實時熒光定量PCR技術在肉及肉制品中的運用

張麗華

（赤峰工業職業技術學院，內蒙古自治區 赤峰 024000）

肉及肉制品在加工、儲存、運輸等環節都有可能被致病細菌或微生物污染。為切實保障消費者的健康安全，相關部門需要對肉及肉制品取樣檢測，以判斷致病細菌和微生物的數量是否超過了相關標準的規定數值，如果檢測結果發現致病細菌或微生物的數量超標，則不允許肉及肉制品進行銷售。目前常用的細菌培養法、血清學鑒定法等檢測方法，雖然也能檢測出樣品中致病細菌和微生物的數量，但是存在精度不夠高、花費時間多等弊端。相比之下，實時熒光定量PCR技術則可以快速、準確地完成肉及肉制品中致病細菌和微生物的測定。例如，有學者使用TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR技術，直接從樣品中檢測呼吸道纖毛桿菌的DNA，檢測用時僅為30 min。文章就實時熒光定量PCR技術在肉及肉制品中的運用展開了試驗分析。

1 實時熒光定量PCR技術原理

實時熒光定量PCR技術是將能夠發出熒光信號的熒光基因，加入到PCR反應體系中，然后通過熒光信號的積累實現對PCR過程的動態監測，最后繪制標準曲線對未知模板展開定量分析。根據選用熒光材料的不同，具體又可以分為熒光染料和熒光探針等多種類型。這里以TaqMan探針實時熒光定量PCR技術為例，簡要概述其原理。TaqMan探針實際上是單鏈DNA的一個片段，含有一個報告基因和一個猝滅基因。其中，報告基團位于TaqMan探針的5′端，猝滅基因則位于TaqMan探針的3′端。在PCR擴增環節，Taq酶作為一種DNA聚合酶，在具備較強活性的情況下，能夠讓脫氧核苷酸聚合形成脫氧核苷酸鏈。在這一過程中，3′→5′外切酶活性將熒光探針降解，位于探針上的報告基團也隨即變成游離基團，并發出熒光信號。此時，熒光檢測系統可以接收并積累熒光信號。根據熒光信號即可完成對特定物質的實時監測。

在肉及肉制品的成分檢測中，研究人員通常選用線粒體D-loop區的622～704片段中的DNA鏈制作TaqMan探針。這時因為線粒體基因具有含量多、分裂快、靈敏度高等特點，使用這種TaqMan探針可以精確測定加工肉制品中豬肉的含量，根據檢測結果可以判定是否存在豬肉摻假的情況。例如，有研究人員以超市售賣的羊肉丸作為樣品，使用TaqMan探針對線粒體中的Cytb進行檢測，檢測出樣品中豬肉含量為0.01%，說明不存在用豬肉仿冒羊肉的情況。

2 實時熒光定量PCR技術在肉及肉制品污染物檢測中的應用

2.1 材料與方法

2.1.1 樣品來源

本次試驗從農貿市場、連鎖超市選取83份肉及肉制品樣品，其中：牲畜類（包括生豬肉、生牛肉、生羊肉3種）樣品共36份，家禽類樣品共20份，鮮凍水產品15份，熟肉制品10份。

2.1.2 試驗儀器與試劑

本次試驗使用到的主要儀器為MX3000P型實時熒光PCR檢測儀，FS-200型高速離心機。可用于檢測多種常見細菌（如沙門菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌等）的Real-time Q-PCR檢測試劑盒，以及顯色培養基、SS平板。

2.1.3 檢測方法

為了驗證實時熒光定量PCR技術在肉及肉制品污染物檢測中的應用效果，文章設計了對照試驗。對照組采用細菌培養法，測定樣品中沙門菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌這4類細菌的數量。這里以沙門菌為例，培養方法為：將低溫保存的菌種放到室溫下進行解凍，在解凍期間將準備好的樣品放入高營養、無選擇性的培養基中。將解凍后的菌種放入培養基，使環境溫度升高至37 ℃，提供一個有利于沙門菌復蘇與生長的理想環境。然后開始增菌操作，將菌種分別轉移到各自適宜的培養平板上進行增殖。設定增殖時間為24 h，之后對增殖的菌種做分純處理，保證沙門菌的純度。再將分純后的細菌用生理鹽水制備成菌懸液，以備鑒定使用。其他污染物的鑒定分別參照《食品衛生微生物學檢驗》（GB/T4789.10-2008）中的有關規定進行，不再贅述。

