復合菌群強化修復石油-氯酚污染土壤

李 婧，于鈞瀧，趙曉東，左 帥，劉其友，張秀霞，2

(1.中國石油大學(華東) 化學化工學院，山東 青島 266580；2.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室，北京 102206)

作業年限較長的油田井場或石化污染場地不僅石油烴污染嚴重，有機氯化合物也大量存在[1]，原油中天然存在的有機氯化物含量一般較少[2]，但在采油、煉油過程中因含氯化學助劑的使用，使得原油有機氯含量變高[3]。裴芳等[4]對某煉油廠退役場地監測結果表明，該場地石油和氯苯酚類物質污染嚴重，主要分布在儲油罐所在地；葛鋒等[5]調查分析了東北4個石化工業基地，主要污染物有總石油烴(TPHs)、多環芳烴(PAHs)、氯代烴等。由于石油烴和有機氯化合物的復雜性、持久性和致癌、致畸、致突變的“三致”效應，若不及時加以處理，環境問題便隨之而來，甚至會造成胎兒致畸、人類致癌、生物中毒等危害[6]。因此，需要采取合適的方法解決石油烴和有機氯化合物復合污染問題。

石油烴和有機氯化合物復合污染的去除方法有物理法、化學法和生物法[7-8]。物理修復法和化學修復法可在短時間內有效去除污染物，但往往需要較高的能源消耗和設備成本。生物法因成本低及環境友好的特點，被譽為最具有發展前景的修復技術之一。由于石油烴和有機氯化合物復合污染對功能微生物具有較強的毒性或抑制性，單一降解菌的降解能力往往比微生物聯合體要弱，污染物的降解需要多種酶和微生物的參與來完成，且不同微生物對石油烴和有機氯化合物各組分耐受性存在一定差異[9-10]。因此，構建復合菌群不僅可在復雜環境中提高微生物的降解能力，也可使微生物通過“分工協作”增強降解底物的廣譜性[11]。已有研究者開展了相關復合菌群的效果研究，Steliga等[12]構建了復合物菌群M1，通過生物強化作用可在6個月時間內對多氯聯苯實現降解率84.5%，石油烴的降解率可達到70.8%；黃霞[13]分離的微生物菌群可有效降解石油烴和氯代烴等有機混合污染物；Zhao等[14]研究表明，復合菌群中微生物的協同作用可以增強菌群的穩定性和耐受性。基于上述研究，構建微生物復合菌群修復石油-氯酚污染場地這一科學問題取得一定進展，尚需進一步探究。

筆者選取氯酚類化合物2，4-二氯苯酚與石油構建復合污染體系，以實驗室篩選的石油烴降解菌和有機氯降解菌作為實驗菌株構建復合菌群，強化修復石油-氯酚模擬污染土壤，考察修復過程中不同菌群對土壤石油及2，4-二氯苯酚降解率、微生物總數、脫氫酶活性和土壤群落結構的影響，為石油-氯酚復合污染場地的修復提供理論支持。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

菌株：實驗所用石油烴降解菌S4(糞產堿菌，AlcaligenesfaecailsY5)和S5(芽孢桿菌，Bacillussp.7614)是以某油田污染土壤為菌源、勝利原油為唯一碳源篩選馴化所得土著菌，菌株S4和S5在原油質量濃度為2 g/L的無機鹽原油培養基中，對石油烴的7 d降解率分別為26.46%和37.54%；有機氯降解菌L3(馬氏芽孢桿菌，Bacillusmarisflavistrain BCB4-1)和L4(水芽孢桿菌，BacillusaquimarisT 172)是以某污水處理廠二沉池活性污泥為菌源、2，4-二氯苯酚為唯一碳源篩選馴化所得，菌株L3、L4在2，4-二氯苯酚質量濃度為50 m g/L的無機鹽培養基中，對2，4-二氯苯酚7 d的降解率分別達到68.63%、71.84%。菌株S4和S5按體積比3∶2構建石油烴降解菌群，菌株L3和L4按體積比為3∶2構建有機氯降解菌群，S4、S5、L3和L4按體積比1∶2∶2∶1構建復合菌群。

