不同促滲劑對芍藥苷凝膠體外透皮吸收的影響

胡遠康，鐘雨虹，劉志東，祁東利

（1.天津中醫藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫藥大學現代中藥發現與制劑技術教育部工程中心，天津 301617）

芍藥苷（PF）亦稱芍藥花素，來源于芍藥科植物芍藥根，是從中藥赤芍、白芍中分離的一種蒎烷單萜苦味苷。在白芍總苷（TGP）中含量最高，約90%[1]，為白色吸濕性無定形棕褐色粉末（90%為類白色粉末）。現代藥理研究表明，PF 具有抗抑郁、抗炎、鎮痛、抗腫瘤、保肝、神經保護、免疫調節、防治糖尿病等作用[2-4]。PF 常用于抗炎及鎮痛，有助于臨床治療類風濕性關節炎[5-7]。

口服給藥藥動學研究表明，PF 在胃腸道中吸收情況不佳，生物利用度低，因此改變PF 給藥途徑對提高藥物的體內吸收與增強藥物療效，具有非常重要的意義[8-10]。經皮吸收制劑可以避免肝臟的首過效應，且可以提高患者依從性。但是皮膚作為一道生理屏障，對藥物的透過具有阻礙作用，因此，篩選合適的促滲劑顯得尤為必要。目前，對PF 的研究大多圍繞其藥理活性開展，而對透皮吸收少有報道[11-13]，且將其制為凝膠劑尚無報道，本實驗系統研究PF體外經皮滲透特性，意在為PF 的制劑設計提供理論依據。

1 儀器、試藥與實驗動物

1.1 儀器 智能磁力加熱攪拌器（SCGL-4B，DTGE1000，鞏義市予華儀器有限責任公司）；高效液相色譜（HPLC）儀（1260，VWD，DEACX18632，美國安捷倫公司）；透皮擴散實驗儀（TK-20B 型，上海鍇凱科技貿易有限公司）；臺式通用冷凍離心機（Thermo Fisher 公司）；去離子水機（Mill-Q，美國Millipore公司）。

1.2 試藥 PF 對照品（批號：106H021，北京索萊寶科技有限公司，含量>98%）；PF 原料藥（批號：FY00Y0816，南通飛宇生物科技有限公司，含量＞98%）；卡波姆940（批號：20200614，武漢拉那白醫藥化工有限公司）；藥用甘油（批號：K2019079，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；羥苯乙酯（艾勒科技）；三乙醇胺（批號：20210103，成都華邑藥用輔料制造有限責任公司）；生理鹽水（批號：21020203B，安徽雙鶴藥業有限責任公司）；薄荷油（批號：B22N9C75604，上海源葉生物科技有限公司）；桉葉油（批號：B28S9C71133，上海源葉生物科技有限公司）；油酸（藥用級，批號：18513，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；水溶性月桂氮卓酮（批號：200701，湖北科捷制藥有限公司）。

2 方法與結果

2.1 分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 安捷倫色譜柱：ZORBAX EcLipse Plus，C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A（0.1%磷酸水溶液）-B（乙腈），梯度洗脫：0～9 min，20%～20%B；9～12 min，20%～60%B；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測波長230 nm；后運行時間3 min。

2.1.2 專屬性考察 取12 h 空白PF 凝膠透皮接受液、PF 凝膠透皮接受液、PF 對照品溶液。按照“2.1.1”項下的條件進樣分析，記錄HPLC 圖，結果表明該方法專屬性良好。見圖1。

2.1.3 線性考察 稱取PF 對照品（含量≥98%）適量置于10 mL 容量瓶中，使用甲醇定容，母液濃度為2 720.48 μg/mL。將母液濃度依次配置為1 360.24、544.10、272.05、136.02、54.41、13.60 μg/mL，以PF 濃度（C）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，計算標準曲線方程A=13.527C+82.105，R2=0.999 5。

2.1.4 精密度考察 取“2.1.3”項下濃度分別為54.41、136.02、1 360.24 μg/mL 的低、中、高濃度的供試品溶液，1 d 內分別測定3 次，連續測定3 d，根據供試品溶液的峰面積，計算3 種濃度標準品溶液日內精密度RSD 范圍為0.15%～2.57%，日間精密度范圍為1.92%～2.53%。

2.1.5 重復性考察 取12 h 內的同一PF 凝膠透皮接受液，離心（10 000r/min，10 min，離心半徑16.8 cm），過水系0.22 μm 濾膜，平行處理6 份，分別進樣分析，計算RSD 值為1.02%。

2.1.6 加樣回收率 取已知含量的PF 凝膠透皮接受液，平行處理6 份，分別加入PF 對照品2.46 mg，進樣分析，計算6 份接受液加樣回收率平均值為99.41%，RSD 值為0.76%。

2.1.7 穩定性考察 取12 h 內的同一PF 凝膠透皮接受液，離心（10 000r/min，10 min，離心半徑16.8 cm），過水系0.22 μm 濾膜，分別于0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 進樣檢測，以各樣品中PF 的含量計算RSD 值為0.51%。

