固態發酵降解油茶餅粕中茶皂素工藝優化及成分的分析

羅彥玉, 王 磊, 鄒春霞, 陳江芬, 賈玉龍

(貴州大學釀酒與食品工程學院,貴陽 550025)

油茶餅粕,又稱油茶餅、餅粕,是油茶籽榨油后產生的副產品,據統計資料顯示其年產量高達400萬t[1,2]。餅粕中富含蛋白質、多糖和多酚,是一種極具經濟價值的潛在飼料來源[3, 4],但由于其存在質量分數15%～20%的茶皂素等抗營養因子,導致其僅被用作燃料焚燒,或者作為農業肥料,產生了嚴重的環境污染和資源浪費[2,5]。茶皂素已被證實對動物具有一定毒性,溫血動物每天的安全攝入量為50～150 mg/kg,這在一定程度上限制了油茶餅粕在蛋白質飼料中的應用[6]。此外由于茶皂素和單寧含量較高,會使餅粕味苦澀、動物適口性差,飼用效率低[7]。因此,高效降解茶皂素提高餅粕的附加值成為了目前此領域的研究熱點。與傳統的物理降解法、化學脫皂法相比,生物降解被認為是最高效且環保的處理方法,即利用微生物代謝來有效脫毒[8]。

已證實能夠降解油茶餅中茶皂素的主要有霉菌、細菌類,有研究表明芽孢桿菌和乳酸桿菌具有活性的皂素降解酶,能夠代謝降解毒性茶皂素[6]。其中芽孢桿菌因其培養條件溫和降解能力出色而備受關注,利用芽孢桿菌固態發酵是降解抗營養因子和大分子蛋白的有效途徑[9]。與此同時,蠟樣芽孢桿菌被證實是一種益生菌,對治療嬰幼兒腹瀉及腸道功能紊亂有一定作用[10];其不受顆粒飼料加工的影響,在飼料中添加該菌能明顯提升畜禽的飼料食用率來促進動物生長[11]。實利用前期篩選得到的1株可有效降解茶皂素的蠟樣芽孢桿菌,在優化其降解餅粕中茶皂素的固態發酵工藝后,系統分析發酵前后的成分變化,對其作為潛在飼料添加成分進行系統評估,進一步分析發酵前后的風味成分,確定其發酵餅粕作為動物飼料的適口性,以期增加其產品附加值,為油茶餅粕的深入開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶餅粕在常規冷榨產山茶籽油過程中產生。

蠟樣芽孢桿菌(簡稱N-4),前期課題組研究在條件篩選自然發酵油茶餅后分離純化所得,經鑒定后現保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏號為CCTCC M 2022624。

營養瓊脂、營養肉湯培養基;茶皂素標準品(≥ 98%);無水乙醇、香草醛、濃硫酸、氯化鈉、福林酚、碳酸鈉、鹽酸、蒽酮、氯化鋁等均為分析純。

1.2 儀器與設備

H2-16KR 型臺式高速冷凍離心機,L-8800 氨基酸自動分析儀,Spectra Max190 型光吸收酶標儀,JK9870 型全自動凱氏定氮儀,SCIENTZ-18N 冷凍干燥機,SB-800DT 超聲波清洗機,1708179 生化培養箱,LDZE-75KB-Ⅱ 高壓滅菌鍋,SW-CJ-2D 超凈工作臺。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

種子液:取保藏菌株斜面在平板上劃線,倒扣于37 ℃恒溫培養箱培養24～48 h,重復2次;挑單顆菌落于液體培養基在37 ℃、150 r/min的搖床中培養22 h。

樣品前處理:餅粕干燥粉碎過40目篩,稱樣按比例加蒸餾水攪拌均勻,121 ℃滅菌20 min。對照組除不接菌外其余處理完全一致,實驗中對照餅為對照組,發酵餅為實驗組。

1.3.2 茶皂素測定

提取采用密閉加熱浸提法[12];含量測定參照香草醛硫酸顯色法[13],略修改:取0.5 mL提取液,添加0.5 mL的香蘭素乙醇溶液(體積分數8%),于冰水浴中準確加入4 mL硫酸溶液(體積分數77%),混勻,60 ℃水浴10 min,取出冷至室溫,550 nm處測吸光度。標曲取1 mg/mL的茶皂素標準溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL,補蒸餾水至0.5 mL,同上加試劑測吸光度。

