超聲提取結合HPLC-ICP-MS聯用測定富硒山茶油中的硒形態

劉文政, 賈亞琪, 周貽兵, 畢 珊, 劉利亞

(貴州省疾病預防控制中心1,貴陽 550004)(貴州省環境科學研究設計院2,貴陽 550081)

山茶油,又名油茶籽油、茶籽油、茶油等,是山茶科(Camellia)植物油茶(CamelliaoleiferaAbel)種子經壓榨或浸提加工制得的食用油脂[1]。油茶是一種木本油料樹種,分布在長江流域及其以南的多個省域,其中江西、湖南、廣西三省的油茶種植面積占全國總種植面積的三分之二以上[2]。山茶油蘊含生育酚、茶多酚、甾醇、茶皂素和角鯊烯等多種生物活性成分[3,4]。山茶油是深受消費者歡迎的高端食用油,有“東方橄欖油”的美譽[5]。硒是人體生長發育所必需的微量元素,對防治疾病、增進健康和預防衰老具有重要意義,而人體補硒卻只能從食物中攝取。目前我國絕大部分地區依然存在缺硒或嚴重缺硒的情況,這嚴重威脅著國民的身體健康,亟需大力發展富硒食品產業[6]。目前,我國油茶種植面積約453×104hm2,已有15個省份近800個縣種植油茶,種植面積在6 667 hm2以上的縣有200個左右,富硒茶油年總產量僅有20萬t左右,茶油占國內食用油消費的比例僅為2%[6]。按照中央部署,持續推進擴大油茶種植面積、改造提升低產林,到2025年,全國油茶種植面積有望超過600×104hm2,茶油產量達到200萬t,茶油占國內食用油消費的比例提高至5%,成為增強國內食用油生產保障能力、豐富食用油品種的重要支撐[7]。因此,采用施肥富硒、生物化學富硒等技術手段實現茶油富硒[8],茶油中的硒含量得以提升,使得富硒茶油具有茶油和硒的雙重營養功效,進而改善了居民日常膳食中的缺硒窘境。

硒主要有亞硒酸根(Se(IV))、硒酸根(Se(VI))、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基-硒代半胱氨酸(SeMC)、硒代蛋氨酸(SeMet) 5種賦存形態,而人體對不同賦存形態硒化合物的吸收利用效率差異顯著[9-12]。采用氣相色譜法[13]、高效液相色譜(HPLC)法[14]、離子色譜法[15]和毛細管電泳法[16]對硒化合物進行分離,利用原子吸收光譜法[17]、原子熒光光譜法[18]、電感耦合等離子發射光譜法[19]、電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)法[20-24]對硒化合物的含量進行測定。馬小靈等[25]開展了富硒茶油對小鼠降血脂和抗氧化作用的影響研究,研究結果表明富硒茶油和普通茶油均有降血脂和抗氧化作用,但富硒茶油效果更好。宋亞蕊等[6]研究富硒茶油的硒含量對其品質及功能性成分的影響,研究結果顯示,隨著茶油中硒含量的增加,亞油酸、亞麻酸和甾醇含量顯著提高,油酸含量則有所降低。針對富硒茶油的研究主要集中在營養成分、功能性成分及其抗氧化活性方面的研究,而國內外有關植物油中5種硒形態化合物的測定方法卻鮮見報道。本研究建立了HPLC-ICP-MS法對富硒山茶油中5種硒形態化合物的含量進行分離測定,該方法具有分離效率高、檢出限低、精密度高、穩定性好等優點,旨在為進一步開展富硒山茶油產品的高通量篩查和有效甄別工作提供技術參考,助力富硒山茶油產業的健康良性發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

恩施、宜春、高安、瀏陽、衡陽、開陽、黔東南、銅仁等8個富硒山茶油樣:市售;SeCys2標準物質溶液(44.2 μg/g)、SeMC標準物質溶液(34.8 μg/g)、Se(Ⅳ)標準物質溶液(42.9 μg/g)、SeMet標準物質溶液(39.4 μg/g)、Se(Ⅵ)標準物質溶液(41.5 μg/g);檸檬酸(色譜純);蛋白酶K;其他化學試劑均為優級純;超純水;ICP-MS調諧液(1 μg/L)。

1.2 儀器與設備

iCAPQ型ICP-MS儀,U3000型HPLC儀,Hamilton PRP-X100色譜柱(250 mm×4.1 mm,10 μm),ME204型萬分之一電子分析天平,1-15K型臺式高速冷凍離心機。