2.2 PF 理化性質測定

東北四省區節水增糧行動是中央著眼經濟社會發展全局批準開展的一項重大專項行動。東北四省區水資源相對短缺，特別是農業發展受到水資源條件制約，開展東北四省區節水增糧行動水資源論證是實施好節水增糧行動的重要前期工作，對科學確定發展規模，合理利用有限水資源，緩解水資源供需矛盾，提高水資源利用效率，確保節水增糧增效具有重要意義。項目水資源論證過程中，切實加強工作領導，進一步提高認識，統一思想，通過主要領導親自抓、勤過問、多了解、常督促，將最嚴格水資源管理制度的總體要求嚴格落實到報告書編制過程中，才能真正做到科學論證確定項目發展規模，合理利用有限的水資源，進而做到量水而行、因水制宜，通過節水實現增糧。

2.2.1 PF 表觀溶解度的測定 將過量的PF 原料藥加入至pH 為7.4 的2 mL 磷酸緩沖鹽溶液中（n=3），使用智能磁力加熱攪拌器攪拌24 h，溫度控制在（37±1）℃，制成過飽和溶液，靜置，吸取上清藥液使用0.22 μm 有機濾膜過濾，離心（10 000 r/min，10 min，離心半徑16.8 cm），取0.1 mL 加至50 mL 容量瓶中，使用pH 為7.4 的磷酸緩沖鹽溶液進行稀釋、定容，按照“2.1.1”項下的色譜條件進樣分析，計算PF在pH 為7.4 的磷酸緩沖鹽溶液中的溶解度為（118.00±0.48）mg/mL。

2.2.2 PF 油水分配系數測定 精密量取上述離心后的PF 飽和溶液1 mL 置于4 mL 離心管中，加等量的水飽和正辛醇恒溫振蕩2 h，靜置24 h 分層，精密量取下層水溶液0.1 mL，加入pH 為7.4 的磷酸緩沖鹽溶液稀釋至50 mL，按照“2.1.1”項下條件進樣，用HPLC 法測定水相中PF 含量，根據下列公式進行計算，PF 在pH 為7.4 的磷酸鹽緩沖溶液中的油水分配系數LogP=-0.59。

Co 為PF 在油相（即正辛醇）中的濃度，Cw 為PF 在水相中的濃度。

2.3 PF 體外經皮滲透實驗

2.3.1 離體大鼠皮膚處理 取健康SD 雄性大鼠，剔除腹部皮膚絨毛，以10%水合氯醛（0.8 mL/只）麻醉大鼠，使用剪刀小心剝離腹部皮膚，并用刀片剔除皮膚組織及脂肪，過程中不得破損皮膚。用生理鹽水反復沖洗后，平鋪于鋁箔紙上，包好，置于-20 ℃冰箱保存備用。存放不得超過7 d，實驗時室溫下自然解凍。

2.3.2 含不同促滲劑PF 凝膠劑的制備 稱取0.4 g卡波姆940 于100 mL 燒杯中，加入適量去離子水，使用磁力攪拌器攪拌均勻，溶脹過夜后加入處方量的PF 原料藥，加入甘油10 g，分別加入不含和含有促滲劑薄荷油（3%、5%、7%、9%）、油酸（2%、3%、4%）、氮酮（3%、4%、5%）、桉葉油（3%、4%、5%），攪拌均勻，加入去離子水至100 g，加入處方量的羥苯乙酯，攪拌，加入處方量的三乙醇胺，充分攪拌均勻，離心（4 000 r/min，10 min，離心半徑16.8 cm），去除氣泡即得。

2.3.3 經皮滲透動力學方程及其動力學參數考察 使用改良后的Franz 垂直擴散池，擴散池分為供給池和接收池兩個部分，接收池體積為8 mL，擴散池有效透皮面積為3.14 cm2。分別取1.0 g 凝膠于透皮擴散池供給池上，使之與大鼠皮膚充分接觸。接受池中注入pH 為7.4 的磷酸緩沖鹽溶液8 mL，排空氣泡，將透皮擴散儀水浴溫度控制在（37±1）℃，磁力攪拌（500 r/min）。分別于給予凝膠后1、2、4、6、8、10、12 h 從接收池中取2.0 mL 接收液，同時補充等體積相同溫度的空白接收介質，將取出的接收液離心（13 000 r/min，10 min，離心半徑16.8 cm），過水系0.22 μm 微孔濾膜，取續濾液按“2.1.1”項色譜條件進樣，測定并計算各時間點接收液中藥物的濃度（Cn）、單位面積藥物累積透皮量（Qn）和藥物累積透皮率（Fn）。按照如下公式進行計算：

其中Cn、Ci為第n 個和第i 個取樣點測得的藥物濃度，V0為接收池中接收液的體積，Vi為每次取樣的體積，A為有效透皮面積，Q總為供給池凝膠中的PF 總含量，Ps 為表觀滲透系數。以單位時間（t）對Qn作圖，可得到藥物累積釋放曲線，進行線性回歸得到擬合方程，其斜率即為穩態透皮速率（Js）。