式中:c0為對照餅茶皂素質量分數;c為發酵餅茶皂素質量分數。

1.3.3 單因素條件設計

1.3.3.1 固態發酵初始條件的確定

pH自然,12 h翻樣1次,37 ℃接種10%種子液發酵48 h,完成后測定茶皂素含量,計算并比較各樣品的茶皂素降解率。

在初始條件的確定下,將初始水質量分數設置為70%、80%、90%、100%、110%、120%,滅菌結束冷卻后,接種子液進行發酵。

1.3.3.3 發酵溫度的確定

在初始條件及初始水質量分數確定的情況下,滅菌后的樣品接種子液,于25、28、28、31、34、37、40 ℃的發酵溫度下進行發酵。

1.3.3.4 接種量的確定

在初始條件及初始水質量分數、發酵溫度的確定下,將滅菌后的樣品分別接種2%、4%、6%、8%、10%、12%的種子液于恒溫培養箱進行發酵。

1.3.3.5 發酵時間的確定

在初始條件及初始水質量分數、發酵溫度、接種量的確定下,將滅菌處理后的油茶餅粕分別發酵12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h。

1.2 方法 觀察組和對照組均接受扶他林乳膠劑外擦治療：直接涂擦于患側膝關節，每日1次，每次2～3g，療程4周。觀察組在此基礎上加用體外沖擊波治療：采用廣州龍之杰公司生產的LGT-2510A型體外沖擊波進行治療，患者取仰臥位，標記患側膝關節周圍痛點，在痛點處涂抹超聲耦合劑，設置治療頻率10Hz，治療能量初始選擇2.5bar，根據患者耐受度調整能量，一般為2.5～4bar，在痛點處進行1000次沖擊，再選擇痛點周圍以緩慢移動的方式沖擊1000次，總計2000次沖擊。每周1次，共4周。

1.3.4 響應面實驗設計

以單因素實驗的分析結果為基礎,選擇影響較大的3個因素,將茶皂素降解率作為響應值,進一步利用3因素3水平進行常用于優化微生物發酵的工藝參數的Box-Behnken響應面設計。在最優條件下進行驗證實驗,結束后樣品干燥,粉碎過篩。

1.3.5 成分分析

1.3.5.1 基本成分分析

灰分測定參照GB 5009.4—2016;蛋白質測定參照 GB 5009.5—2016;脂肪測定參照 GB 5009.6—2016;粗纖維測定參照 GB/T 5009.10—2003;單寧測定參照常新民等[14]的方法;還原糖測定參照3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法。

1.3.5.2 氨基酸分析

樣品前處理參照Wen等[15]的方法:1 g樣品加50 mL 0.01 mol/L鹽酸超聲浸提30 min,搖勻過濾取上清液按1∶1比例加入8%磺基水楊酸,混勻靜置10 min,10 000 g下離心10 min,取上清液過0.22 μm膜上機。

1.3.5.3 主要活性成分分析

總糖采用蒽酮硫酸法:先進行總糖的提取和水解,取0.5 mL待測液,加蒸餾水至1 mL,置冰水浴5 min加4 mL蒽酮試劑,沸水浴10 min,冷卻至室溫放10 min于630 nm處測定吸光度。多糖參照苯酚-硫酸法[16]。

總酚參照Folin-Ciocalteau法[17],略微變化:1 g樣品,加10 mL 80%甲醇溶液搖勻于40℃超聲輔助提取1 h,8 000 r/min離心10 min,重復3次,取上清液定容至50 mL。取0.5 ml提取物與7.5 mL水混合;添加0.5 mL福林酚混勻;再添加1.5 mL Na2CO3溶液(20 mg/100 mL)于黑暗30 min,765 nm處記錄吸光度。標準曲線取0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL按本法操作。

