基于核桃油-辛酸酶法合成新型結構脂的研究

焦云琦, 徐丹亞, 梅 潔, 馬 慧, 劉鳳蘭, 孔令明

(新疆農業大學食品科學與藥學學院1,烏魯木齊 830000)(新疆林科院經濟林研究所2,烏魯木齊 830000)

結構脂是在油脂代謝及營養學研究的基礎上開發的一類新型油脂,通過改變甘油三酯的骨架上脂肪酸的組成和位置的分布,可以將有特殊的營養功能或生理功能的脂肪酸結合到指定位置,充分發揮其營養功能和生理功能[1-5]。中長鏈結構脂一方面通過中鏈脂肪酸提供機體所需的能量,另一方面通過長鏈脂肪酸為機體提供營養。目前已有以芝麻油、花生油、菜籽油、金槍魚油和大豆油、玉米油等為原料生產結構脂[6-13],而以核桃油為原料的研究相對較少,并且目前大部分研究關注結構脂的功能特性,忽略了其原料油脂本身的營養特性,對結構脂制備的原料油脂的篩選研究較少。核桃油是一種高營養的食用油,不飽和脂肪酸含量極高且有較好的油酸比例,適合人體吸收。除此之外,還含有豐富的微量成分如維生素、磷脂等,具備多種生物活性,如健腦、消除炎癥、改善Ⅱ型糖尿病患者的脂質狀況等[14-16]。因此,以核桃油為原料制備核桃油-辛酸結構脂對于提高結構脂的營養功能及生理功能有重要意義。

以核桃油為原料油,加入辛酸并利用固定化脂肪酶Lipozyme TL IM 進行催化,發生酸解反應,將核桃油轉化為核桃油-辛酸結構脂,通過單因素實驗對核桃油-辛酸結構脂的影響,并進行響應面優化核桃油-辛酸結構脂的制備,從而獲得核桃油-辛酸結構脂。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與主要試劑

核桃油:實驗室以新疆溫185品質核桃為原料壓榨而成;固定化脂肪酶Lipozyme TL IM,固定化脂肪酶Lipozyme RM IM,固定化脂肪酶Novozym 435,購自諾維信公司;正辛酸,冰乙酸,三氯甲烷,韋氏試劑,環己烷,硫代硫酸鈉標液。

1.1.2 主要儀器與設備

TDL-5-A離心機,PL203電子天平,恒溫水浴搖床,氣相色譜儀Aglient 7890。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃油與辛酸的酸解反應單因素實驗

將核桃油與辛酸以一定比例的底物摩爾比混合,并加入一定量脂肪酶完全融合后,在無溶劑體系中,一定溫度條件下密閉振蕩反應一段時間,反應結束后在4 500 r/min條件下離心15 min除去脂肪酶,得到核桃油結構脂。采用單因素實驗探究底物摩爾比辛酸∶核桃油(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1),酶質量分數(8%～16%),不同的反應時間(6～12 h),不同的反應溫度(35～75 ℃)對于核桃油-辛酸結構脂中辛酸插入率[17-20]的影響。

1.2.2 酸解法合成-辛酸結構脂響應面優化實驗

運用Box-Behnken響應面設計法,在單因素實驗基礎上,每個因素選取 3 個水平,以底物摩爾比(A)、加酶量(B)、反應時間(C)、反應溫度(D)3個因素為考察對象,以辛酸插入率為參考值Y,建立酶催化核桃油與辛酸酸解反應的二次回歸數學模型。

1.3 核桃油甲酯化

稱取 50 uL 核桃油-辛酸結構脂樣品于 15 mL試管中,加 0.3 mL的乙醚與0.7 mL的正己烷溶解油樣,再用移液槍加入1.0 mL甲醇溶液,加入甲醇-氫氧化鉀溶液10 mL與油樣混勻,再加入 2.0 mL飽和氯化鈉水溶液,渦旋振蕩混勻,靜置 20 min使其分層。在 3 000 r/min離心 5 min,吸取上層清液用于GC分析。

