馬鈴薯蛋白酶抑制劑酶解產(chǎn)物超濾組分的抗氧化活性與結(jié)構(gòu)特征

李蘇紅, 趙起越, 于思琦, 楊 慧, 鄒沅辛, 陳 晨, 李拖平

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué),沈陽(yáng) 110866)

馬鈴薯是我國(guó)第四大主食作物,其營(yíng)養(yǎng)研究日益受到關(guān)注。但一方面由于馬鈴薯中蛋白質(zhì)含量較少,僅占鮮質(zhì)量的1.6%～2.1%,對(duì)其相關(guān)的理論與應(yīng)用研究的重視不足,另一方面,作為馬鈴薯主要深加工產(chǎn)品的淀粉生產(chǎn)中每噸產(chǎn)物生產(chǎn)3.5 t富蛋白廢液,直接排放將會(huì)造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[1、2]。在馬鈴薯全蛋白中,馬鈴薯蛋白酶抑制劑(PPIs)約占總蛋白質(zhì)量的50%,一直被作為抗?fàn)I養(yǎng)因子來(lái)研究,近年來(lái)其功能性如抗菌性[3]、抗氧化活性、抗腫瘤[4]等受到關(guān)注。前期的研究發(fā)現(xiàn),PPIs對(duì)具有一定的抗氧化能力,但對(duì)一些自由基的清除能力較弱,如羥自由基[4]。酶水解是從蛋白質(zhì)分子中釋放抗氧化肽的有效方法,大分子蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解后變成小分子量的肽甚至氨基酸,暴露出更多能與氧化劑反應(yīng)的活性肽或者氨基酸,進(jìn)而提高其抗氧化活性[5]。同時(shí),酶解后產(chǎn)物的分子量變小,粒徑降低有助于提高其生物可及性[6]。但是PPIs作為酶抑制劑,對(duì)某些酶的活性具有抑制作用,因此可以采用物理技術(shù)(如超聲、紅外照射、微波加熱)進(jìn)行預(yù)處理,打開(kāi)蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu),暴露出更多的酶切位點(diǎn),有助于提高酶解效率[7]。雖然紅外光照射、微波加熱、超聲波均是通過(guò)引入額外能量快速酶解的策略,但前兩者過(guò)高功率下具有一定危險(xiǎn)性,所以實(shí)驗(yàn)選擇超聲波[8]。

研究旨在提高PPIs 的抗氧化能力,采用超聲輔助酶解法制備馬鈴薯蛋白酶抑制劑酶解產(chǎn)物(PPIHs),并對(duì)其進(jìn)行超濾分離,分析PPIHs及超濾各組分的抗氧化活性和結(jié)構(gòu)特性,為馬鈴薯蛋白資源的開(kāi)發(fā)和利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯、大豆油;蛋白酶K(30 U/mg);DPPH、ABTS;8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)、水楊酸、亞油酸,化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CR21N高速冷凍離心機(jī),DYCP-31DN電泳儀,VCX-750超聲波細(xì)胞破碎儀,Scientz-/ZN/A冷凍干燥機(jī),STIGE-2傅里葉變換紅外光譜分析儀,3 000Zetasizer nano ZS納米粒度及Zeta電位分析儀,F-7000熒光分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 制備馬鈴薯蛋白酶抑制劑

參照Liu等[9]的方法制備馬鈴薯蛋白酶抑制劑(PPIs)。在馬鈴薯汁中加入飽和度為40%的硫酸銨,攪拌2.5 h使其充分溶解,10 000 r/min離心20 min后取沉淀用水進(jìn)行復(fù)溶得到馬鈴薯全蛋白,將其溶液的pH調(diào)到3.0后靜置0.5 h后再離心除去馬鈴薯糖蛋白Patatin,Patatin是一種馬鈴薯儲(chǔ)藏蛋白,約占馬鈴薯可溶性塊莖蛋白的40%,由于馬鈴薯品種的不同,其分子質(zhì)量分布在40～45 ku范圍內(nèi)[10]。再將沉淀在80 ℃中加熱10 min除去高分子量蛋白和剩余的Patatin,離心后取上清透析36 h,冷凍干燥。

