13C NMR分析食用油甘油酯組成的方法研究

肖新生, 謝依琳, 劉 芳, 蔣黎艷

(湖南科技學院化學與生物工程學院,永州 425199)

食用油脂中的甘油酯主要是甘油三酯(Triglyceride,TG),也含有少量的甘油二酯(Diglyceride,DG)、甘油一酯(Monoglyceride,MG)和游離脂肪酸(Free fatty acid,FFA)。將TG與甘油在酶催化或堿催化的條件下進行甘油解,可以獲得含有MG、DG、FFA、TG的甘油解產物。通過進一步的分離可以獲得高純度的MG或DG產品。由于MG、DG在乳化、起酥等方面的特殊性能[1,2],眾多研究者在合成及純化方面開展了大量的研究工作[3-7]。因此建立一種快速有效的產品組成檢測方法,具有非常重要的意義。目前檢測甘油酯中各組分含量的方法有高效液相色譜法[8-11]、氣相色譜法[12,13]、薄層色譜法[14,15]和柱層析法[16]等。這些方法有效解決了研究過程中的反應過程和產品質量監控問題,但仍或多或少存在分析時間長,有機溶劑用量多,綠色環保性差的缺陷。因此進一步開發快速、穩定性好、綠色環保的分析方法具有重要的意義。

核磁共振波譜分析技術(NMR)作為分析鑒定有機化合物結構的手段,在有機化學研究領域具有重要的地位。隨著近年核磁共振波譜分析儀在我國的逐漸普及,有關該技術在食用油脂研究方面的應用也有越來越多的報道[17-21]。研究前期采用核磁共振氫譜(1H NMR)建立山茶油甘油解產物組成的分析方法[22]。但由于1HNMR譜化學位移范圍比較窄(0～12),吸收峰之間比較容易交叉,積分有時會受到交叉峰的干擾,導致數據分析處理難度較大。同時1H NMR譜對于游離脂肪酸(FFA)難于找到特征峰,對于FFA含量的分析無法實現。13C NMR譜化學位移范圍比較寬(0～250),因此吸收峰之間交叉的可能性大大降低,特征峰的識別容易。同時FFA能夠識別到特征峰,可以進行游離脂肪酸含量的分析。因此,建立13C NMR譜分析食用油甘油酯組成的方法具有較好的應用前景。

研究首先制備不同食用油MG、1,2-DG、1,3-DG、FFA和TG樣品,然后對其進行13C NMR分析。接著通過識別各譜圖中的特征峰及其峰面積,采用面積歸一法確定了各組分的相對質量分數。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

可可脂、棕櫚油、山茶籽油、橄欖油、菜籽油、芝麻油、玉米油、葵花籽油、大豆油和豬油:市售;石油醚(分析純)、正己烷(分析純)、無水乙醚(分析純)、叔丁醇(分析純)和甘油(分析純);2,7-二氯熒光素(分析純)、氘代氯仿購于阿達瑪斯;脂肪酶Novozym 435;200目柱層析硅膠。

1.2 主要實驗儀器

BrukerAvance III HD400型核磁共振波譜儀,RE-52A型旋轉蒸發儀,C-MAG HS7型加熱磁力攪拌器,SHB-III型循環水式多用真空泵,DL-400型循環冷卻器,C381730C型具砂板存儲球層析柱。

1.3 實驗方法

1.3.1 甘油解產物制備的方法

將8.80 g食用油與0.44 g甘油(質量比20∶1)投入100 mL兩口燒瓶中,往瓶中加入0.176 g脂肪酶Novozym 435(油質量的2%)作為反應的催化劑,加入20 mL叔丁醇作為溶劑,并在瓶中放入1粒四氟磁力攪拌子,在兩口燒瓶的其中一個接口裝上磁力攪拌器的溫控探頭,另外一個接口接冷凝回流裝置。將兩口燒瓶放入60 ℃的磁力攪拌器中加熱反應24 h,冷卻后過濾除去酶,然后旋轉蒸發脫除溶劑。