1.4 氣相色譜檢測條件

色譜柱:HP-88 毛細管柱(100 m×0.25 mm;膜厚 0.25 μm);檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID),進樣口的溫度設置為 260 ℃,檢測器溫度設置為 280 ℃。升溫程序:120 ℃保持 1 min,然后以 20 ℃/min升溫至 175 ℃并保持 10 min,最后以 1 ℃/min升至200 ℃保持 10 min。載氣為氫氣(純度>99.9%);進樣量 1 μL,分流比為 50∶1。氮氣流速:30 mL/min,空氣流速 400 mL/min,氫氣流速 40 mL/min。

1.5 理化性質的測定

過氧化值參考GB 5009.227—2016《食品安全國家標準食品中過氧化值的測定》。

碘值參考GB/T 5532—2008《動植物油脂碘值的測定》。

2 結果與分析

2.1 核桃油總脂肪酸組成與含量

核桃油在甲酯化法處理后經過氣相色譜測定,對混合脂肪酸甲酯進行定性和定量分析,對核桃油的營養價值進行科學評價,根據氣相色譜圖譜核桃油脂肪酸組成含量如表1所示。

表1 核桃油總脂肪酸組成

從表1可以看出,核桃油中各脂肪酸甲酯分離情況較好,雜峰比較少,對比37種脂肪酸甲酯混標與樣品的保留時間進行定性,發現在核桃油中得到6種脂肪酸甲酯混合物。核桃油中的脂肪酸組成與含量,其中含有6種脂肪酸分別是棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸,主要以不飽和脂肪酸為主,不飽和脂肪酸質量分數為89.83%,其中單不飽和脂肪酸的質量分數為19.13%,多不飽和脂肪酸的質量分數為70.69%,與前人的研究結果基本一致[17,21]。

2.2 酸解法制備核桃油-辛酸結構脂單因素實驗結果分析

2.2.1 酶的種類對核桃油-辛酸結構脂脂肪酸種類及含量的影響

為篩選出通過無溶劑體系能夠將辛酸最大程度與核桃油結合的固定化脂肪酶,選用商業固定化脂肪酶 Novozym 435、Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM 進行實驗,考察其對核桃油-辛酸結構脂合成的催化活性。不同酶進行酸解反應核桃油-辛酸結構脂的脂肪酸組成及含量對比如表2所示。

表2 不同酶進行酸解反應核桃油-辛酸結構脂的脂肪酸組成及質量分數/%

表2可知,通過酸解反應,不同的脂肪酶作為催化劑對核桃油-辛酸結構脂中脂肪酸組成有不同的影響,當脂肪酶 Lipozyme TL IM 和脂肪酶 Lipozyme RM IM 參與反應時,核桃油-辛酸結構脂的脂肪酸種類相較于核桃油發生了變化,增加了辛酸及少量羊蠟酸,而當脂肪酶Novozym 435參與反應時,脂肪酸種類增加了辛酸及二十碳烯酸,辛酸的插入量相較于其他2種固定化脂肪酶低。辛酸插入率從高到低的順序為:脂肪酶 Lipozyme TL IM>脂肪酶 Lipozyme RM IM>脂肪酶Novozym 435,范圍從2.02%到27.88%。從成本及辛酸插入率兩個方面考慮,最終選擇脂肪酶 Lipozyme TL IM作為后續的反應催化劑,與前人研究結果一致[18,19,22,23]。

過氧化值越高說明油脂酸敗程度越高,核桃油本身的過氧化值符合GB/T 22327—2008 核桃油的要求。由圖1可知,使用不同種類的脂肪酶都對核桃油-辛酸結構脂的過氧化值有一定的影響,并且使用脂肪酶Lipozyme TL IM 作為催化劑時,其過氧化值最低,說明其油脂酸敗的程度最低。

