菠菜根尖細胞有絲分裂同步化誘導

曹瑩

摘 要：本研究以菠菜（Spinacia oleracea L.）根尖分生組織為材料，采用羥基脲（HU）和甲基胺草磷（APM）結合的雙阻斷法對菠菜根尖細胞進行處理，結合顯微鏡觀察和統計學分析結果，對有絲分裂中期同步化誘導作了探討，并對中期染色體分離也作了初步研究。在試驗中分別設置了羥基脲（HU）和甲基胺草磷（APM）的不同濃度梯度，并對甲基胺草磷（APM）設置了作用時間梯度，以研究其最佳同步化誘導效果。結果表明，經1.25 mmol/L HU、10 μmol/L APM處理菠菜根尖細胞，能夠使細胞有絲分裂中期指數（Met．I）達40％。

關鍵詞：同步化；中期指數；羥基脲；甲基胺草磷；菠菜

文章編號：1005-2690（2023）18-0001-03? ? ? ?中國圖書分類號：S636.1? ? ? ?文獻標志碼：B

植物細胞的同步化誘導是指細胞分裂周期受到低溫或藥物處理的干擾，使大多數細胞停留在同一分裂階段（通常是中期）[1]。人工誘導同步化主要有2種方法。一是DNA合成阻斷法。采用一定量的低毒或無毒的特異性DNA合成抑制劑（通常是TdR或羥基脲）加入培養液，培養一定時間（TG2+TM+TG1）后，使細胞停留于S期，且不影響處于其他時相的細胞進行周期的運轉。抑制劑去除后，細胞就可進行同步化運轉[2]。二是分裂中期阻斷法。細胞分裂中期，大量微管參與形成細胞分裂器——紡錘體，從而保證細胞分裂過程的完成。此時以藥物抑制微管形成紡錘體，則可以將運轉中的細胞阻斷于分裂中期。

高等植物細胞有絲分裂同步化誘導獲得的細胞群體中，獲得大量分裂時期一致的細胞，便于后續對細胞周期調控、染色體形態分析、染色體顯微解剖和性別決定機制的研究。由于植物細胞壁結構的性質，早期以懸浮細胞系為材料，誘導植物細胞有絲分裂過程中的中期染色體分離同步化的研究進展十分緩慢。目前，對春小麥、鳳仙、大麥和蠶豆根尖分生組織細胞同步化誘導的研究已被證明是有效的[3-6]，利用玉米細胞系的有絲分裂同步誘導和染色體分離方法也顯示有效[7]。

本研究中所采用的植物材料——菠菜，又名波斯菜、赤根菜等，為藜科菠菜屬1年生或2年生草本植物，四季均可播種，以春播和秋播為主，生長期約為60 d。菠菜原產于波斯（現伊朗），唐代傳入我國，栽培歷史悠久。菠菜主根發達，肉質根紅色，味甜可食。菠菜是研究雌雄異株的模式植物之一，研究主要集中于細胞學、生理生化和分子標記上。菠菜處于性染色體演化的第2階段，具有絕對雄株、營養雄株、絕對雌株、雌雄同株、雄全同株、雌全同株和三性同株等多種不同的性別表現類型[8-9]。本研究所進行的同步化誘導研究，可以從形態學上將不同性別表現類型的菠菜進行染色體對比，為后續菠菜性別分化的相關研究奠定基礎。

本試驗以菠菜根尖為材料，采用羥基脲和甲基胺草磷雙阻斷法處理菠菜根尖，對菠菜根尖分生組織進行有絲分裂中期高頻同步化誘導實驗，以準確識別菠菜體細胞中染色體的形態、數量和分布，為后續染色體分析、性別決定分析和性別決定基因研究提供技術基礎。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 植物材料