總黃酮測定:樣品處理參照李桂珍等[18];含量測定參照Javed等[19],取1.0 mL提取物加0.3 mL硝酸鋁溶液(10 mg/100 mL)和0.3 mL亞硝酸鈉溶液(5 mg/100 mL),充分搖動后置黑暗中10 min;然后添加3.5 mL氫氧化鈉溶液(4 mg/100 mL)并定容至10 mL,黑暗中30 min,510 nm處記錄吸光度。蘆丁標準曲線取1 mg/mL的蘆丁標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL按本法操作。

1.3.5.4 風味分析

電子舌測定前需經過活化、校準和診斷等過程,基本參數:室溫25 ℃,樣品采集時間120 s、采集周期1 s、攪拌率1 r/s[20, 21]。樣品處理,2 g樣品加50 mL水混勻,超聲浸提60 min,8 000 r/min,4 ℃離心10 min,取上清液50 mL待測。

風味成分:樣品處理利用固相微萃取,取5 g樣品于20 mL頂空瓶中,加20 μL質量濃度為5 mg/L的2-辛醇作內標。將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分,于50 ℃吸附30 min,吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口,于250 ℃解吸3 min,同時啟動儀器采集數據。

1.4 數據處理

數據的顯著性和統計學分析使用軟件IBM SPSS 26.0,最終結果均表示為平均值±標準差,單因素和響應面利用Design-Expert 13軟件,圖形處理使用軟件Origin 2021。每個樣品進行實驗檢測時均至少取3組平行數據,顯著性差異P<0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

選擇發酵過程中可能對茶皂素降解影響率較大的4個因素進行單因素實驗,初始水質量分數、發酵溫度、接種量、發酵時間對茶皂素降解率的影響如圖1所示。在固態發酵中,水質量分數直接影響菌株能否吸收足夠的氧氣來保證良好生長[22]。圖1中水質量分數110%時,油茶餅會呈現一種疏松、透氣的狀態,菌株對茶皂素的降解率達到最高55.65%,其水質量分數較高可能是由于樣品過篩后吸水性好。當超過水質量分數110%時,油茶餅的狀態過于黏稠,不利于菌株生長,茶皂素降解率也隨之降低。結果表明較低的水質量分數會影響菌株的生長,菌株會缺水而生長不完全,導致茶皂素的降解率過低,而當水質量分數從70%逐漸增加至110%時,茶皂素降解率會增加。溫度被認為是影響微生物生長的所有生態生理參數的一個重要因素[23],對微生物的代謝和酶具有重要的調節作用[24]。溫度對茶皂素的降解能力有明顯影響,在整個溫度變化檢測過程中,隨著溫度的升高,N-4對茶皂素的降解率逐漸增大至較高水平然后減小。結果表明,其中在31 ℃時N-4對茶皂素的降解率達到最大值56.20%,可能這是N-4的最適生長環境,此時微生物旺盛,降解效果好,而超過或低于此溫度都會導致菌株對茶皂素的降解率降低。低溫不利于微生物生長,高溫會使細菌分泌的蛋白質變性和酶失活[25],從而使N-4菌株降解茶皂素的速率下降。

圖1 初始水質量分數、發酵溫度、接種量、發酵時間對茶皂素降解率的影響

接種量為2%～10%之間時,接種量越大降解率越高,這可能是由于細菌數量的增加加速了茶皂素降解。合適的增加接種量會促使菌株通過種內互助的方式快速適應新環境,當接種量為10%時,茶皂素降解率最高達到60.87%。當接種量過高(>10%),會導致氧氣不足和營養物質缺乏等嚴重的負面影響[26],茶皂素的降解率將停止增加甚至降低;而接種量過低會導致菌株生物量低達不到好的降解作用。由圖可知,初始階段時降解率從12 h的46.85%升高至到48 h的67.89%,在隨后的48 h中保持較高的降解率且逐漸穩定,最后又有下降的趨勢。這些結果表明菌株N-4隨時間的增加其降解茶皂素的能力也增強,當發酵時間到48 h時,茶皂素降解率達到最高。一開始降解率不斷上升可能是因為菌株把茶皂素當成營養物質供自己快速生長,隨后菌株生長穩定,其降解性能也變得平緩。

2.2 響應面實驗結果

單因素實驗中,發酵時間在48 h時得到最高的茶皂素降解率,之后趨于平緩,考慮到節約時間則確定發酵時間為48 h。故利用初始水質量分數、發酵溫度、接種量進行響應面優化,Box-Bnhnken響應實驗設計與結果見表1。