培養基：牛肉膏蛋白胨培養基(1 L)成分為牛肉浸膏5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g，固體培養基添加15.0 g瓊脂粉；孟加拉紅培養基(36.6 g/L)，購自國藥集團化學試劑有限公司；pH值調至7.0～7.3，在1×105Pa、121 ℃條件下滅菌20 min。

胰蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂粉、氯化鈉、石油醚(60～90 ℃)、石油醚(30～60 ℃)、正己烷、磷酸二氫鉀、硝酸鈉，均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、2，4-二氯苯酚(質量分數98%)，均為色譜純，購自上海麥克林生化科技有限公司。原油來自勝利油田某采油廠，密度(20 ℃)為891 kg/cm3，運動黏度(50 ℃)為31.05 mm2/s。供試土壤，取自校園內綠植土壤，取樣后去除動植物殘體并在自然環境下風干，經破碎研磨，過2 mm篩后備用，主要性質見表1。

1.2 模擬污染土壤的制備

根據油田污染井場實際情況，設置模擬污染土壤中石油烴質量分數為10 g/kg，2，4-二氯苯酚質量分數為500 g/kg。將原油和石油醚(30～60 ℃)按照體積比1∶4進行混合，然后按石油烴質量分數10 g/kg均勻摻入供試土壤中，自然風干7 d至石油醚揮發完全；然后用磷酸二氫鉀和硝酸鈉調節土壤中元素C、N、P的質量比為100∶10∶1[15]得到含油土壤樣品。配制質量濃度為4 g/L的2，4-二氯苯酚儲備液，按2，4-二氯苯酚質量分數0.5 g/kg均勻摻入含油土壤樣品中，置于通風櫥中老化平衡2 d后得到石油-2，4-二氯苯酚復合污染土壤樣品，即為模擬污染土壤樣品。

1.3 模擬污染土壤修復實驗

將500 g模擬污染土壤樣品平均分成4份置于花盆中，4個花盆對應土壤的4種修復方式：①自然修復(A)；②石油烴降解菌S4、S5修復(B)；③有機氯降解菌L3和L4修復(C)；④石油與有機氯降解菌S4、S5、L3、L4修復(D)。每種處理方式下菌液均按照質量分數10%的接種量接種于花盆土壤。在溫度35 ℃、修復時間130 d的條件下進行模擬污染土壤修復實驗，修復過程中調節土壤含水質量分數15%～20%，每7 d翻土一次并進行采樣分析。在石油-氯酚模擬污染土壤修復過程中的第7、14、28、42、56、70、98、130 d取樣，分別測定修復土壤樣品中的石油烴含量、2，4-二氯苯酚含量、微生物總數以及土壤脫氫酶活性，并對以上4種修復方式在不同時間內對土壤微生物群落結構的影響進行了檢測。

模擬污染土壤的石油烴降解率(η1，%)按式(1)進行計算。

(1)

式(1)中：ws，0為模擬污染土壤中石油烴質量分數，mg/kg；ws，t為模擬污染土壤經過不同時間t修復后土壤中石油烴的質量分數，mg/kg。

模擬污染土壤的2，4-二氯苯酚降解率(η2，%)按式(2)進行計算。

(2)

式(2)中：wd，0為模擬污染土壤中2，4-二氯苯酚質量分數，mg/kg；wd，t為模擬污染土壤經過不同時間t修復后土壤中2，4-二氯苯酚質量分數，mg/kg。

1.4 高通量實驗

取模擬污染土壤經過4種修復方式(A、B、C、D)處理修復7 d(修復平衡的第一周)后的土壤樣品作為初始樣品，分別記作A1、B1、C1、D1，修復130 d后的土壤樣品記作A2、B2、C2、D2，委托上海美吉生物醫藥有限公司對土壤樣品進行高通量測序，對土壤修復過程中微生物群落結構變化分析進行補充[16]。高通量測序方法流程：利用土壤DNA提取試劑盒提取土壤樣品的總DNA，然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性與純度，放入-20 ℃冰箱備用，利用V3-V4區的通用引物進行第一輪PCR擴增和產物純化，接著對PCR產物定量與均一化，然后構建PE文庫，最終進行Illumina測序。