1.3.2 柱層析法分離產物的方法

向C381730C型具砂板存儲球層析柱中加入硅膠石油醚溶液(150 mL石油醚+60 g硅膠),加壓壓緊后,加入1 g樣品。首先用純石油醚進行洗脫,洗脫出來的組分為甘油三酯。接著改用V石油醚/V乙醚/V甲酸=70/30/1混合溶劑為洗脫劑,依次得到游離脂肪酸(FFA)、1,3-甘油二酯(1,3-DG)和1,2-甘油二酯(1,2-DG)。收集完成3個組分后,最后改用V乙醚/V甲酸=100/2混合溶劑進行洗脫,得到甘油一酯(MG)。收集得到的各組分分別脫除溶劑后即得到山茶油MAG、1,2-DAG、1,3-DAG、FFA和TAG的純品。將5個樣品分別稱重并計算各個組分的相對質量分數,即得到樣品各組分的質量百分比含量。柱層析過程中以2,7-二氯熒光素為顯色劑,采用TLC監測組分。

1.3.3 核磁共振波譜分析儀測試樣品13CNMR的方法

沒有特殊說明的情況下,取200 mg樣品,加0.5 mL氘代氯仿為溶劑,采用BrukerAvance Ⅲ HD400型核磁共振波譜儀進行測定。核磁共振碳譜(13CNMR)采集條件:脈沖序列zgpg30,掃描次數(NS)=100,脈沖寬度(P1)=30 μs。根據方法優化的需要,可以對樣品量,掃描次數,脈沖寬度等進行更改。

1.3.4 Mestrenova 12.0軟件分析樣品13CNMR譜圖的方法

得到的13C NMR譜圖,采用Mestrenova 12.0軟件處理,首先進行相位校正,基線調平,采用軟件標注各個峰的化學位移值,接著對化學位移值為14.2的端甲基峰面積定義為100,最后相應特征峰進行面積積分,得到樣品各特征峰的面積,根據縱坐標刻度值,讀取峰高。利用純度物質的鏈烷基碳、甘油骨架碳和羰基碳面積比,確定不同種類碳的響應系數。各組分特征峰面積與響應系數的積,占總體的比例即為摩爾比,再根據各個組成的分子質量,即可計算出各個組分的相對質量分數。

2 結果與討論

2.1 甘油酯及游離脂肪酸核磁共振13C NMR譜特征峰的識別

對采用柱層析純化得到的茶油甘油一酯(MG)、1,2-甘油二酯(1,2-DG)、1,3-甘油二酯(1,3-DG)、游離脂肪酸(FFA)和甘油三酯(TG)進行核磁共振13C NMR譜分析。山茶油甘油酯的13CNMR譜對比分析圖如圖1所示,不同的甘油酯和游離脂肪酸存在2個特征峰區,分別是化學位移δ為170～180的羰基碳原子特征峰區,化學位移δ為60～76的甘油骨架碳原子的特征峰區。化學位移δ為14.2的特征峰為脂肪酸烷基鏈的端甲基碳原子吸收峰,該峰可以作為定量分析的參照。

圖1 山茶油甘油酯的13CNMR譜對比分析圖

將山茶油MG、1,2-DG、1,3-DG、TG和FFA混合后的樣品分析后,得到的13C NMR譜羰基特征峰區放大后,山茶油甘油酯的13C NMR譜羰基特征峰對比分析圖如圖2所示。TG的特征峰化學位移δ為173.09和172.69,其面積比為2∶1,分別對應甘油三酯1,3-Sn位羰基碳和2-Sn位羰基碳。1,2-DG的特征峰化學位移δ為173.30和173.54,其面積比為1∶1。2-MG的特征峰化學位移δ為173.85,1-MG的特征峰化學位移δ為173.98。FFA的的特征峰化學位移δ為177.09,通過多個譜圖對比發現,該特征峰的化學位移δ值會在175～180之間波動。

圖2 山茶油甘油酯的13CNMR譜羰基特征峰對比分析圖

第2個特征區在化學位移δ為60～75之間,山茶油甘油酯的13C NMR譜甘油骨架碳特征峰對比分析圖如圖3所示,該區域的峰是甘油骨架上碳原子的吸收峰。甘油(G)Sn-2位的化學位移為72.48,Sn-1,3位的化學位移為63.03;2-MG特征峰的化學位移δ為74.65;1-MG特征峰的化學位移δ為70.12、64.91、63.30,其中64.91處的特征峰與1,3-DG的峰有重疊;1,2-DG特征峰的化學位移δ為71.99、62.34、60.96;1,3-DG特征峰的化學位移δ為67.77、64.82,64.82處的峰與1-MG的峰有重疊;TG的特征峰的化學位移δ為68.89、62.02。