表1 Box-Bnhnken響應試驗設計與結果

利用Design-Expert 13軟件對表1中的17組實驗數據進行二次項回歸擬合,得到Y值與3個因素的回歸模型為:Y=74.30-0.02X1+0.61X2+0.18X3-3.41X1X2-0.56X1X3-4.62X2X3-4.71X12-11.71X22-2.83X32。回歸方程方差分析見表2。

表2 回歸方程方差分析

表2中回歸模型Y值P<0.000 1,極顯著,可以用來擬合3個因素對茶皂素降解率的影響。同時失擬項,不顯著(P>0.05),決定系數R2=0.989 6,說明模型與實際實驗結果擬合性良好,這表明可利用此模型預測實驗結果。因素作用中二次項X12,X22,X32對茶皂素降解率的影響極顯著,交互作用中X1X2,X2X3對茶皂素降解率的影響也極顯著,其他X1X3、X1、X2、X3對其不顯著。各因素對響應值的重要性看F值,可得影響茶皂素降解率的順序為:發酵溫度>接種量>初始水質量分數。

最后由軟件分析及考慮到實際操作得到優化后的最佳工藝為初始水質量分數109.9%,溫度31.1 ℃,接種量10.0%,發酵時間48.0 h,此時預測的茶皂素降解率為74.31%。進行驗證實驗后得降解率76.04%,與模型相差不大,吻合良好,說明響應面法優化降解油茶餅中茶皂素的發酵工藝可行。

2.3 發酵前后成分分析

2.3.1 基本成分

油茶餅發酵前后基本成分的測定結果見表3。與對照餅相比,發酵餅中抗營養因子茶皂素和單寧分別顯著降低76.04%和12.90%,此時油茶餅中僅含有5.66%的茶皂素,按小比例混入飼料中,可能不會對溫血動物產生危害。發酵后粗蛋白增加45.73%,達到12.97%,與常規的能量飼料(玉米粉、米糠等)相當,這充分說明油茶餅可用為蛋白質飼料,而不只是作飼料添加劑殺死多余魚類和有害昆蟲[27];而含量的增加可能是由于N-4菌株利用餅粕中部分營養成分合成菌體蛋白所引起的。粗脂肪質量分數由9.40%增加到11.94%,還原糖和粗纖維質量分數分別提高和降低36.90%和18.12%,灰分含量無差異變化,這些結果與前人發現的發酵會影響營養成分,如脂肪、糖類和蛋白質會增加、粗纖維會降低的結果大致一樣[13,28]。

表3 油茶餅發酵前后基本成分的測定結果

2.3.2 主要活性成分

經N-4菌株發酵后,油茶餅發酵前后主要活性成分變化如圖2所示?？偺呛投嗵堑暮匡@著性下降,分別降低了26.86%和26.63%,這是由于生長代謝過程中,微生物會吸收糖類物質提供自身營養所需,所以造成了糖類物質減少[29]?？偡淤|量分數由20.90 mg/g減少至17.85 mg/g,比對照餅降低了14.59%左右,這可能是由于菌株發酵的工藝或者放置環境差異的引起的,菌株良好生長時,大量的繁殖會代謝產生各種酶系,這使多酚等大分子物質被分解[30]。有研究證明油茶餅粕在不同條件下多酚的含量都會顯著降低,如高溫、酸、堿過量等,并且多酚會對不同的光照度敏感[31]。而結果中總黃酮含量的顯著增加,可能是因為大量的酶促反應促進了黃酮類物質的釋放[32]。發酵餅中仍含有137.74 mg/g的多糖和17.85 mg/g的總酚,且黃酮增加了13.62%,表明餅粕經發酵后具有較大的潛在利用價值。