1.5 土壤樣品分析方法

采用上海元析儀器公司生產的UV-6000P型紫外可見分光光度計，利用超聲萃取-紫外分光光度法測定土壤樣品中石油含量[17]。采用《土壤和沉積物石油烴(C10～C40)的測定——氣相色譜法》(HJ 1021—2019)對土壤石油烴(C10～C40)組分進行定性分析，選用索式提取法進行提取，經濃縮、凈化后測試，使用安捷倫科技有限公司生產的7890B-5977C型氣相色譜儀進行檢測，氣相色譜測試條件：載氣為高純氦氣，流量1.0 mL/min，進樣口溫度320 ℃，進樣量1.0 μL，進樣方式為分流進樣，分流比10∶1，HP-5MS色譜柱，程序升溫，初始溫度60 ℃，保留2 min，以15 ℃/min升至320 ℃，保留2 min。采用高效液相色譜法測定2，4-二氯苯酚濃度，土壤中2，4-二氯苯酚用甲醇提取[18]，使用日本島津公司生產的LC-20A型高效液相色譜儀進行檢測，測定條件為：檢測波長284 nm，V(甲醇)∶V(純水)=50∶50，進樣量10 μL，色譜柱為Shim-pack GIST-HP C18，流速0.5 mL/min。采用稀釋涂布平板法測定土壤可培養細菌、真菌的數量[19-20]。采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)還原法測定土壤脫氫酶活性[21]。

2 結果與討論

2.1 土壤修復過程中石油烴降解率變化

采用4種修復方式(A、B、C、D)對模擬污染土壤進行修復實驗，不同修復時間下模擬污染土壤中石油烴降解率的變化結果見圖1。

A—Natural remediation；B—Petroleum hydrocarbon degrading bacteria；C—2，4-Dichlorophenol degrading bacteria；D—Petroleum hydrocarbon and 2，4-dichlorophenol degrading bacteria

由圖1可以看出，D組模擬污染土壤第130 d時的石油烴降解率達到77.68%，此時土壤樣品中石油質量分數為2353.82 mg/kg，符合第二類建設用地土壤污染風險篩選值(4500 mg/kg)的標準，比相同條件下B、C組土壤中石油烴降解率分別提高18.14和19.78百分點，這可能是石油烴降解菌群和有機氯降解菌群之間具有協同作用促進了菌群對石油烴的降解。加入的有機氯降解菌可以降解2，4-二氯苯酚，證明菌株體內含有相關的雙加氧酶、脫鹵酶及脫氫酶基因[22]。有機氯降解菌也可降解部分石油烴中含有的芳香烴，因此復合菌群擴大了不同微生物降解石油烴的范圍，多種菌混合后可實現降解能力的互補[23-24]。

2.2 土壤修復過程中石油烴組分變化

為進一步考察石油-有機氯復合菌群對土壤石油烴(C10～C40)組分強化降解作用，對4種修復方式(A、B、C、D)處理模擬污染土壤130 d后的土壤中提取出的石油烴進行氣相色譜法分析，以石油烴類峰強的高低代表石油烴的降解程度，結果見圖2。

A—Natural remediation；B—Petroleum hydrocarbon degrading bacteria；C—2，4-Dichlorophenol degrading bacteria；D—Petroleum hydrocarbon and 2，4-dichlorophenol degrading bacteria

