.66±0.04 0.46±0.16 0.45±0.11 0.49±0.15

3.2.3.2 實(shí)驗(yàn)90 d 血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)90 d 時(shí)，與空白組比較，各實(shí)驗(yàn)組指標(biāo)未見明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)90 d 時(shí)各組大鼠血液學(xué)指標(biāo)見表7。

表7 甘草地上部分活性部位經(jīng)口給予90 d 對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響（±s）

表7 甘草地上部分活性部位經(jīng)口給予90 d 對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響（±s）

白細(xì)胞檢測(cè)紅細(xì)胞檢測(cè)組別動(dòng)物數(shù)白細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L）淋巴細(xì)胞數(shù)（×109/L）單核細(xì)胞數(shù)（×109/L）中性粒細(xì)胞數(shù)（×109/L）淋巴細(xì)胞百分比（%）單核細(xì)胞百分比（%）中性粒細(xì)胞百分比（%）紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（×1012/L）血紅蛋白（g/L）空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10 13.15±2.1511.20±2.060.30±0.071.65±0.2384.80±2.812.30±0.3212.90±2.508.46±0.30 152.25±3.96 9.72±4.408.85±2.740.15±0.051.30±1.1384.83±4.842.15±0.7413.02±1.147.27±1.55 128.67±2.67 12.70±2.0810.38±1.750.32±0.072.00±0.3081.80±1.092.58±0.2115.62±1.048.30±0.45 153.83±5.58 11.80±1.079.85±1.010.28±0.041.67±0.2783.53±2.232.25±0.3714.22±1.968.28±0.31 151.83±2.61紅細(xì)胞檢測(cè)血小板檢測(cè)組別動(dòng)物數(shù)平均紅細(xì)胞體積（fL）平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（pg）平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（g/L）紅細(xì)胞分布寬度（%）紅細(xì)胞壓積（%）47.90±1.00 39.40±8.70 46.38±1.88 45.57±1.35血小板計(jì)數(shù)（×109/L）平均血小板體積（fL）血小板分布寬度（%）血小板壓積（%）空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10 56.80±2.0317.98±0.55 54.17±1.8617.65±0.54 55.98±1.8518.52±0.62 55.15±1.4418.32±0.52 317.25±6.22 327.17±8.17 331.17±3.34 332.83±5.58 14.40±0.83 13.73±0.85 13.95±1.06 13.95±0.50 967.70±139.65 914.00±292.94 800.17±118.28 782.67±195.10 6.35±0.15 6.28±0.42 6.47±0.44 6.37±0.24 16.50±0.07 17.13±0.41 16.65±0.28 16.60±0.32 0.57±0.06 0.51±0.14 0.51±0.07 0.49±0.11

實(shí)驗(yàn)45 d 時(shí)，8.3g/kg 組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、血小板計(jì)數(shù)及16.6 g/kg 組的血小板計(jì)數(shù)與空白組比較顯著降低，而實(shí)驗(yàn)90 d 時(shí)檢測(cè)卻未見顯著性差異，考慮為采集時(shí)間、方法與個(gè)體差異所致。由于實(shí)驗(yàn)45 d 時(shí)采用大鼠眼眶后靜脈叢采血的方式采集血液，而實(shí)驗(yàn)90 d 時(shí)采用腹主動(dòng)脈采血方式，所以推測(cè)眼眶后靜脈叢采血會(huì)造成動(dòng)物產(chǎn)生興奮與排尿、排便等現(xiàn)象，從而影響部分血液學(xué)、生化指標(biāo)改變[5]，且由于實(shí)驗(yàn)45 d 與90 d采血時(shí)間相差45 d，有研究表明不同年齡大鼠的血液學(xué)指標(biāo)會(huì)有所不同[6]。