實時熒光定量PCR技術的檢測方法如下：

（1）核酸提取。用膠頭滴管吸取2.0 ml的樣本增菌液，置于5 ml的滅菌EPP管中。將EPP管放入高速離心機，設定轉速為12 500 r/min，離心時間為90 s，使樣本增菌液充分振蕩均勻。然后吸取并去掉上層清液，只保留底部沉淀。向沉淀中加入180 μl的DNA提取液，重新放入高速離心機，按照同樣的參數進行處理。將混合均勻的混合物放入100℃的沸水中水浴10 min，最后置于高速離心機中，以12 500 r/min的轉速處理5 min，之后吸取10 μl的上層清液，做PCR反應。

（2）PCR反應。使用實時熒光PCR檢測儀進行PCR擴增檢測。參照Real-time Q-PCR檢測試劑盒說明書的內容，制作進行PCR反應所需的混合液，并設置循環參數。分別設定了陽性和隱性梯度模板，作為對照。

（3）特異性檢測。將臨床分離鑒定的沙門菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌和副溶血性弧菌，各取5株作為檢測標準，分析實時熒光PCR試劑盒的特異性。

（4）參考試劑盒說明書，將陽性菌種進行10倍梯度稀釋，與樣本進行PCR擴增。將未進行稀釋的陰性菌種以平板培養法進行擴增，兩者進行對照。同時觀測試劑盒的靈敏度。

2.2 肉及肉制品污染物的檢測結果

2.2.1 細菌培養法檢測結果

在83份肉及肉制品的樣品中，共檢測出6株沙門菌，陽性率為7.23%；檢測出5株金黃色葡萄球菌，陽性率為6.02%；檢測出2株副溶血性弧菌，陽性率為2.41%；未檢測到空腸彎曲菌。

2.2.2 實時熒光定量PCR檢測結果

在83份肉及肉制品的樣品中，共檢測出17株沙門菌，陽性率為20.48%；檢測出11株金黃色葡萄球菌，陽性率為13.25%；檢測出8株副溶血性弧菌，陽性率為9.64%；檢測到3株空腸彎曲菌，陽性率為3.61%。

2.2.3 PCR的特異性與靈敏度

使用Real-time Q-PCR檢測試劑盒對臨床分離的4種細菌（各5株）進行檢測，結果顯示特異性均為100%，沒有出現假陽性或假陰性。說明本次試驗所用的Real-time Q-PCR檢測試劑盒具有良好的特異性，檢測結果可靠。使用實時熒光定量PCR技術對10倍梯度稀釋的陽性菌種進行檢測，結果顯示最低可檢測到100 copoes/ml濃度的核酸樣本，其檢測靈敏度遠遠高于常規的細菌培養法。

2.3 檢測結果分析

對比細菌培養法和實時熒光定量PCR技術的檢測結果可以發現，后者的檢測精度更高。以沙門菌為例，在肉及肉制品的樣品數量相同的情況下，使用細菌培養法僅檢測到6株沙門菌，陽性率為7.23%；而使用實時熒光定量PCR檢測，發現了17株沙門菌，陽性率為20.48%，檢測精度提高了將近3倍。另外，使用常規的細菌培養法，未能從肉及肉制品的樣品中檢測出空腸彎曲菌；而使用實時熒光定量PCR則檢測到3株空腸彎曲菌。

另外，在本次實時熒光定量PCR檢測試驗中，每一種肉及肉制品都發現了沙門菌。其中，牲畜類樣品中檢測到沙門菌8株，家禽類樣品中檢測到沙門菌5株，鮮凍水產品中檢測到沙門菌3株，熟肉制品中檢測到沙門菌1株。另外，金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的檢出率也比較高，這也在一定程度上表明本地肉及肉制品的細菌和微生物污染問題比較嚴重，容易發生消費者食物中毒事件。基于此，有必要推廣使用實時熒光定量PCR技術，快速、準確地檢測出肉及肉制品中治病細菌和微生物的濃度，及時處理被污染的肉及肉制品，從而有效預防食源性疾病的發生。