1.3 方法

1.3.1 儀器工作參數

色譜條件:PRP-X100色譜柱(250 mm×4.1 mm,10 μm);流動相A:5 mmol/L檸檬酸溶液(pH 5.5);流動相B:超純水;流動相流速:0.8 mL/min;進樣量:20 μL。梯度洗脫:0～7 min,5%流動相A;8～15 min,50%流動相A;16～20 min,5%流動相A。

ICP-MS工作條件:射頻功率1 550 W;霧化室溫度2 ℃;載氣流量0.5 L/min;輔助氣流量0.1L/min。樣品分析前使用調諧液將儀器靈敏度調至最佳狀態。

1.3.2 樣品前處理

稱取約0.5 g富硒山茶油樣品于15 mL塑料離心管中,加入1 mL 10 mg/mL的蛋白酶K溶液,加純水定容至10 mL,超聲提取50 min,高速離心10 min,取下層清液,過0.45 μm水相濾膜,上機測定。

2 結果與分析

2.1 優化色譜分離條件

根據王丙濤等[22]對食品中5種硒形態進行研究的報道,實驗選擇濃度為5 mmol/L的檸檬酸溶液(pH 5.5)作為流動相。100%流動相條件下不同硒形態目標化合物的色譜圖如圖1所示。采用檸檬酸溶液(pH 5.5)作為流動相進行等度洗脫,能將SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ) 4種硒形態目標化合物的色譜峰完全分開,這與曹玉嬪等[26]對牛蒡和三七中硒形態的研究結果基本一致。采用流動相檸檬酸溶液(pH 5.5)等度洗脫無法將SeMC、Se(Ⅳ) 2種硒形態目標化合物的色譜峰完全分開。

圖1 100%流動相A條件下不同硒化合物的色譜圖

為了將SeMC、Se(Ⅳ) 2種硒形態目標組分的色譜峰完全分開以實現較好的分離度,本實驗對流動相A的比例進行了系統優化。實驗研究了流動相A比例分別為5%、10%、50%、100%時2種硒形態目標化合物的分離情況,研究結果如圖2所示。隨著流動相A比例的逐漸減小,SeMC與Se(Ⅳ)的分離度逐漸增大,當流動相A的比例為5%時,SeMC與Se(Ⅳ)可實現完全分離。

圖2 不同流動相A比例條件下2種硒化合物的色譜圖

2種不同洗脫方式下5種硒形態目標化合物的分析色譜圖如圖3所示。由圖3a可知,采用等度洗脫方式(流動相A的比例為5%)時,5種硒形態目標化合物均能實現較好分離,SeCys2、SeMC、Se(Ⅳ)、SeMet 4種硒形態目標化合物的色譜峰7 min內可完全分開,而Se(Ⅵ)于23 min左右出峰,總的分析時長達到25 min。Se(Ⅵ)出峰時間過長,導致峰形拖尾、總的分析時長增加,這不利于實現對實際樣品的快速檢測。因此,本實驗選擇采用梯度洗脫方式,旨在不影響先出峰的4種硒形態目標化合物分離度的情況下,縮短Se(Ⅵ)的出峰時間。實驗結果表明,隨著流動相A比例的升高,Se(Ⅵ)的出峰時間變短。與此同時,隨著流動相中鹽含量的升高,導致儀器的故障發生率、維護成本升高,故在8～15 min內本研究選擇采用50%流動相A進行梯度洗脫。由圖3b可知,5種硒形態目標化合物在15 min內均能實現完全分離。

圖3 等度和梯度洗脫方式下5種硒化合物的色譜圖

2.2 優化樣品前處理條件

本實驗分別使用水、1%(體積分數)硝酸溶液、蛋白酶K溶液等提取劑對富硒山茶油中硒形態化合物的提取效果進行了考察。實驗結果表明,采用水、1%(體積分數)硝酸溶液作為提取劑時,試樣中只有少量的Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ) 2種無機硒形態目標化合物被檢出,其他3種有機硒形態目標化合物均未檢出;采用蛋白酶K溶液為提取劑時,試樣中Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeCys2、SeMC、SeMet 5種硒形態目標化合物均被檢出,這可能與富硒山茶油中的硒形態化合物主要以硒蛋白等形式存在有關,有機硒形態目標化合物在水或1%硝酸溶液中的溶解度較低,這與曹玉嬪等[26]、陳貴宇等[27]的研究結果相一致。因此,選用蛋白酶K溶液作為提取試劑,繼續考察超聲提取時間、蛋白酶K溶液用量對總硒提取量的影響。