上述結(jié)果中有較多的血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)異常，但根據(jù)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可知，血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)均存在正常范圍，即使各實(shí)驗(yàn)組的實(shí)際檢測(cè)值與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但若這個(gè)數(shù)值在正常范圍之內(nèi)，則這個(gè)數(shù)值依然為正常值。或者部分指標(biāo)只有異常升高時(shí)才具有臨床意義，異常降低則不作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，此時(shí)也不認(rèn)為是發(fā)生毒性反應(yīng)。按照此原則[7]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，排除了無意義的異常值，最終提示甘草地上部分活性部位給藥后實(shí)驗(yàn)45 d與實(shí)驗(yàn)90 d 對(duì)大鼠血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)并無異常影響。

3.2.4 甘草地上部分活性部位對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響

3.2.4.1 實(shí)驗(yàn)45 d 大鼠血清生化檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)45 d 時(shí)，與空白組比較，8.3 g/kg 組白蛋白異常降低，16.6 g/kg 組白蛋白、鈉離子異常降低，葡萄糖異常升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)45 d 時(shí)各組大鼠血清生化指標(biāo)見表8。

表8 甘草地上部分活性部位經(jīng)口給予45 d 對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響（±s）

表8 甘草地上部分活性部位經(jīng)口給予45 d 對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10肝功能腎功能白蛋白（g/L）堿性磷酸酶（U/L） 總膽紅素（μmol/L）總蛋白（g/L）尿素（mmol/L）肌酐（μmol/L）37.72±1.55136.36±30.309.76±1.3456.26±3.7715.05±0.8932.02±2.30 35.77±0.88*172.64±24.938.46±3.0554.36±1.7213.51±1.9830.27±0.98 35.29±0.34*130.97±25.278.90±2.0053.76±1.8414.14±1.0432.04±3.94 36.51±0.80152.05±22.058.38±2.5154.74±1.7113.06±2.5631.51±2.42組別動(dòng)物數(shù)血糖葡萄糖（mmol/L）心肌酶肌酸激酶（U/L）空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10血脂離子三酰甘油（mmol/L）總膽固醇（mmol/L）氯（mmol/L） 鉀（mmol/L） 鈉（mmol/L）1.19±0.221.92±0.276.75±0.43779.80± 61.33101.15±1.852.89±0.04158.68±0.85 1.03±0.301.79±0.217.47±1.02859.74± 86.97110.19±6.142.93±0.14159.71±2.91 1.30±0.311.64±0.157.78±1.64*947.54±180.39117.97±3.702.87±0.16148.54±6.53*0.99±0.341.91±0.219.37±1.11992.15±142.00101.40±2.042.82±0.12159.43±1.24

3.2.4.2 實(shí)驗(yàn)90 d 大鼠血清生化檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)90 d 時(shí)，與空白組比較，各實(shí)驗(yàn)組大鼠的總膽紅素均顯著降低；8.3、16.6 g/kg 組三酰甘油均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)90 d 時(shí)各組大鼠的血清生化指標(biāo)見表9。

表9 甘草地上部分活性部位經(jīng)口給予90 d 對(duì)大鼠血清生化的影響（±s）

表9 甘草地上部分活性部位經(jīng)口給予90 d 對(duì)大鼠血清生化的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05。

組別空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組動(dòng)物數(shù)10 10 10 10肝功能腎功能白蛋白（g/L）堿性磷酸酶（U/L）總膽紅素（μmol/L）總蛋白（g/L）尿素（mmol/L）肌酐（μmol/L）43.11±1.07215.11±42.2926.60±4.4873.65±4.5515.37±0.6434.61±2.80 42.07±0.55204.18±18.8719.62±3.36*70.77±1.4916.39±1.5538.37±2.74 41.84±0.99217.98±32.8714.99±3.57*70.86±2.7515.26±1.0836.14±2.52 42.76±0.43195.53± 8.4918.82±3.88*72.21±1.2214.61±0.6833.06±2.43組別動(dòng)物數(shù)血糖葡萄糖（mmol/L）心肌酶肌酸激酶（U/L）空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10血脂離子三酰甘油（mmol/L） 總膽固醇（mmol/L）氯（mmol/L） 鉀（mmol/L） 鈉（mmol/L）2.88±0.572.42±0.309.11±1.41888.52±233.28 117.95±1.453.70±0.19159.85±1.77 1.85±0.87*2.16±0.3410.51±2.11736.79±229.82 114.94±3.283.63±0.36161.37±4.02 1.98±0.51*2.20±0.298.87±1.941 089.58±441.53 113.49±2.003.52±0.10160.34±2.75 2.21±0.612.36±0.318.31±0.691 316.98±441.43 114.44±1.943.68±0.20158.88±2.29