1.3.2 超聲輔助酶解馬鈴薯蛋白酶抑制劑

稱(chēng)取適量PPIs粉末溶于蒸餾水中(5 mg/mL),在超聲波功率為450 W下超聲30 min,在底物質(zhì)量濃度為5 mg/mL,酶底比(酶與底物濃度的比值)為5%,酶解時(shí)間為2.5 h,酶解溫度為58 ℃的條件下,用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液至蛋白酶K的最適酶解pH 8.0,再將底物置于58 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%蛋白酶K進(jìn)行酶解2.5 h。酶解結(jié)束后置于沸水浴中滅活5 min,冷卻后,8 000 r/min離心5 min,收集上清液并冷凍干燥成粉備用。

1.3.3 超濾分離抗氧化活性肽

將500 mg的PPIHs配成0.1 mg/mL的溶液放入不同截留分子質(zhì)量的超濾離心管內(nèi)進(jìn)行4 000r/min離心10 min,重復(fù)4～5次,使分子量的截留值為10 ku和3 ku,得到>10 ku(PPIHs-Ⅰ)、3～10 ku(PPIHs-Ⅱ) 和<3 ku(PPIHs-Ⅲ) 3個(gè)不同分子量的組分,冷凍干燥后,其質(zhì)量分別為m1、m2和m3,并放在-20 ℃保存。使用式(1)～式(3)計(jì)算各組分的得率:

PPIHs-Ⅰ的得率=(m1/500)×100%

(1)

PPIHs-Ⅱ的得率=(m2/500)×100%

(2)

PPIHs-Ⅲ的得率=(m3/500)×100%

(3)

1.3.4 Tricine-SDS-PAGE 分析

根據(jù)Liu等[9]的方法,采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)15.5%分離膠和4.0%濃縮膠進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE,分析馬鈴薯蛋白酶抑制劑及其酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布。

1.3.5 酶解產(chǎn)物的理化性質(zhì)

1.3.5.1 溶解度

參照Kim等[11]方法并做修改。將PPIHs溶于蒸餾水中配制成1%(質(zhì)量濃度)的溶液,用1 mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH,使用磁力攪拌器在室溫下攪拌2 h后,以4 000 r/min離心10min。倒出上清液并通過(guò)Whatman#4濾紙。濾液用于測(cè)量總氮含量。溶解度計(jì)算見(jiàn)式(4)。

溶解度=(TNs/TNi)×100%

(4)

式中:TNs和TNi分別是1%的PPIHs及其濾液中氮含量。

1.3.5.2 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

參照Liu等[9]方法并加以修改。將30 mL(V0)的PPIHs(10 mg/mL)溶液在均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min的速度攪拌2 min,然后馬上移到200 mL量筒里,迅速記下此時(shí)泡沫的體積為V1,靜置0.5 h后,再記錄一次泡沫的體積為V2,根據(jù)式(5)和式(6)分別計(jì)算起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

起泡性=(V1-V0)/V0×100%

(5)

泡沫穩(wěn)定性=(V2-V0)/V1×100%

(6)

式中:V0為未處理體積;V1為處理后的體積;V2為靜止后的體積。

1.3.5.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性

參照Liu等[9]的方法,并加略微調(diào)整。將不同pH的PPIHs溶液(10 mg/mL)與大豆油按照3∶1的比例用內(nèi)切式勻漿機(jī)以10 000 r/min的速度攪拌2 min。利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% SDS溶液,把樣品溶液再稀釋250倍,在500 nm處測(cè)定吸收度為A,15 min后再測(cè)1次該溶液的吸光度為A15,用0.1% SDS溶液調(diào)零。使用式(7)和式(8)分別計(jì)算乳化性和乳化穩(wěn)定性:

乳化性/(m2/g)=[(2×2.303)/C×(1-ψ)×10 000]×A×N

(7)

乳化穩(wěn)定性=A15/A×100%

(8)

式中:C為樣品的質(zhì)量濃度/g/mL;ψ為油的體積分?jǐn)?shù);N為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.6 體外抗氧化活性的測(cè)定