圖3 山茶油甘油酯的13CNMR譜甘油骨架碳特征峰對比分析圖

2.2 油脂種類對核磁共振碳譜特征峰化學位移及面積影響研究

為了考察不同種類油脂的核磁共振碳譜(13C NMR)的化學位移及特征峰面積是否存在差異,選取了飽和酸含量較高的可可脂和棕櫚油、油酸含量高的橄欖油和山茶油、亞油酸含量較高的葵花籽油和大豆油、以及菜籽油、芝麻油、玉米油、等9種常見植物油進行分析比較。不同種類食用油甘油三酯特征峰的相對面積見表1,研究發現甘油三酯4個特征峰化學位移值δ分別在173.09～173.32、172.69～172.90、68.85～68.89、62.02～62.11之間波動,波動范圍為0～0.23之間,同時未發現脂肪酸不飽和度與化學位移偏移值之間有相關性。利用MestReNova軟件對各樣品13C NMR譜圖數據進行積分,可以得到不同種類食用油甘油三酯特征峰的相對面積。

食用油甘油三酯2個羰基碳的特征峰相對面積的相對標準偏差的結果分別為2.00%和2.15%,甘油骨架上的碳的2個特征峰相對面積的相對標準偏差結果分別為1.78%和1.70%。食用油脂肪酸組成對特征峰的化學位移和特征峰的面積沒有顯著影響,測定的結果的準確性不受食用油種類的影響。同時研究中對比了幾種常見油脂的甘油一酯和甘油二酯的譜圖,不同油脂DG和MG的13CNMR譜對比分析圖如圖4所示,油脂種類對甘油一酯和甘油二酯羰基碳和甘油骨架碳特征峰的化學位移沒有影響。通過相對峰面積積分,發現各個特征峰的面積響應值是一致的。

圖4 不同油脂DG和MG的13CNMR譜對比分析圖

2.3 核磁共振波譜分析條件對測定結果的影響

2.3.1 油脂用量對核磁共振碳譜的影響研究

核磁共振碳譜(13C NMR)與核磁共振氫譜(1H NMR)相比,信號強度弱,需要通過增加樣品用量或增加掃描次數來提高峰的強度。而峰的高度,將影響測試的靈敏度,進而影響檢測限。山茶油為測試對象,比較用量為25、50、100、200、300、400 mg的13C NMR譜圖,通過MestReNova進行積分,發現油脂用量對特征峰的相對面積沒有影響,但是對于特征峰的峰高有非常重要的影響。當樣品掃描測數恒定為100次時,基線高度均為26,將特征峰高度與基線高度相比,得出信噪比與樣品用量的關系曲線,特征峰高度與基線高度比隨樣品用量的變化曲線如圖5所示。δ為62.11的甘油Sn1位與Sn3位碳特征峰具有最大的信噪比。油脂的用量越多,信噪比越大。但是氘代試劑的用量為0.5 mL,樣品量超過400 mg,會造成溶解困難。如果樣品熔點較高,還需要酌情減少樣品質量。樣品質量低于100 mg,在掃描100次的情況下,會使得信噪比變小,同一個樣品多次測試和積分的數據重復性變差。

注:0.5 mLCDCl3,核磁P1設為為10,掃描100次。

2.3.2 掃描次數對核磁共振碳譜的影響研究

通過增加掃描次數,可以將信號疊加而提高檢測的靈敏度。選取山茶油作為研究對象,取100 mg油脂,分別掃描5、10、15、25、30、50、100、200、300、500次,將得到的譜圖通過MestReNova軟件進行處理,得到的山茶油特征峰相對面積和峰高,不同掃描次數山茶油甘油三酯特征峰的相對面積及峰高對比見表2。當掃描次數在50次及以下時,測定的各特征峰的峰面積誤差相對較大;掃描次數在100次以上時,峰面積趨于穩定。