實(shí)驗(yàn)45 d 時(shí)，與空白組比較，8.3 g/kg 組大鼠白蛋白異常降低，16.6 g/kg 組大鼠白蛋白、鈉離子異常降低，葡萄糖異常升高。實(shí)驗(yàn)90 d 時(shí)，與空白組比較，各給藥組的總膽紅素均顯著降低；8.3、16.6 g/kg 組三酰甘油均顯著降低。這些指標(biāo)僅45 d 或90 d 時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均在正常范圍之內(nèi)，所以認(rèn)為其屬于無意義的異常值。推測(cè)這些值的波動(dòng)與取樣時(shí)間有關(guān)，且在90 d 取材前1 d 將大鼠轉(zhuǎn)移至另一房間，禁食1 個(gè)晚上，可能由于環(huán)境的變化導(dǎo)致大鼠的某些生化指標(biāo)產(chǎn)生波動(dòng)。

血清生化指標(biāo)同血液學(xué)指標(biāo)一樣，與空白組比較出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不完全代表毒性作用，與血液學(xué)指標(biāo)的分析結(jié)果相同。以此原則[8-9]對(duì)本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，排除了無意義的異常值，最終提示甘草地上部分活性部位給藥對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)無異常影響。

4 討論與結(jié)論

相關(guān)研究表明，在關(guān)注中藥療效的同時(shí)也應(yīng)重視對(duì)其安全性的檢測(cè)[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)甘草地上部分水提物、醇提物具有潛在毒性[11]，為保證臨床用藥的安全性，本研究按照《中藥新藥研究指南》[12]和《中藥、天然藥物長(zhǎng)期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[13]的要求對(duì)甘草地上部分活性部位的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為新藥研發(fā)提供安全性依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)中急性毒性與長(zhǎng)期毒性研究均只使用雄性鼠，是由于本課題組研究發(fā)現(xiàn)甘草地上部分對(duì)前列腺炎治療效果顯著[2]，將此藥用于男性患者，故該研究未對(duì)雌性鼠展開實(shí)驗(yàn)。

甘草地上部分活性部位的小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)中，在14 d 的觀察期內(nèi)，無小鼠死亡，各組小鼠被毛、皮膚、運(yùn)動(dòng)、身體健康狀況無異常，無明顯中毒癥狀。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠體質(zhì)量正常增長(zhǎng)，甘草地上部分活性部位的最大耐受劑量＞33.2 g/kg，屬于無毒級(jí)，提示甘草地上部分活性部位無急性毒性。

長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)期間，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正常進(jìn)食進(jìn)水，食物利用率及飲水量均未見異常；各組大鼠臟器指數(shù)均無明顯差異，認(rèn)為受試物對(duì)臟器指數(shù)沒有影響。組織病理學(xué)方面，受試物對(duì)大鼠組織病理學(xué)切片無異常影響，且甘草地上部分對(duì)大鼠血液學(xué)及血清生化指標(biāo)無異常影響。因此，甘草地上部分活性部位對(duì)大鼠一般生理狀態(tài)及肝臟、腎臟功能與臟器組織學(xué)均無長(zhǎng)期毒性反應(yīng)。