1.3.6.1 羥自由基的清除能力

參照Liu等[9]方法略作修改,在試管中依次加入1 mL的樣品溶液、FeSO4溶液(9 mmol/L)、H2O2(8.8 mmol/L)和乙醇-水楊酸溶液(9 mmol/L),然后放在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)15 min,4 500 r/min離心5 min,在510 nm測(cè)定吸光度AX。空白組用蒸餾水取代PPIHs溶液,吸光度為A0。樣品對(duì)照組用蒸餾水取代H2O2,吸光度為AX0。使用式(9)計(jì)算羥自由基清除率:

羥自由基清除率=(A0+AX0-AX)/A0×100%

(9)

1.3.6.2 DPPH自由基的清除能力

參照Liu等[9]方法略作修改,分別吸取同體積的樣品溶液和0.04 g/L的DPPH溶液加入試管中,混勻后馬上放在25 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)30 min,在4 500 r/min條件下離心10 min后放在517 nm測(cè)吸光度,為AX?？瞻捉M用無(wú)水乙醇取代PPIHs溶液,吸光度為A0。樣品對(duì)照組用無(wú)水乙醇取代DPPH溶液,吸光度為AX0。其中無(wú)水乙醇為參比溶液。使用式(10)計(jì)算DPPH自由基清除率:

DPPH自由基清除率=(A0+AX0-AX)/A0×100%

(10)

1.3.6.3 ABTS自由基的清除能力

參照Liu等[9]方法略作修改,將樣品溶液和 ABTS工作液按照體積比為1∶4加入試管中,反應(yīng)6 min后在734 nm處測(cè)吸光度為A?？瞻捉M用95%乙醇取代PPIHs溶液,吸光度為A0。使用式(11)計(jì)算ABTS自由基清除率:

ABTS自由基清除率=(A0-A)/A0×100%

(11)

1.3.6.4 油脂氧化抑制作用

參照 Liu等[9]方法略作修改。先制備亞油酸體系:500 μL亞油酸溶于30 mL 0.2 mol/L pH為7.0的PBS并超聲波10 min;再稱(chēng)取1.5 g TCA,0.038 g TBA,0.21 mL濃鹽酸分別溶于10 mL蒸餾水中,用來(lái)制備TCA-TBA-HCl溶液。

在試管分別依次加入2 mL的樣品溶液、2 mL亞油酸分散體系和2 mL 0.4 mmol/L的FeSO4溶液, 在37 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)1 h,再向試管中加入4 mL 配好的TCA-TBA-HCl溶液,混勻后煮沸15 min, 冷卻后4 500 r/min離心10 min,在532 nm處測(cè)上清液的吸光度為As。對(duì)照組用蒸餾水取代PPIHs溶液,吸光度為Ac。按照式(12)計(jì)算油脂氧化抑制率:

油脂氧化抑制率=(AC-AS)/AC×100%

(12)

1.3.7 不同加工條件對(duì)PPIHs抗氧化能力穩(wěn)定性的影響

1.3.7.1 pH對(duì)抗氧化能力的影響

參照Gao等[12]方法略作修改,將PPIHs分別溶于pH為2、4、6、8、10的PBS緩沖溶液中配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的樣品溶液,放于4 ℃靜置1 h后,測(cè)定其體外抗氧化能力的變化趨勢(shì)。

1.3.7.2 溫度對(duì)抗氧化能力的影響

參照Yu等[13]方法略作修改,將質(zhì)量濃度為5 mg/mL的PPIHs溶液,在20、40、60、80、100 ℃下保溫1 h后,測(cè)定其體外抗氧化能力的變化趨勢(shì)。

1.3.8 平均粒徑和Zeta電位的測(cè)定

將樣品配制成1 mg/mL的溶液以待測(cè)定。在石英比色皿樣品池中加入一定的待測(cè)液,并使其無(wú)氣泡。放入Zeta電位與粒度分析儀,設(shè)置相應(yīng)參數(shù),等待120 s至樣品溫度達(dá)到平衡(25 ℃),開(kāi)始測(cè)定樣品的粒徑分布和Zeta電位。