3 討論

3.1 實時熒光定量PCR技術的應用優勢

肉及肉制品在加工、儲藏、運輸、銷售等環節，都有可能受到細菌、微生物的污染。當細菌、微生物的數量達到一定程度后，即可對食用者的健康安全構成威脅。為確保食品安全，需要對肉及肉制品的污染物進行檢測。常規的檢測方法是細菌培養法，其操作流程包括前增菌、選擇性培養基再次增菌、平板培養、菌落分離物檢測等多個環節。應用細菌培養法進行肉及肉制品的污染物檢測，不僅操作較為繁瑣，而且需要3～5 d才能得出檢測結果。這種情況下檢測結果中的污染物數量，與當前肉及肉制品上污染物的數量存在明顯差異，因此檢測結果的參考價值不高。除此之外，由于操作過程中很難做到全程無菌，結果假陽性的情況也比較常見。

相比之下，文章所述的實時熒光定量PCR技術在肉及肉制品污染物檢測中則表現出明顯的應用優勢，主要表現為以下幾點：其一，操作流程相對簡便。如上所述，基于實時熒光定量PCR技術的污染物檢測只需要核酸提取、PCR反應、特異性檢測等幾個步驟，操作十分簡單；其二，使用專門的Real-time Q-PCR檢測試劑盒可以快速得出沙門菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等常見細菌的濃度，并且試驗結果表明檢測結果的靈敏度可以得到100 copoes/ml，完全能夠滿足日常肉及肉制品污染物檢測的要求；其三，檢測周期短，一般只需要3～5 h即可得出檢測結果。近幾年，隨著分子信標技術的成熟發展，使得PCR技術檢測污染物的效率也得到了進一步的提升。在整個檢測過程中，除了增菌后需要1～2 h左右的前處理，以及1 h左右的結果分析外，試驗中的其他操作只需要幾分鐘或十幾分鐘就可以完成。這樣一來，就可以保證檢測結果具有更高的可信度，為肉及肉制品的處理提供了數據支持和科學依據。目前，實時熒光定量PCR技術已經成為快速檢測肉類、蔬菜類食品中致病細菌和微生物的一種常用檢測技術。

3.2 應用實時熒光定量PCR技術的注意事項

從整體上來看，實時熒光定量PCR技術因為具有靈敏度高、特異性好、操作簡便等優點，在真假肉制品的鑒定，以及肉及肉制品治病微生物的檢測等方面得到了廣泛應用。但是要想真正發揮這一技術的應用優勢，還必須注意以下幾點：

首先，肉及肉制品的前處理是一道不能忽視的重要步驟。根據實時熒光定量PCR技術的檢測原理可知，在檢測樣品中所有治病細菌和微生物時，無法準確區分死菌和活菌。如果將死菌也計算在內，可能會導致實際檢測出的治病細菌和微生物的數量，要高于真實情況，從而導致檢測靈敏度下降。通過開展肉及肉制品的前處理（如離心振蕩、提取上清液等），可以有效去除樣本中的死菌，從而使最終的檢測結果有更高的靈敏度。

其次，必須選用正確的Real-time Q-PCR檢測試劑盒，才能保證檢測結果有良好的特異性。Realtime Q-PCR檢測試劑盒具有很強的單一性，即每一種試劑盒只能檢測出特定的某種細菌或微生物。例如，使用沙門菌核酸Real-time Q-PCR檢測試劑盒，只能檢測出肉及肉制品中含有的沙門菌的數量；使用金黃色葡萄球菌核酸Real-time Q-PCR檢測試劑盒，只能檢測出肉及肉制品中含有的黃色葡萄球菌的數量。文章主要針對肉及肉制品中的沙門菌、黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌和副溶血性弧菌4種致病細菌進行檢測，因此需要準備4種相應的試劑盒。

最后，需要保證酶有較強的活性，才能提高檢測結果的精確性。熒光探針雖然具有較強的靈敏性和特異性，但是探針的水解十分依賴酶的活性，兩者之間為正相關。在應用實時熒光定量PCR技術時，需要選擇活性較高的酶，保證熒光探針的水解更加充分、徹底，這樣才能以更快的速度，得到更加精確的檢測結果。

4 結語

在肉及肉制品的污染物檢測中，相比于常規的細菌培養法、血清學鑒定法，實時熒光定量PCR技術無論是在靈敏度、特異性，還是檢測用時或操作要求上，均表現出明顯的優勢。檢測人員除了要熟悉操作步驟，還要做好樣品的前處理，以及保證酶活性，才能讓檢測結果更加可靠、可行，從而切實保障肉及肉制品的食用安全。