表2 不同掃描次數山茶油甘油三酯特征峰的相對面積及峰高對比

通過研究信噪比(特征峰峰高與基線高的比值),發現隨掃描次數的增加,樣品信號峰增強的速度明顯高于基線高度增加的速度。特征峰高度與基線高度比隨掃描次數的變化曲線如圖6所示,信噪比與掃描次數之間的關系基本與冪函數接近。hδ62.11/h基線,y= 4.285 1x0.480 2,R2= 0.992 5;hδ68.85/h基線,y= 2.771 6x0.483 4,R2=0.991 5;hδ172.69/h基線,y=2.330 2x0.435 6,R2= 0.977 8;hδ173.09/h基線,y=4.139 4x0.432,R2= 0.985。當掃描次數在100次以下時,信噪比隨掃描次數增加的數據很快;掃描次數100次以上時,信噪比還是不斷增加,但是增加的速度逐漸放緩。

圖6 特征峰高度與基線高度比隨掃描次數的變化曲線

2.3.3 脈沖寬度P1對核磁共振碳譜的影響研究

研究中設置脈沖寬度P1在5～60 μs之間,考察山茶油甘油三酯各特征峰,相對面積和特征峰峰高與基線高的比值(信噪比)的變化情況。特征峰相對峰面積及信噪比隨脈沖寬度P1的變化曲線如圖7所示, P1值對各個特征峰的相對面積有影響。其中羰基碳受到的影響相對較小,而甘油骨架上碳受到的影響較大。尤其是化學位移值為62.11的的峰,隨著P1值從5μs向60μs的改變中,相對峰面積呈現先增大,后減少的趨勢,并在P1為45 μs時表現出極大值。總體來看,P1在30～50 μs之間,特征峰面積較大。具有較大的信噪比而從特征峰峰高與基線高比值來看,P1在15～30 μs之間具有較大的信噪比。綜上,選擇P1為30 μs較為合理。

圖7 特征峰相對峰面積及信噪比隨脈沖寬度P1的變化曲線

2.4 定量計算公式的推導

以脂肪酸酰基鏈末端甲基碳(化學位移δ為14.16)特征峰面積為參照,將其面積設定為100,分別對TG、1,2-DG、1,3-DG、2-MG、1-MG和FFA的羰基碳和甘油骨架碳特征峰進行積分,茶油甘油解各組分特征峰化學位移及相對面積見表3。每分子TG有3個脂肪酸烷基端甲基碳、3個甘油骨架碳和3個羰基碳,每分子DG有2個脂肪酸烷基端甲基碳、3個甘油骨架碳和2個羰基碳,每分子MG有1個脂肪酸烷基端甲基碳、3個甘油骨架碳和1個羰基碳,每分子FFA有1個脂肪酸烷基端甲基碳、0個甘油骨架碳和1個羰基碳。通過對各個純組分數據的對比分析,發現甘油骨架碳與脂肪酸烷基端甲基碳的峰面積響應系數為0.97∶1,而游離脂肪酸羰基碳與脂肪酸烷基端甲基碳的峰面積響應系數比為0.30∶1。相比與羰基的特征峰,甘油骨架上碳原子的特征吸收峰具有更高的響應系數,測定的靈敏度更高。TG、DG、MG的量,可以采用甘油骨架碳特征峰相對面積來確定,由于FFA無甘油基,因此只能采用羰基碳來進行定量分析。分別選取δ177.09、δ74.78、δ72.10、δ70.22、δ68.85、δ68.36來計算FFA、2-MG、1,2-DG、1-MG、TG、1,3-DG的質量分數。表4中按茶油棕櫚酸8.8%、硬脂酸1.1%、油酸82%、亞油酸7.4%、亞麻酸質量分數0.2%計算平均分子質量。對于常見食用植物油,分子質量有所偏差,但造成的誤差相比儀器本身的誤差,可以忽略不計。茶油甘油解各組分特征峰化學位移及相對面積見表4。

表3 茶油甘油解各組分特征峰化學位移及相對面積

2.5 甘油解產物各組分的含量

取200 mg山茶油甘油解產物,加0.5 mL氘代氯仿為溶劑,采用BrukerAvance Ⅲ HD400型核磁共振波譜儀進行測定。核磁共振碳譜(13C NMR)采集條件:脈沖序列zgpg30,掃描次數(NS)=100,脈沖寬度(P1)= 30 μs。得到的譜圖經Mestrenova 12.0軟件處理,首先進行相位校正,然后基線調平,接著對化學位移值為14.2的端甲基峰面積定義為100,最后相應特征峰進行面積積分,得到樣品的碳譜圖,茶油甘油解樣品中各組成的特征峰及峰面積積分如圖8所示。