1.3.9 紫外吸收光譜測(cè)定

參照鄭召君等[14]方法并略作修改。將樣品溶于蒸餾水中配制成濃度為0.10 mg/mL的溶液,以蒸餾水作為空白對(duì)照,掃描波長(zhǎng)范圍為200～380 nm,記錄紫外掃描圖譜。

1.3.10 傅里葉紅外光譜測(cè)定

參照曾琪等[15]方法并略作修改。稱(chēng)取10 mg樣品與1 g的溴化鉀粉末混合后壓片,把紅外光譜儀分辨率設(shè)置為 4 cm-1,掃描次數(shù)設(shè)置為32次,掃描波數(shù)譜段范圍設(shè)置為400～4 000 cm-1,再進(jìn)行測(cè)定。

1.3.11 外源性熒光光譜測(cè)定

參考Evangelho等[16]方法并略作修改。先將樣品溶于10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的溶液,而后在1.5 mL樣品稀釋溶液中加入20 μL 8 mmol/L 8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS),將熒光分光光度計(jì)的掃描波長(zhǎng)范圍設(shè)置成400～700 nm,激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm,狹縫寬度設(shè)置成5.0 nm后進(jìn)行掃描。

1.3.12 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,實(shí)驗(yàn)分析采用Origin 8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖表處理;統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用 SPSS 19.0 軟件,多組均數(shù)比較采用單因素方差分析中Ducan進(jìn)行顯著性分析,以P<0.05表示兩者之前存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPIHs的理化性質(zhì)

PPIHs的溶解度、起泡性和泡沫穩(wěn)定性以及乳化性和乳化穩(wěn)定性如表1所示。PPIHs在pH為2～10范圍內(nèi)具有良好的溶解性,與前期研究中獲得PPIs相比[9],溶解度增加了10%～20%。PPIHs的起泡性較好,但在pH=6時(shí)起泡性急劇降低,可能因?yàn)榇藭r(shí)蛋白質(zhì)之間的靜電斥力增加,阻礙了蛋白質(zhì)在空氣-水界面的吸附[17]。無(wú)論在酸性環(huán)境下還是堿性環(huán)境中,酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性很低,可能是因?yàn)樵谒嵝曰驂A性條件下,具有相同電荷類(lèi)型的離子濃度增加,由于肽通過(guò)離子之間的排斥作用,以及微觀肽無(wú)法保持穩(wěn)定的泡沫使蛋白質(zhì)水解物的泡沫穩(wěn)定性下降[18]。

通過(guò)乳化性和乳化穩(wěn)定性可以表征蛋白質(zhì)的乳化性能,蛋白質(zhì)在水/油混合過(guò)程中吸附在油滴界面降低其界面張力,乳化作用的大小主要由蛋白質(zhì)分子鏈內(nèi)部分布的親水或疏水基團(tuán)所決定的[19]。PPIHs在不同pH條件下的乳化性和乳化穩(wěn)定性存在顯著差異(P<0.05)。與PPIs[9]相比,酶解后蛋白質(zhì)的乳化性和乳化穩(wěn)定性得到明顯的改善?？赡芤?yàn)樵诿附夂?蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,具有較高溶解度和較低分子尺寸的水解產(chǎn)物能在油-水界面中擴(kuò)散和擴(kuò)散,此外,暴露的疏水基團(tuán)改善了脂質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用,使水解產(chǎn)物的乳化性增強(qiáng)[20]。

2.2 PPIHs的抗氧化穩(wěn)定性

2.2.1 溫度對(duì)PPIHs抗氧化能力的影響

食品加工過(guò)程中,熱處理是最常見(jiàn)的方法之一,討論P(yáng)PIHs 的耐熱性對(duì)其應(yīng)用具有重要的意義。圖1分析了PPIHs 經(jīng)過(guò)不同溫度(20～100 ℃)保溫1 h后其抗氧化活性的變化。結(jié)果表明,溫度在20～80 ℃區(qū)間時(shí),PPIHs的抗氧化能力穩(wěn)定性比較好;當(dāng)溫度高于80 ℃時(shí),其抗氧化穩(wěn)定性顯著降低。加熱處理在一定程度上改變了抗氧化肽的空間結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致樣品的抗氧化能力發(fā)生變化[21]。