由圖2可知，B、D組模擬污染土壤在第130 d時，石油烴中C27-所有烴類峰的強度均顯著降低，且D組土壤樣品的效果更明顯，與Schink[25]得出的石油烴中C4～C20中更易被微生物降解的結論一致，復合菌群的添加更好地利用并降解短鏈烴。而C27+烴類由于其碳鏈長、相對分子質量大等原因，使得土壤微生物對這部分烴類利用度較低[26-27]。而C組土壤中碳數烴類的峰降低幅度都比較小，表明該菌群對石油烴的降解率低，這可能是單一的有機氯降解菌具有降解底物的專一性，對石油烴不敏感所致。

2.3 修復過程中2，4-二氯苯酚降解率變化

采用4種修復方式(A、B、C、D)對模擬污染土壤進行修復實驗，不同修復時間下模擬污染土壤中2，4-二氯苯酚降解率的結果見圖3。

A—Natural remediation；B—Petroleum hydrocarbon degrading bacteria；C—2，4-Dichlorophenol degrading bacteria；D—Petroleum hydrocarbon and 2，4-dichlorophenol degrading bacteria

由圖3可知：修復時間在130 d時，A組模擬污染土壤中2，4-二氯苯酚降解率為46.74%，可見土壤中2，4-二氯苯酚揮發性較強。D組土壤中2，4-二氯苯酚降解率持續上升，在第70 d時達到100%；C組土壤中2，4-二氯苯酚的降解速率略低于D組，其降解率在第100 d時達到100%。修復過程中前60 d，C和D組土壤的降解率無統計學差異，而60 d后D組降解率繼續升高，這是由于復合菌群對土壤環境適應性更強，更利于維持2，4-二氯苯酚的穩定降解[28-30]。第130 d時，B組土壤中降解率為69.74%，測得此時2，4-二氯苯酚質量分數為150.54 mg/kg，符合第一類建設用地土壤污染風險管制值(234 mg/kg)的標準。綜上，向石油-氯酚復合污染土壤中添加復合菌群，在促進2，4-二氯苯酚降解的同時保證了菌群降解能力的穩定性。

2.4 土壤修復過程中微生物總數變化

微生物數量反映土壤微生物群落大小，是土壤生物活性的重要組成部分，微生物的增殖、選擇和競爭過程實際上就是土壤中石油烴和2，4-二氯苯酚的降解過程。在模擬污染土壤修復過程中分別對A、B、C、D組土壤樣品在第7、14、28、42、56、70、98、130 d取樣，測定這4組土壤樣品中的細菌總數和真菌總數，實驗結果見圖4。

A—Natural remediation；B—Petroleum hydrocarbon degrading bacteria；C—2，4-Dichlorophenol degrading bacteria；D—Petroleum hydrocarbon and 2，4-dichlorophenol degrading bacteria

由圖4(a)可知：在前28 d中，A組模擬污染土壤中細菌總數小幅增加，這是由于土壤中土著菌也會以石油烴和2，4-二氯苯酚作為碳源，促進了土著菌群的繁殖；D組土壤中細菌總數增長最快，其細菌總數在第28 d時達到最大值(9.2×107CFU/g soil)，表明復合菌群在石油-氯酚復合污染土壤中對環境的適應能力最強[31]。而B、C組土壤中細菌總數較少，這是由于單一種類微生物對污染物更加敏感。4組土壤中的微生物數量達到最大值后便有下降趨勢，與陳凱麗等[32]的研究結果類似，同時結合圖2中第130 d時碳數在27以上的烴類殘留量較高，表明復合菌群難以利用相對分子質量較大的污染物作為碳源，導致其生長受到抑制。因此修復130 d后，B、C、D組土壤中的細菌總數基本恢復到修復前水平。圖4(b)顯示了4組土壤中真菌總數的變化，其變化趨勢與細菌總數類似。D組土壤中真菌數量最多，其最大值為6.5×105CFU/g soil，B、C組土壤中真菌數量無統計學差異，表明向石油烴-氯酚復合污染土壤中加入復合菌群可以促進真菌的生長。有研究表明，部分真菌含有利于芳環類化合物開環的酶[33]，由此可推測真菌在修復污染土壤的過程中也發揮了作用。