綜上所述，甘草地上部分活性部位無急性毒性和長(zhǎng)期毒性反應(yīng)，藥物的最大耐受量≥33.2 g/kg，即有效劑量[14]的30 倍；基本安全劑量≥33.2 g/kg，即臨床劑量的30 倍，在治療劑量范圍內(nèi)用藥安全性高。

血液生理生化指標(biāo)不僅可以反映動(dòng)物的生理狀態(tài)和健康狀態(tài)，還可以評(píng)價(jià)其生長(zhǎng)性能和生產(chǎn)性能，對(duì)評(píng)價(jià)動(dòng)物的代謝狀況、生理狀態(tài)和飼養(yǎng)管理具有重要意義。在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了個(gè)別指標(biāo)的波動(dòng)情況，但均在正常范圍之內(nèi)，推測(cè)其與大鼠的年齡、飼養(yǎng)條件及取樣方法有關(guān)。楊林等[15]研究表明不同生理階段的同性小鼠血液生理指標(biāo)差異顯著；詹純列等[16]研究表明環(huán)境因素對(duì)小鼠血常規(guī)的指標(biāo)有顯著影響；李罡等[17]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，由于在研究中所收集的SD 大鼠血液學(xué)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)資料包括了3 個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室和4 個(gè)季節(jié)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物的年齡、初始體質(zhì)量、營(yíng)養(yǎng)及喂養(yǎng)環(huán)境等條件有所差異，血樣的采集、運(yùn)送和檢測(cè)條件等亦不完全一致，使血紅蛋白等10 項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定值在不同批次間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

針對(duì)受試物的化學(xué)成分，本課題組通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和大鼠體內(nèi)的入血及代謝成分，得到甘草地上部分醇提物的主要藥效成分為葛根素、山奈酚、木犀草素和喬松素4 種黃酮類成分，并且通過藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)探究了4 種成分在血漿、尿液、糞便及前列腺中的濃度變化，得出這4 種成分在血漿及前列腺中均有分布，之后可以考慮將這4 種成分作為甘草地上部分活性部位的質(zhì)控成分[3]。

受試物的主要成分為黃酮類成分，他們除了具有相應(yīng)藥效外，研究還表明其具有臟器保護(hù)作用，能夠降低毒性。Yang 等[18]發(fā)現(xiàn)甲基化黃酮的表觀滲透系數(shù)是非甲基黃酮的4～7 倍，吸收較好。硫酸酯化代謝會(huì)增加藥物的水溶性，使其更容易隨尿液排出，降低毒性[19]。侯筱婷[20]研究表明葛根素可以預(yù)防大鼠急性酒精性肝損傷，對(duì)肝臟具有保護(hù)作用。預(yù)先給予葛根素可以明顯減輕急性肺損傷大鼠肺組織炎癥反應(yīng)及肺水腫程度[21]，可有效拮抗慶大霉素所致的大鼠腎損害[22]。香葉木素在肝、肺、腎臟中均有分布，香葉木素可通過降低核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎性小體活性緩解四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝纖維化[23]，對(duì)胎糞誘導(dǎo)的新生大鼠急性肺損傷具有治療作用[24]，可以通過核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）抗氧化信號(hào)通路緩解順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷[25]。

除了保護(hù)作用，黃酮類化合物會(huì)影響人體內(nèi)藥物的代謝，甚至導(dǎo)致不良反應(yīng)。如其在體內(nèi)會(huì)和細(xì)胞色素P450 作用，從而影響體內(nèi)藥物的濃度，導(dǎo)致藥效減弱或者增強(qiáng)，甚至產(chǎn)生毒性[19]；黃酮類化合物也可能影響親和素蛋白的活性，導(dǎo)致親和素-致癌物的活性增加[26]。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物還可以激活CYP1A1 和CYP1A2，從而誘導(dǎo)致癌物質(zhì)的活化，如高良姜素、槲皮素、香葉木素可以增加CYP1A1 基因的表達(dá)[27-28]，在之后的研究中可以對(duì)其中特定的黃酮類毒性成分予以關(guān)注。