2.2.1 優化超聲提取時間

選取超聲提取時間5、10、20、30、40、50、60、80 min,每個超聲提取時間點設置6個平行,研究超聲提取時間與總硒提取量的關系,研究結果見圖4。在一定的超聲提取時間范圍內,總硒提取量與超聲提取時間成正比例關系。當超聲提取時間高于50 min,總硒提取量的增幅趨于平緩。因此,確定超聲提取時間為50 min。

圖4 超聲提取時間、蛋白酶K溶液用量與總硒提取量的關系

2.2.2 優化蛋白酶K溶液的用量

選取蛋白酶K用量0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL,每個蛋白酶K用量設置6個平行,研究探討蛋白酶K用量與總硒提取量的關系,研究結果見圖4。在一定的蛋白酶K用量范圍內,總硒提取量與蛋白酶K用量成正比例關系。當蛋白酶K溶液的用量大于1 mL,總硒提取量的增幅趨于平緩。因此,確定蛋白酶K的用量為1 mL。

2.3 方法學考察

分別配制質量濃度為0、5、10、20、30、40、50、80、100 μg/L的5種硒形態目標化合物的混合標準系列溶液,在優化好的實驗條件下對方法學指標(線性范圍、相關系數、檢出限、定量限、加標回收率及相對標準偏差)進行考察,實驗結果見表1、表2。由表1可知,5種硒化合物在5～100 μg/L的質量濃度范圍內線性良好,相關系數R均大于0.999。

表1 5種硒化合物的標準曲線線性參數及檢出限

表2 5種硒形態化合物的樣品加標回收率、相對標準偏差

在空白試劑中加入5 μg/L的硒形態化合物混合標準溶液,以3倍基線噪音測定5種硒化合物的檢出限,分別為SeCys20.16 μg/L、SeMC 0.23 μg/L、Se(Ⅳ) 0.20 μg/L、SeMet 0.71 μg/L、Se(Ⅵ) 1.15μg/L。取樣量為0.5 g,定容體積為10 mL,5種硒形態化合物的定量限分別為SeCys20.009 6 mg/kg、SeMC 0.014 mg/kg、Se(Ⅳ) 0.012 mg/kg、SeMet 0.043 mg/kg、Se(Ⅵ) 0.069 mg/kg。分別向富硒山茶油實際樣品中加入5、25、50 μg/L 3個濃度水平的5種硒形態化合物標準溶液,各自平行處理6個樣品。由表2可知,扣除樣品空白后,5種硒形態化合物的回收率為94.6%～113.1%,相對標準偏差(RSD)為1.86%～4.87%,均在5%以內。

2.4 實際樣品的測定結果

8個不同地區的富硒山茶油樣品中5種硒形態化合物的含量測定結果見表3。不同地區富硒山茶油中5種硒化合物的含量存在一定差異。宜春、銅仁富硒山茶油中含量最高的是甲基-硒代半胱氨酸,其次是硒酸鹽;高安、恩施、開陽、黔東南、瀏陽富硒山茶油中含量最高的是硒代蛋氨酸,衡陽富硒山茶油中含量最高的則是硒酸鹽。在8種富硒山茶油樣品中,宜春富硒山茶油中有機硒形態總量在總硒中的占比最高,高達72.4%。因有機形態硒化合物易被人體吸收利用,且無毒無害[22],表明宜春富硒山茶油可能更適合用于滿足人們的補硒需求。

3 結論

富硒山茶油作為市場流通的常見山茶油產品,其產品中的硒形態化合物含量已引起人們越來越多的重視和關注。我國現行標準DB 61/T 508.6—2011《富硒雙低菜籽油》[28](硒含量≥0.02 mg/kg)、DB 61/T 556—2018《富硒含硒食品與相關產品硒含量標準》[29](富硒食用油、油脂及其制品硒含量≥0.075 mg/kg)、DB 5115/T 17—2020《富硒農產品硒含量要求》[30](富硒油料及其副產品硒含量為0.05～0.50 mg/kg)均只明確富硒食品中總硒的最低含量要求,尚未明確富硒山茶油中硒形態化合物的最低含量,其中有機形態硒化合物由于易被人體吸收利用,且無毒害作用,常被作為人體補硒的重要食物攝入來源[22, 24-26]。因此,有必要對富硒山茶油中的硒形態化合物含量進行檢測和監控。本研究建立了超聲提取結合高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用測定富硒山茶油中5種硒形態化合物含量的方法。該方法前處理操作簡便快速,方法檢出限低,精密度及準確度良好,符合檢測要求,有較強的可行性和實用性,適用于富硒山茶油中5種硒形態化合物的快速測定。