2.5 土壤修復過程中土壤脫氫酶活性變化

脫氫酶可促進石油的脫氫，菌株可以通過脫氫酶作用于石油中的氫原子，使之激活并將其轉移至受氫體[34]，2，4-二氯苯酚的降解也離不開脫氫酶的催化作用。不同修復方式處理模擬污染土壤修復過程中土壤脫氫酶活性隨時間的變化結果見圖5。

A—Natural remediation；B—Petroleum hydrocarbon degrading bacteria；C—2，4-Dichlorophenol degrading bacteria；D—Petroleum hydrocarbon and 2，4-dichlorophenol degrading bacteria

由圖5可知，隨著修復時間的延長，4組土壤中脫氫酶活性均呈現先升高后下降的趨勢，與圖4的變化趨勢相一致。D組土壤中脫氫酶活性始終高于其余組，其最高值可達到0.79 mg TPF/(g soil·h-1)，這歸因于添加復合菌群土壤中較多的微生物數量，且菌群機體內代謝活動旺盛[35]。在修復后期，各組土壤脫氫酶活性降低，這是因為土壤的生物利用度逐漸降低，抑制了酶活性，從而減弱了微生物的代謝能力。

2.6 土壤微生物總數、脫氫酶活性與石油及2，4-二氯苯酚降解率的相關性

通過上述討論，證明了修復過程中土壤微生物總數及酶活性對石油及2，4-二氯苯酚降解率存在一定關系。采用SPSS 26.0軟件分析D組模擬污染土壤修復130 d后的土壤樣品中土壤細菌、真菌總數、脫氫酶活性與污染物降解率之間的相關性，結果見表2。

表2 土壤微生物總數、脫氫酶活性與石油烴降解率(η1)及2，4-二氯苯酚降解率(η2)的相關性

由表2可以看出，土壤細菌、真菌總數、脫氫酶活性與石油烴降解率及2，4-二氯苯酚的降解率均成正相關，相關性顯著，且土壤真菌總數與石油烴降解率及2，4-二氯苯酚降解率相關性系數最高，分別為0.606、0.636，表明真菌對石油烴和2，4-二氯苯酚2種污染物的去除方面作用明顯。結合圖4和圖5可知，添加復合菌群的土壤中微生物總數及脫氫酶活性均高于添加單一降解菌的土壤。可見，細菌、真菌總數與脫氫酶在石油烴和2，4-二氯苯酚降解過程中發揮了至關重要的作用。

2.7 高通量測定群落結構變化

2.7.1 Alpha多樣性分析

對模擬污染土壤經過4種修復方式(A、B、C、D)處理7 d后采集的土壤樣品A1、B1、C1、D1和130 d后采集的土壤樣品A2、B2、C2、D2進行Alpha多樣性指數分析，結果見表3。

表3 模擬污染土壤經過4種修復方式處理7 d和130 d后的土壤樣品的微生物多樣性指數

由表3可知，模擬污染土壤進行處理修復130 d后，樣品A2和B2的Simpson指數略有增大，這歸因于污染物的加入刺激了土壤中具有降解能力的優勢微生物種群的生長[36]。然而其余多樣性指數較第7 d時均有不同程度的下降，這表明模擬土壤中微生物群落物種和多樣性均降低，添加的石油烴和2，4-二氯苯酚破壞了土壤環境，隨著修復時間的推移，土壤微生物群落的多樣性、豐富度以及均勻度均降低，從而影響土壤微生物種群的代謝活性[37]，使得復合菌群在修復污染土壤后期對污染物的代謝速率逐漸降低。

2.7.2 土壤細菌群落結構變化

對模擬污染土壤經過4種修復方式(A、B、C、D)處理7 d后采集的土壤樣品A1、B1、C1、D1和130 d后采集的土壤樣品A2、B2、C2、D2進行微生物的門水平和屬水平的相對豐度分析，結果見圖6和圖7。

A—Natural remediation；B—Petroleum hydrocarbon degrading bacteria；C—2，4-Dichlorophenol degrading bacteria；D—Petroleum hydrocarbon and 2，4-dichlorophenol degrading bacteria