圖8 茶油甘油解樣品中各組成的特征峰及峰面積積分

將圖8中定量積分的結果代入表4中的公式,得到各組分的相對質量分數,13C NMR法測定茶油甘油解產物各組分相對質量分數見表5。

表5 13CNMR法測定茶油甘油解產物各組分相對質量分數

2.6 柱層析法與核磁共振碳譜法的對比分析

取1g山茶油甘油解產物(與采用核磁共振法的甘油解反應液樣品相同),采用硅膠柱層析法分離。依次分離得到山茶油甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)、1,3-甘油二酯(1,3-DG)、1,2-甘油二酯(1,2-DG)和甘油一酯(MG)。由于柱層析未能分開1-MG與2-MG,因此1-MG與2-MG合并記為MG。將6個組分分別稱重計算相對質量分數,重復6次,柱層析法測定茶油甘油解產物各組分相對質量分數見表6。與表5中核磁共振碳譜法測定的數據對比,平均值接近。由于核磁法對低含量的2-MG進行了定量,其相對標準偏差大些,FFA、DG的相對標準偏差相當,而柱層析法對低含量的TG,相對標準偏差較核磁共振要大些。

表6 柱層析法測定茶油甘油解產物各組分相對質量分數

研究進一步利用單因素方差分析,對核磁共振法和柱層析法測定的FFA、MG、1,2-DG、1,3-DG和TG相對質量百分含量的數據(表5與表6)進行比較分析,結果表明,各個組分的F統計量(F)與F臨界值(Fcrit)相比,均呈現F

2.7 核磁共振碳譜法的檢測限與定量限

為了探討核磁共振碳譜檢測各個組分相對含量的檢測限,研究中向200 mg甘油三酯中,各添加甘油三酯0.5%～20.0%的FFA、MG(1-MG與2-MG的混合物,m1-MG∶m2-MG=0.086∶0.914)、DG(1,3-DG與1,2-MG及少量TG的混合物m1,2-DG∶m1,3-DG∶mTG=0.264 2∶0.611 6∶0.124 3),甘油三酯中添加低含量FFA、MG和DG的13C NMR測定值與實際組成對比表見表8中實際值所示。將樣品測定后的譜圖,采用MestReNova軟件分析后,甘油三酯中添加低含量FFA、MG和DG的13C NMR譜對比分析圖如圖9所示。FFA檢測的靈敏度最低,當質量分數為1%時,峰高僅為基線高度的2.4倍,不符合統計分析中有關檢出限信噪比≥3的要求,不能認定為檢出。以游離脂肪酸含量x為橫坐標,信噪比y為縱坐標,得線性方程y=165.3x+0.767(R2=0.999)。由線性方程可以計算出,當FFA質量分數1.35%時,S/N=3,可以認定為檢出。按定量限為檢出限3.3倍的算法,游離脂肪酸的定量限為4.45%。按照同樣的方法,得出1-MG、2-MG、1,2-DG和1,3-DG的檢出限分別為0.52%、0.43%、0.74%、0.36%,而1-MG、2-MG、1,2-DG和1,3-DG的定量限分別為1.7%、1.4%、2.4%、1.2%。

表8 甘油三酯中添加低含量FFA、MG和DG的13C NMR測定值與實際組成對比表

圖9 甘油三酯中添加低含量FFA、MG和DG的13C NMR譜對比分析圖

3 結論

通過確定核磁共振碳譜中TG、1,3-DG、1,2-DG、1-MG、2-MG和FFA的特征峰及其響應系數,確定樣品中各個組分的摩爾比,然后依據各組分相對分子質量,來計算甘油酯樣品中各組分的相對質量分數。對核磁共振碳譜進行重復性計算和誤差分析,發現該測定方法對于常見食用油,不受食用油脂種類的影響。該方法不僅可以用于甘油一酯、甘油二酯制備過程中反應程度的監控,也可用于產品純化效果的檢驗,還可用于食用油脂中少量DG、MG和FFA的檢測。研究中測定各組分是相對質量分數,沒有考慮甘油的影響,下一步將開發內標法進行絕對含量的測定。同時還將考察甘油酯中脂肪甲酯含量的檢測,為生物質能源開發提供技術支持。