注:圖中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

2.3.3 游離氨基酸組成

油茶餅發酵前后氨基酸含量的變化見表4,油茶餅中共有16種氨基酸,其中有7種人體必需氨基酸,與劉曉庚等[33]研究的結果相對一致。發酵后氨基酸總質量分數雖然由75.71 mg/g降至69.76 mg/g,減少了7.86%,但其總必需氨基酸顯著增加了4.89%,達到14.38 mg/g,占比20.61%,可推斷芽孢桿菌發酵餅粕可能會產生較多的必需氨基酸,提升其營養價值。這說明微生物發酵是改善餅粕中氨基酸均衡性,提升營養質量,使其滿足動物需求的有效方法之一[34]。蛋氨酸顯著提高了21.5倍,可能是由于發酵進行中營養成分的水解分解導致氨基酸含量增加[35],而組氨酸和精氨酸分別顯著降低33.33%、15.27%,其余氨基酸變化不大,尤其是半胱氨酸和纈氨酸,幾乎無變化?？偘被岷肯陆?是因為最佳發酵條件下,營養物質促進了芽孢桿菌的生長繁殖,造成對氨基酸的消耗增大,從而促進風味物質的生成和美拉德反應,使得其含量下降。

表4 油茶餅發酵前后氨基酸含量的變化

2.3.4 風味評價

2.3.4.1 電子舌檢測結果

油茶餅用于飼料加工往往引起獨特的氣味對動物的影響而降低其實際應用價值,而油茶餅發酵時味覺變化是客觀評價其在發酵前后對于飼用價值的重要評價指標。油茶餅發酵前后的電子舌傳感器響應雷達圖如圖3所示,包含豐富度、咸味、酸味、苦味、澀味、回味-A、回味-B和鮮味。與對照相比,發酵餅酸味的響應值增大,豐富度、苦味、澀味響應值均降低,其余無明顯變化。酸味的變化可能是碳水化合物的代謝產生酸味物質導致的,這與微生物活動息息相關[37];苦味和澀味的降低是因為發酵后油茶餅中茶皂素、單寧等含量降低而引起對應的苦味、澀味變化,這與表3中的成分變化相互對應,也與表4中的苦味氨基酸(Arg、His等)含量顯著下降呈現相同趨勢。結果表明,發酵可改善不良屬性,為餅粕產品提供良好的口感,可為后期的飼用價值奠定基礎。

圖3 油茶餅發酵前后的電子舌傳感器響應雷達圖

2.3.4.2 風味物質分析

揮發性成分往往決定了餅粕發酵產物對于動物飼用的實際效果,而在餅粕發酵的過程中,微生物的相互作用使發酵培養基中揮發性風味物質發生一定變化,因為其影響了參與食品發酵的微生物代謝行為[38]。發酵過程中,芽孢桿菌類菌株可產生多種酶類分解生物大分子形成風味物質前體,可以促進風味物質的產生。油茶餅發酵前后風味成分分析鑒定結果見表5,相比對照餅,發酵餅新增7種風味物質,其中4-異丙氧基-2-丁酮和2,2,3,3-四甲基丁烷增加尤為明顯。烷烴類中十二烷、十六烷等物質明顯增加,總的提升了11.27倍,還有1,3-二叔丁基苯從2.31%到5.16%,提升了1.23倍。此外,酚類和雜環類物質的含量分別增加了200%和142%;醛酮類含量有增有降,總的變化不大;酸和酯類含量略有增加,但醇類含量顯著下降。酚、酸和雜環類含量的提高主要源于愈創木酚、苯酚、乙酸和2-乙烷基-3,5-二甲基吡嗪等的產生,其中吡嗪類物質所占比例較大,可有效增加風味成分豐富度[40]。這些結果與已有研究一致,說明經過發酵的餅粕會散發出怡人的香味,適合生產生物發酵飼料[41, 42]。

表5 油茶餅發酵前后風味成分分析鑒定結果

3 結論

研究選用N-4菌株進行餅粕中茶皂素降解的固態發酵實驗,在單因素實驗和響應面設計的順利進行下,得到了固態發酵降解餅粕中茶皂素的最佳工藝條件為水質量分數109.9%,溫度31.1 ℃,接種量10.0%,發酵時間48.0 h,此時茶皂素降解率為76.04%。發酵完成后,分析了物質變化,其中蛋白質、總黃酮、總必需氨基酸等均顯著增加,總糖、茶皂素、單寧等均顯著下降。通過電子舌和風味結果,證明了油茶餅粕經發酵后苦味、澀味明顯減少;發現了發酵前后餅粕風味物質產生了明顯差異。