菠菜種子購自種子公司。

1.1.2 試驗試劑

羥基脲溶液：用蒸餾水稀釋到不同濃度，分別是1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L。

甲基胺草磷溶液：用蒸餾水稀釋到不同濃度，分別是2.5、5.0、10.0 μmol/L。

卡諾氏固定液：無水乙醇和冰乙酸以3∶1比例配制。

1 mol/L HCl：37％濃鹽酸82.5 mL（比例是1.19 g/mL）用蒸餾水定容至1 000 mL。

酸解液：HCl 1mol/L與45％乙酸以3∶1比例配制。

羥基脲：粉末于18～25 ℃條件下保存，遇熱易分解，使用時配母液于4 ℃保存，保存時間不宜超過15 d。

甲基胺草磷：試劑有一定毒性，且溶解性較小，配制試劑時應注意，可用磁力攪拌器促進其溶解。

1.1.3 試驗器材

主要儀器：光學顯微鏡、磁力攪拌器、LRH-70生化培養箱、顯微鏡、水浴鍋、低溫冰箱、量筒、燒杯等。

1.2 試驗過程

1.2.1 細胞有絲分裂中期同步化誘導

浸種：取菠菜種子100～200粒于培養箱23～25 ℃恒溫浸泡菠菜種子24 h，吸水后放于4 ℃冰箱變溫處理24 h。

萌發：在干凈的培養皿中鋪上2～3層浸透了雙蒸水的濾紙，將處理過的種子均勻分布在培養皿中，然后放入24 ℃的恒溫箱中。

雙阻斷法藥物處理：準備經1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L HU浸泡雙層濾紙培養皿，選取根尖長度約1.5 cm的種子，轉移到培養皿中孵育18 h，用雙蒸水沖洗3～4次，再轉移到雙蒸水浸泡濾紙培養皿中孵育約3 h，轉移至鋪有雙層分別用0.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L APM浸濕濾紙的培養皿中培養3～6 h，蒸餾水沖洗3次，同步化處理根尖進行過夜固定，4 ℃儲存備用[10-11]。

在試驗中每次改變試劑培養前先用該試劑浸泡種子1 min，培養過程均在黑暗條件下進行。

1.2.2 中期分裂相觀察與統計

將固定根尖置于酸解液中（60±1）℃下酸解15～20 min，壓制細胞后，用改良品紅染色，用光學顯微鏡觀察，并測定其有絲分裂指數（Met．I）。制片時，切取每條去除根冠的根1 mm左右，即分生組織所在區域，進行制片（常制1～2張片子，大多數為1張片子），用光學顯微鏡進行觀察（詳見圖1）。觀察并統計細胞（整片）數時，移動載玻片和鏡頭，同時拍照計數。

2 試驗結果

本研究用HU和APM雙阻斷法來誘導菠菜根尖細胞的有絲分裂中期同步化。在試驗過程中，通過調整HU、APM的處理濃度、水培和時間等同步化條件，獲得了較高頻率的同步化細胞。

結果表明，當在23 ℃下用1.25 mmol/L HU處理18 h，室溫下10 μmol/L APM處理4 h，可得到較為理想的結果，其有絲分裂中期指數（Met．I）可達40％（如圖2所示）。

用HU處理分裂期細胞，可有效阻斷DNA合成過程，在除去HU作用后，又可以迅速恢復DNA合成過程，以達到初步同步化的目的[12-13]。同時，由于APM是一種直接與細胞內微管蛋白合成相互作用的特異性藥物，可以成功阻斷中期細胞紡錘絲的發育，使有絲分裂過程保持在中期[14]。本研究在利用HU和APM對菠菜根尖分生組織細胞進行雙阻斷后，除少數處于分裂間期的細胞外，沒有發現處于分裂前期、后期或末期的細胞，表明細胞的分裂過程已被成功阻斷在分裂中期，有絲分裂正常，染色體無畸變（如圖3和圖4）。由此可知，利用HU-APM雙阻斷法可有效將菠菜根尖分生組織細胞阻斷在中期[15-16]。

3 討論和結論

動物能夠相對容易地成功分離和純化中期染色體，而在植物中，由于細胞壁結構堅韌，細胞很難去體積和溶解，去體積后留下大量細胞碎片，使染色體的進一步純化更加困難，因此進展緩慢。HU和秋水仙堿以前被用于誘導植物細胞有絲分裂同步，但一些研究表明，用于誘導有絲分裂同步的秋水仙堿濃度過高，導致顯著的染色體凝集，從而使染色體的形態結構研究變得困難，而且Met．I的比值也偏低。因此，諸多研究者采用APM來替代秋水仙堿。

分裂中期阻斷法的優點在于操作簡便、效率高，缺點是藥物毒性較大，如果處理時間過長，獲得的細胞常常不能恢復成正常細胞進行周期運轉。在同步化誘導的過程中，較有效的做法是幾種方法并用（如低溫、TdR、nocodazole等綜合處理），可獲得數量多、同步化效率高的細胞群。

本研究采用的分離中期染色體的方法是采用1.25 mmol/L HU和10 μmol/L APM的雙阻斷誘導菠菜根尖細胞有絲分裂中期同步化的方法，將菠菜根尖有絲分裂中期細胞去壁，并進一步裂解細胞使其釋放染色體。在光鏡下，觀察到用HU-APM雙阻斷法同步化的菠菜根尖的染色體樣品中，可看到大量中期細胞，且細胞碎片較少，同步化效果較好，且獲得的中期細胞染色體形態清晰完整，便于今后對不同性別類型的菠菜染色體進行形態學分析，進而對菠菜的Y染色體進行特異性鎖定分析、染色體顯微切割技術研討、單條染色體基因文庫的構建等，同時，也為后續對菠菜性別決定分子遺傳學的研究提供了研究基礎。

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（編輯：郭志陽）