2.4 不同促滲劑對PF 透皮吸收的影響 本研究使用不同比例的薄荷油、油酸、氮酮和桉葉油作為促滲劑，以12 h 時的Q值、Js、Ps 及增滲比為考察指標，結果見表1。

表1 不同促滲劑在不同濃度下的經皮滲透動力學方程及其動力學參數

由表1 可知，PF 的經皮滲透動力學符合零級動力學方程，不同時刻累積滲透量與時間具有良好的線性關系。統計學處理方面，以Js 為考察指標，進行t檢驗。圖2 為采用4 種不同促滲劑時PF 凝膠的藥物累積滲透曲線。圖2A 可以看出，薄荷油由低濃度3%到7%時，PF 累積透過量呈增加趨勢，當在7%濃度時，12 h 的PF 經皮累積透過量達到最高值，當薄荷油濃度繼續增加到9%時，PF 12 h 累積透過量降低，說明薄荷油作為促滲劑具有一個最佳濃度，比此濃度高或低的促滲劑促滲作用不理想，甚至會對PF 的經皮滲透產生抑制作用。與空白促滲劑比較，差異具有統計學意義的是5%薄荷油與7%薄荷油（P＜0.01），分別使PF 經皮速率提高至1.63、1.95倍。在7%薄荷油作用下，PF 6 h 累積透過率為60.50%，12 h 累積透過率為81.20%；而未添加促滲劑時，PF 6 h 累積透過率為13.70%，12 h 累積透過率為33.80%，即7%薄荷油可以提高PF 累積透過率。通過圖2B 及圖2D 可以看出，當分別提高油酸和桉葉油濃度時，PF 累積透過量均是先升高后降低，但只有3%油酸及4%桉葉油對PF 具有促滲作用，與空白促滲劑比較，這兩種促滲劑透皮速率的差異具有統計學意義（P＜0.05），分別使PF 經皮速率提高至1.19、1.20 倍。圖2C 考察氮酮最常用的促滲濃度，未發現其對PF 具有促滲作用。通過表1 可知，這幾種促滲劑對PF 促滲作用依次為7%薄荷油＞5%薄荷油＞4%桉葉油＞3%油酸。

圖2 不同促滲劑中PF 累積透過曲線圖

3 討論

一般來講，藥物的溶解度、油水分配系數、相對分子質量等對其經皮吸收能力起決定性作用，由“2.2.1”及“2.2.2”項下的考察結果可知，PF 在pH為7.4 的磷酸緩沖鹽溶液中的溶解度為（118.00±0.48）mg/mL，表明PF 是一種強水溶性藥物，過高的水溶性藥物或脂溶性藥物均不利于制成外用制劑。通常logP值范圍在2～3 的藥物具有較好的經皮滲透效果[14]，PF 的logP值為-0.59，數值較小，PF 相對分子質量為480.462，分子質量小于500，有利于通過皮膚障礙，但由于logP值較小，與皮膚的相容性較差，導致其不易透過角質層。因此篩選合適的促滲劑，提高PF 累積透過量，增加藥物吸收率顯得尤為重要。

本實驗通過查閱相關文獻[15-17]，選擇對薄荷油、桉葉油、油酸及氮酮4 種常用促滲劑進行考察。參照文獻，桉葉油、油酸和氮酮促滲劑常用質量分數為1%～5%，本實驗主要選取這一范圍進行考察。

透皮結果發現，與空白促滲劑比較，在4%桉葉油及3%油酸作用下，這兩種促滲劑均有促滲效果，透皮速率提高（P＜0.05），在其他質量分數下呈現抑制作用。桉葉油對水溶性藥物及脂溶性藥物均具有促進滲透作用，機制可能為桉葉油作用于皮膚類脂間質，使其結構遭到破壞，通透性增加，從而促進藥物的透皮吸收[18]。油酸在低濃度時對水溶性藥物具有促進滲透作用[19]，機制可能是其對皮膚的整個角質層中的脂質作用，使脂質流動性增強，減少藥物透過時的阻力[20]。氮酮作為最常用的促滲劑，一般促滲效果較好，本實驗中未發現氮酮對PF 的經皮產生促滲作用，3 種質量分數的氮酮均對PF 表現出抑制作用（增滲比＜1），可能是因為提高氮酮質量分數會增加凝膠的黏稠性，因此呈現出抑制作用。既往研究結果表明，薄荷油對水溶性藥物具有較好的促滲透作用[21-23]，且薄荷油濃度較高時，促滲效果較強，這與本實驗結果一致。當薄荷油濃度為5%時，透皮速率提高（P＜0.01）；當薄荷油濃度為7%時，促滲效果最強。但當濃度繼續增加時，反而不利于PF滲透。薄荷油的促滲機制可能是通過破壞角質層間質，從而引起細胞間隙增加，降低了PF 通過角質層的阻力[24]。

本研究最終選擇7%薄荷油作為PF 凝膠促滲劑，可為治療類風濕性關節炎開發新藥提供依據。