由圖6可知，4組模擬污染土壤樣品中的主要菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteriota)和變形菌門(Proteobacteria)。當修復過程進行到第7 d時，B、C、D組土壤樣品中厚壁菌門均成為優勢菌門，其相對豐度顯著增大，均達到60%以上，而A組土壤樣品中厚壁菌門的相對豐度基本不變。厚壁菌門豐度的增加主要是來源于添加的菌群中的芽孢桿菌屬，而該菌屬對降解石油及氯酚具有重要作用[38]。當修復過程進行到第130 d時，B、C、D組土壤樣品中厚壁菌門的相對豐度相較于第7 d有不同程度的增加，這說明修復過程中添加的芽孢桿菌屬受土壤污染物刺激生長。

由圖7可知，與A組相比，B、C、D組土壤中修復后芽孢桿菌屬(Bacillus)和蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)成為優勢菌屬。D組土壤中修復后芽孢桿菌屬和蒼白桿菌屬的相對豐度略有增長，表明這兩類菌屬在污染土壤中生長代謝穩定，芽孢桿菌屬來源于添加的有機氯降解菌L3、L4和石油烴降解菌S5，研究表明芽孢桿菌屬對石油及氯酚化合物有很好的降解能力[39]。產堿桿菌屬(Alcaligenes)來自添加的石油烴降解菌S4。A組土壤優勢菌屬由節細菌屬(Arthrobacter)和Norank_f_norank_o_norank_c_KD4-96菌屬轉變為諾卡氏菌屬(Nocardioides)、紅球菌屬(Rhodococcus)，這兩類菌在修復石油烴污染土壤及氯酚污染土壤中均有廣泛研究[40]。在B組土壤中，蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)的相對豐度變化不大，芽孢桿菌屬(Bacillus)豐度明顯增多，推測是添加的菌株S5具有較強的生存繁殖能力，相比較于D組土壤，B組土壤在第130 d后產堿桿菌屬(Alcaligenes)豐度的降低更為明顯，這可能是由于加入的石油烴和2，4-二氯苯酚抑制其生長代謝，2，4-二氯苯酚的存在抑制了其對石油的降解效果，這也進一步表明在D組土壤中，有機氯降解菌的存在可以提高石油烴降解菌S4的生存能力[37]。對于C組土壤，修復前后各微生物菌屬相對豐度變化不大，恢復到初始土壤微生態群落結構，表明土壤微生物菌群在受污染土壤恢復及維持群落結構穩定性方面發揮了重要作用。

3 結 論

(1)制備含水質量分數15%～20%、石油烴質量分數10 g/kg、2，4-DCP質量分數500 mg/kg的模擬污染土壤，采用不同的修復方式進行土壤修復實驗。結果表明：添加石油-有機氯復合降解菌群進行模擬污染土壤修復的效果最佳，修復130 d后石油烴降解率為77.68%，2，4-二氯苯酚降解率為100%，比僅添加石油烴降解菌群或有機氯降解菌群的修復方式下的石油烴降解率分別提高18.14和19.78百分點。其中，被降解的石油烴主要為碳數小于27的中短鏈烴。

(2)添加石油-有機氯復合降解菌群進行模擬土壤修復后的土壤樣品中脫氫酶活性最高，微生物總數最多，脫氫酶活性及細菌、真菌數量在修復28 d前呈升高趨勢，28 d后有所下降，且三者與石油烴降解率及2，4-二氯苯酚降解率之間呈正相關。

(3)在石油烴-有機氯的復合污染脅迫下，模擬污染土壤經過不同修復方式處理后的土壤中微生物Alpha多樣性指數降低。高通量測序分析表明，添加菌群強化的土壤中在修復前后厚壁菌門(Firmicutes)均為優勢菌門，放線菌門(Actinobacteria)所占比例下降；同時，添加石油-有機氯復合菌群的土壤中修復后芽孢桿菌屬(Bacillus)和蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)成為優勢菌屬，所占比例上升。