圖1 不同脂肪酶對核桃油-辛酸結構脂的碘值及過氧化值的影響

由圖2可以看出,使用脂肪酶Lipozyme TL IM 、脂肪酶Lipozyme RM IM 和Novozym 435這3種酶作為催化劑時,其碘值相差不大。碘值越高說明油脂的不飽和程度越高,結合表3,相較于核桃油,核桃油-辛酸結構脂中的不飽和脂肪酸含量降低,總脂肪酸組成及含量發生了變化,同時也反映出核桃油-辛酸結構脂較純核桃油具有更高的氧化穩定性。

圖2 不同底物摩爾比對核桃油-辛酸結構脂的辛酸插入率及碘值的影響

表3 響應面實驗因素水平表

2.2.2 底物摩爾比對核桃油-辛酸結構脂的辛酸插入率及碘值的影響

由圖2可知,在底物摩爾比為1∶1時,辛酸插入率較低,酸解反應不完全,可能是由于提供的酰基供體較少,隨著底物摩爾比的增加,辛酸插入率逐漸增加。當底物摩爾比增加到3∶1時,辛酸插入率達到最高,碘值最低;這是因為在脂肪酸比例相對較低,隨著脂肪酸供體比例的增加,辛酸的插入率也在提高。進一步增加摩爾比到4∶1和5∶1,辛酸插入率并沒有因為辛酸含量的增加而繼續增加,反而略微下降,而碘值則呈一定的上升趨勢,可能是由于適當的底物摩爾比有利于反應平衡并增加底物和催化劑之間的碰撞比例。較高比例的底物摩爾比對于核桃油-辛酸結構脂的合成無益[20,24],結合經濟角度考慮,選擇摩爾比3∶1作為最佳底物摩爾比,與前人的研究結果一致[21,25]。

2.2.3 酶質量分數對核桃油-辛酸結構脂的辛酸插入率的影響

在底物足夠,其他條件固定的條件下,反應系統中不含有抑制酶活性的物質及其他不利于酶發揮作用的因素時,酶促反應的速度與酶質量分數成正比。

由圖3可知,隨著酶質量分數的增加,辛酸插入率逐漸增加,碘值逐漸下降,這表示出核桃油-辛酸的飽和脂肪酸含量在不斷的增加;但當酶質量分數超過10%以后呈現平緩下降的趨勢,由于當酶相對于底物的切點過多時,過高的酶濃度導致酶分子之間的競爭抑制[22,26],引起辛酸插入率的下降。過高的酶質量分數對核桃油-辛酸的合成無益[23,27],結合辛酸插入率以及經濟角度考慮,選擇酶質量分數為10%作為最佳酶質量分數,與前人研究結果一致[23,24,27,28]。

圖3 酶質量分數對核桃油-辛酸結構脂的辛酸插入率的影響

2.2.4 反應溫度對核桃油-辛酸結構脂的辛酸插入率的影響

酶促反應在一定溫度范圍內反應速度隨溫度的升高而加快;但當溫度升高到一定限度時,酶促反應速度不僅不再加快反而隨著溫度的升高而下降。

圖4可知,隨著反應溫度的增加,辛酸插入率呈上升的趨勢,當溫度為45 ℃時,辛酸插入率最大,達到27.37%;當溫度超過45 ℃時,辛酸插入率逐漸下降,當反應溫度為75 ℃時,辛酸插入率最低,為16.00%。脂肪酶Lizyome TL IM酶的最適溫度范圍為55～75 ℃,可能是由于反應時間較長,導致酶的最適溫度下降,適當地提高溫度,有助于提高酶的活性和加快反應的速度,而過高的溫度使酶活性降低,從而減緩反應的速度,因此,選擇45 ℃為后續的反應溫度,與前人研究結果一致[25,29]。

圖4 反應溫度對核桃油-辛酸結構脂辛酸插入率及碘值的影響

2.2.5 反應時間對核桃油-辛酸結構脂的辛酸插入率的影響

由圖5可知,隨著反應時間的延長,辛酸插入率逐漸增加,但當反應時間超過12 h以后,辛酸插入率的含量開始有些下降。出現這種現象的原因可能是隨著反應時間的延長,反應逐漸達到動態平衡狀態[22,26],由此可知,過長的反應時間對辛酸插入核桃油的合成無益,結合辛酸插入率及能源消耗考慮,選擇反應時間為12 h作為最佳反應時間,與前人研究結果一致[26,30]。