圖1 溫度對(duì)PPIHs抗氧化活性的影響

2.2.2 pH對(duì)PPIHs抗氧化能力的影響

pH對(duì)PPIHs抗氧化穩(wěn)定性的影響如圖2所示。PPIHs對(duì)DPPH的清除能力在pH為2～8范圍內(nèi)穩(wěn)定,大于8以后急劇下降?？赡苁且?yàn)樵趬A性條件下肽發(fā)生消旋或者脫酰胺反應(yīng)導(dǎo)致肽鏈構(gòu)象發(fā)生變化,從而影響其抗氧化活性;而在酸性環(huán)境中,肽的極性氨基酸會(huì)暴露出來(lái),阻礙疏水性氨基酸的反應(yīng)[22]。PPIHs在脂質(zhì)氧化體系中的抗氧化能力及對(duì)-OH自由基的清除能力在pH 2～10范圍內(nèi)比較穩(wěn)定。而酶解產(chǎn)物在酸性條件下對(duì)ABTS自由基的清除能力比較差,但在堿性條件下比較好,這與玉米抗氧化肽[23]的結(jié)果相似,而牛慧慧等[24]對(duì)pH為蛋清抗氧化肽的影響進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)在堿性條件下不利于蛋清抗氧化肽的抗氧化活性的保持。

圖2 pH對(duì)PPIHs抗氧化活性的影響

2.3 酶解產(chǎn)物的超濾分離

由圖3a可以看出經(jīng)酶解后PPIHs條帶增多,分子質(zhì)量組分比較復(fù)雜,進(jìn)行純化比較困難。為了研究分子量大小與結(jié)構(gòu)之間的區(qū)別,以及對(duì)其抗氧化功能的影響,通過(guò)超濾技術(shù)將酶解產(chǎn)物分成PPIHs-Ⅰ、PPIHs-Ⅱ和PPIHs-Ⅲ3種不同分子質(zhì)量大小的組分。與PPIs相比,PPIHs的分子質(zhì)量變小,說(shuō)明分子質(zhì)量大的蛋白被水解,同時(shí)產(chǎn)生分子質(zhì)量在6.5～14.4 ku的酶解產(chǎn)物,可能下面還存在一些小于3.3 ku的小分子肽段沒(méi)有跑出來(lái)?xiàng)l帶。超濾后,大于10 ku酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量在10.0 ku以上;3～10 ku組分的電泳圖中的條帶分別在14.4 ku以下;<3 ku的超濾組分在Tricine-SDS-PAGE電泳圖中體現(xiàn)不出來(lái)。圖3b為超濾后各組分的提取率,其中PPIHs-Ⅰ的提取率最高為42%,其次是PPIHs-Ⅲ、PPIHs-Ⅱ。

表2 酰胺Ⅰ帶擬合PPIs、PPIHs、PPIHs-Ⅰ、PPIHs-Ⅱ和PPIHs-Ⅲ的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成

注:圖3中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),余同。

2.4 超濾各組分的粒徑分布和平均粒徑

圖4為超濾各組分的粒徑分布曲線和平均粒徑圖。結(jié)果表明,PPIs的平均粒徑為(1 071.7±18.3)nm,在粒徑分布中可以觀察到2個(gè)峰,一個(gè)較小的峰分布在100～1 000 nm之間,另一個(gè)較大的峰分布在1 000～10 000 nm之間。相比之下,酶解將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為分子尺度較小的蛋白質(zhì)、肽或氨基酸,PPIHs的平均粒徑為(423.3±3.9)nm,顯著(P<0.05)降低至納米級(jí),其粒徑分布在100～10 000 nm之間,其主峰分布在600～700 nm,有一個(gè)小峰分布4 000～6 000 nm之間,可能是未水解的蛋白;與PPIHs 相比,PPIHs-Ⅱ 和PPIHs-Ⅲ的平均粒徑顯著(P<0.05)下降,而PPIHs-Ⅰ的平均粒徑顯著增加,可能因?yàn)榉肿恿枯^大的蛋白集中出現(xiàn)在此部分,導(dǎo)致平均粒徑略有上升。經(jīng)過(guò)酶解和超濾,PPIs的平均粒徑顯著降低,可能會(huì)促進(jìn)腸道的吸收,使其功能性得到充分發(fā)揮,滿(mǎn)足人體對(duì)其持續(xù)需求[25]。