圖5 反應時間對核桃油-辛酸結構脂辛酸插入率的影響

2.3 響應面實驗結果分析

2.3.1 響應面實驗設計

根據單因素實驗結果,采用 Design-Expert 8.0 軟件,以辛酸插入率為響應值,以底物摩爾比、加水量、反應時間、反應溫度4個因素為自變量,設計4因素3水平共 29 點的響應面實驗(其中 24個析因點,5個中心點)。因子水平編碼見表 5。表3中-1,0,1分別代表因素的低、中、高水平。

2.3.2 響應面實驗結果與討論

響應面實驗結果與討論如表4所示。

表4 實驗設計及結果

2.3.3 回歸模型的顯著性檢驗及方差分析

利用Design-Expert.8.0.6.1軟件對表4數據進行分析,得到核桃油-辛酸結構脂的辛酸插入率與各因素之間的二次多元回歸擬合方程為:

Y=32.93+2.48A+2.36B+1.48C-0.72D+1.20AB-2.56AC-1.88AD+1.62BC+2.19BD+1.39CD-7.09A2-9.95B2-2.05C2-2.34D2。

2.3.4 響應面多因素交互作用分析

底物摩爾比、酶質量分數、反應時間及反應溫度4個因素對響應值的影響顯著性可用F值來評價,F值越大,說明該因素對辛酸插入率的影響越大。由表6可知,F(A)=24.86,F(B)=22.53,F(C)=8.83,F(D)=2.11,辛酸插入率知受各因素影響程度大小依次為底物摩爾比(A)>酶質量分數(B)>反應時間(C)>反應溫度(D),其中底物摩爾比和酶質量分數對核桃油-辛酸結構脂的辛酸插入率的影響極顯著(P<0.001),反應時間C對核桃油-辛酸結構脂的辛酸插入率的影響顯著(P<0.05),但反應溫度D對核桃油-辛酸結構脂的辛酸插入率的影響不顯著(P>0.05)。由表5可知,交互項AC、AD、BD(P<0.05),表示底物摩爾比與反應時間和反應溫度的交互作用對響應值的影響顯著、酶質量分數與反應溫度的交互作用對響應值的影響顯著,響應面坡度越大,響應值對不同條件的變化越敏感。反之,坡度越平緩,對響應值的影響越小。

表5 響應面回歸模型的顯著性檢驗及方差分析

2.3.5 最佳條件的確定及驗證實驗

根據響應面分析得到核桃油-辛酸結構脂的辛酸插入率最佳的酸解條件為:底物摩爾比(辛酸∶核桃油)為3.14∶1,酶質量分數為10.3%,反應時間為12.64 h,反應溫度為44.79 ℃,在這個條件下,核桃油-辛酸結構脂的辛酸插入率可以達到33.53%。考慮到實際操作性上,將實際實驗條件調整為底物摩爾比(辛酸∶核桃油)為3∶1,酶質量分數為10%,反應時間為12.6 h,反應溫度為44.8 ℃,在此條件下重復3次實驗,取平均值得到核桃油-辛酸結構脂的辛酸插入率為32.37%,接近軟件優化的最大值,因此采用響應面分析法得到核桃油-辛酸結構脂較高辛酸插入率的最佳制備工藝的條件是可行的。實驗結果與預測值結果相符良好,說明響應面模型預測結果是有效的。

3 結論

通過篩選選擇固定化脂肪酶Lipozyme TL IM 制備核桃油-辛酸結構脂,通過響應面結果可以得出酸解法制備核桃油-辛酸結構脂的最佳條件為底物摩爾比(辛酸∶核桃油)為3∶1,酶質量分數為10%,反應時間為12.6 h,反應溫度為44.8 ℃,在此條件下,辛酸插入率為32.37%。該條件適于制備核桃油-辛酸結構脂,通過對核桃油-辛酸結構脂制備工藝可為新型結構脂的研究與開發提供參考。