圖4 超濾各組分的粒徑分布曲線和平均粒徑

2.5 超濾各組分的Zeta電位

蛋白質(zhì)的Zeta電位是對(duì)水溶液中蛋白質(zhì)的表面凈電荷的表征,這種表面凈電荷是由于蛋白質(zhì)表面官能團(tuán)的電離或者從溶液中吸附到蛋白質(zhì)表面的離子引起的[26]。圖5為超濾后各組分的Zeta電位變化情況。超濾后各組分的Zeta電位均為負(fù)值,說(shuō)明其表面均帶有負(fù)電荷。這可能與蛋白表面暴露出可電離氨基和羧基的數(shù)量變化有關(guān),如燕麥蛋白、牡丹籽蛋白和鷹嘴豆分離蛋白的水解物[14,27,28]中也有相似的結(jié)果。與PPIs相比,PPIHs的Zeta電位絕對(duì)值略有提高,水解過(guò)程中釋放的帶負(fù)電荷的氨基酸略多于帶正電荷的氨基酸,可能是導(dǎo)致起泡性較好的原因。與PPIHs相比,PPIHs-I的 Zeta電位的絕對(duì)值顯著增加,PPIHs-Ⅲ的 Zeta電位的絕對(duì)值無(wú)顯著變化,而PPIHs-Ⅱ電位的絕對(duì)值顯著下降(P<0.05)。Zeta電位的絕對(duì)值越大表明有大量的靜電斥力使顆粒之間不易發(fā)生聚集,顆粒呈散落分布狀態(tài)[29],會(huì)提高PPIHs-Ⅰ溶液的穩(wěn)定性。

圖5 各組分的Zeta電位

2.6 超濾各組分的抗氧化活性

超濾后各組分的抗氧化活性如圖6所示。與PPIs相比,PPIHs的4種抗氧化指標(biāo)均顯著提高(P<0.05),可能由于酶解打開(kāi)并破壞蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu),暴露出更多能與氧化劑反應(yīng)的活性肽或者氨基酸[5]。在PPIHs各組分中,PPIHs-Ⅰ對(duì)ABTS自由基的清除能力最強(qiáng),可能由于具有清除ABTS自由基能力的物質(zhì)大部分存在PPIHs-Ⅰ中;PPIHs-Ⅱ的油脂氧化抑制能力以以及-OH和DPPH自由基的清除能力較強(qiáng),這可能是因?yàn)镻PIHs-Ⅱ中暴露出較多的疏水性氨基酸殘基,可以接觸并捕捉疏水性自由基[30]。

圖6 各組分的Zeta電位

2.7 超濾各組分的紫外全波長(zhǎng)掃描

圖7 PPIs、PPIHs、PPIHs-Ⅰ、PPIHs-Ⅱ和PPIHs-Ⅲ的紫外波長(zhǎng)掃描

2.8 超濾各組分的傅里葉紅外光譜

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)可反映蛋白質(zhì)的官能團(tuán)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)在1 600～1 700 cm-1之間,與酰胺Ⅰ帶重疊,使用peakfit軟件擬合出在酰胺-Ⅰ區(qū)域的峰位,根據(jù)峰的中心位置將其分配到相應(yīng)的結(jié)構(gòu)中,1 600～1 639 cm-1譜帶屬于β-折疊;1 640～1 650 cm-1譜帶屬于無(wú)規(guī)卷曲;1 651～1 660 cm-1譜帶屬于α-螺旋;1 661～1 700 cm-1譜帶屬于β-轉(zhuǎn)角[33]。

圖8 PPIs、PPIHs、PPIHs-Ⅰ、PPIHs-Ⅱ和PPIHs-Ⅲ的傅里葉紅外光譜

選取1 600～1 700 cm-1波段進(jìn)行曲線擬合,經(jīng)去卷積化處理,得到PPIs、PPIHs以及PPIHs-Ⅰ、PPIHs-Ⅱ和PPIHs-Ⅲ的酰胺-Ⅰ帶圖譜,對(duì)其進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)成分分析,得到蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量信息,見(jiàn)表2。PPIs的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為主,相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為31.91%和29.13%。經(jīng)酶解后,PPIHs的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角為主。與PPIs相比,PPIHs的無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量提高,β-折疊含量和α-螺旋相對(duì)減少。蛋白經(jīng)酶解后由有序變得無(wú)序,穩(wěn)定蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和靜電作用發(fā)生變化,使其空間結(jié)構(gòu)遭到破壞[34],這也可能是抗氧化活性提高的原因。與PPIHs相比,PPIHs-Ⅰ、PPIHs-Ⅱ和PPIHs-Ⅲ的β-折疊和α-螺旋增加,無(wú)規(guī)卷曲減少;PPIHs-Ⅱ的β-轉(zhuǎn)角增加,而PPIHs-Ⅰ和PPIHs-Ⅲ的β-轉(zhuǎn)角減少。

2.9 超濾各組分的熒光光譜

蛋白質(zhì)的疏水性殘基大部分位于蛋白質(zhì)內(nèi)部,酶解使蛋白分子展開(kāi),暴露出更多疏水性氨基酸,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面疏水性發(fā)生變化[35]。由圖9可見(jiàn),與 PPIs 相比,PPIHs 熒光強(qiáng)度增加,這表明經(jīng)過(guò)酶解處理后蛋白質(zhì)分子內(nèi)部振動(dòng)增強(qiáng),維系蛋白空間結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵遭到破壞,暴露出蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基,導(dǎo)致疏水性增強(qiáng)。正是由于更多的疏水性氨基酸殘基存在,才能使其在均質(zhì)的過(guò)程中迅速擴(kuò)散并瞬間吸附到新形成的油滴表面,進(jìn)而增加水解產(chǎn)物的乳化性[30]。與PPIHs相比,PPIHs-Ⅰ 的熒光強(qiáng)度下降,可能因?yàn)榇蟛糠质杷园被釟埢嬖谟诜肿恿枯^小的酶解物中,而 PPIHs-Ⅱ 和 PPIHs-Ⅲ 的熒光強(qiáng)度增加,進(jìn)一步說(shuō)明小于10 ku酶解物中含有更多的疏水性氨基酸殘基。

圖9 PPIs、PPIHs、PPIHs-Ⅰ、PPIHs-Ⅱ和PPIHs-Ⅲ外源性熒光光譜

3 結(jié)論

利用超聲輔助蛋白酶K對(duì)馬鈴薯蛋白酶抑制劑進(jìn)行酶解,系統(tǒng)表征了水解產(chǎn)物的理化性質(zhì)以及pH和溫度對(duì)其抗氧化穩(wěn)定性的影響,并討論了超濾后各組分的抗氧化能力和結(jié)構(gòu)特性。酶解后,PPIHs的分子質(zhì)量由大分子蛋白向小分子肽轉(zhuǎn)變,溶解度增加,抗氧化穩(wěn)定性增強(qiáng),酶解后紫外吸收光譜發(fā)生紅移,蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變,疏水性增加,β-折疊和α-螺旋降低,無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角增加。超濾后PPIHs-Ⅰ的平均粒徑和Zeta電位的絕對(duì)值略有增加,對(duì)ABTS自由基的清除能力最強(qiáng),熒光光譜顯著下降;PPIHs-Ⅱ 的油脂氧化抑制能力以及對(duì)DPPH和OH自由基的清除能力較強(qiáng),PPIHs-Ⅲ 的抗氧化能力較弱,其熒光光譜增強(qiáng),二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。