酶解-擠出復合法改性綠豆皮膳食纖維及其結構表征與理化性能

劉鴻鋮, 樊紅秀, 趙 鑫, 張閃閃, 劉婷婷, 王大為

(吉林農業大學食品科學與工程學院1,長春 130118)(農業農村部食用菌加工技術集成科研基地2,長春 130118)(吉林省糧食精深加工與高效利用工程研究中心3,長春 130118)(吉林省糧食精深加工與副產物高效利用技術創新重點實驗室4,長春 130118)

綠豆[Vignaradiata(Linn.) Wilczek]富含多種營養成分,其中主要成分為蛋白質與淀粉,總質量分數約占綠豆籽粒的80%,同時膳食纖維(DF)、維生素、黃酮、生物堿等成分含量也相當可觀[1-4]。綠豆皮是生產豆芽時產生的副產物,目前其利用方式除了少部分作為飼料加工外,大部分直接廢棄,不僅未得到充分利用,而且會帶來環境問題。綠豆皮的主要成分是膳食纖維(質量分數約為75%),特別適合用于生產高品質膳食纖維。

相關研究已經表明膳食纖維具有調節血糖、預防心腦血管疾病、通便等多種功效[5]。根據分類,膳食纖維有不溶性膳食纖維(IDF)和可溶性膳食纖維(SDF)2種類型,其中可溶性膳食纖維的功能活性更強[6]。由于天然產物的膳食纖維中SDF含量比較低,因其較差的口感使其沒能廣泛地應用在食品領域中。采用綠色高效、簡約的改性方式使盡可能多的IDF轉化為SDF,逐漸成為當前研究膳食纖維改性的熱點[7,8]。

酶解、擠出膨化等方式在改性膳食纖維方面具有良好的效果,可使SDF的得率大幅度提高。劉婷婷等[9]研究單螺桿擠出改性處理香菇柄纖維,改性后的香菇柄纖維持水力、持油力和膨脹力均比改性前增加。李升等[10]采用CO2爆破擠出改性提升了麥麩中SDF的含量,同時顯著提高了其抗氧化活性。張海芳等[11]發現酶法改性能顯著提高馬鈴薯渣膳食纖維中的單糖含量,持水力、結合水力、持油力和陽離子交換力等理化性質也得到明顯改善。酶解-擠出復合法技術是近年來新興起的技術,要求先將物料與酶混合均勻,酶解一段時間后進行擠出處理,該技術結合了擠出過程高壓、高溫、高剪切力的作用,再加上酶的協同作用促使物料大幅度被降解,具有成本低、生產效率高等優點[12]。然而,目前對于酶解-擠出復合改性綠豆皮膳食纖維后結構變化的研究還鮮有報道。因此,本研究將綠豆皮膳食纖維進行酶解-擠出復合改性處理,通過掃描電鏡、傅里葉近紅外光譜、X-射線衍射表征酶解-擠出復合改性對綠豆皮膳食纖維結構的變化影響,以持油力、膨脹力、吸附膽固醇能力和陽離子交換能力等理化性能為考核指標,分析酶解-擠出復合改性處理對綠豆皮膳食纖維理化性能的影響,為后續提高綠豆皮膳食纖維的利用率和開發綠豆高附加值產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆(一級),符合GB/T 10462—2008《綠豆》中一級綠豆的要求。堿性蛋白酶(3×103U/mL)、耐高溫α-淀粉酶(4×104U/g)、糖化酶(1.6×105U/g)、纖維素酶(3×104U/g)。無水乙醇、溴化鉀等:分析純。

1.2 儀器與設備

GB 1302電子精密天平,TU-1901雙光束紫外可見分光光度計,JC-60A單螺桿擠出試驗機,MiniFlx 600臺式粉末X-射線衍射儀,Nicolet is20傅里葉變換紅外光譜儀,DE-CSF6膳食纖維測定儀,Phenom Pro全自動臺式掃描電鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 綠豆皮的收集

參照王大為等[13]的方法,挑選籽粒飽滿、表皮無破損的綠豆,移入40 ℃的溫水中浸泡3.5 h,挑出死豆,將其余綠豆移入豆芽機中,在25 ℃條件下培養,每間隔0.5 h噴淋清水1次,3 d后可收集到發芽脫落的綠豆皮,至于45 ℃烘箱干燥,粉碎過80 目篩(0.20 mm)并干燥保存待用。

1.3.2 綠豆皮基礎成分分析測定

水分含量:依據GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》,直接干燥法;脂肪含量:依據GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》,索氏抽提法;灰分含量:依據GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》,灼燒重量法;蛋白質含量:依據GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》,分光光度法;SDF、IDF、總膳食纖維(TDF)含量:依據GB 5009.88—2014《食品安全國家標準 食品中膳食纖維的測定》,酶重量法。

1.3.3 酶解-擠出復合法改性綠豆皮膳食纖維的制備

精確稱取一定量綠豆皮粉,加入一定量的纖維素酶和水分充分混合均勻,酶解一段時間(pH 5.5、酶解溫度50 ℃),經過潤料攪拌均勻后,采用單螺桿擠出實驗機進行改性處理。固定其他因素不變,分別考察纖維素酶添加量(60、90、120 、150、180 U/g)、酶解時間(1、2、3、4、5 h)、水分添加量(質量分數55%、60%、65%、70%、75%)和擠出溫度(120、130、140、150、160 ℃)對SDF得率的影響。在單因素實驗的基礎上,采用四因素三水平正交試驗優化酶解-擠出復合改性工藝,試驗設計因素水平如表1所示。

表1 正交實驗因素與水平表

1.3.4 綠豆皮膳食纖維的提取

膳食纖維的提取依據AOAC 991.43《食物中總的、可溶性及不溶性膳食纖維 酶-重量法》進行。

1.3.5 掃描電鏡觀察

參照劉鴻鋮等[14]的方法,取一定量干燥樣品粉碎過80 目篩(0.20 mm),鍍金后置于掃描電鏡中,觀察對其表面微觀結構,掃描電鏡放大倍數為2 000倍。

1.3.6 X-射線衍射分析

X-射線衍射條件:Cu-Kα靶型,掃描區域為5°～45°,采用連續掃描法,速度為2(°)/min,步長為0.02,管電流為40 mA,管電壓為40 kV。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析測定

參照Liu等[15]方法,綠豆皮膳食纖維的傅里葉變換紅外光譜曲線通過Nicolet is20傅里葉變換紅外光譜儀檢測。紅外光譜儀分辨率采用4 cm-1,掃描波數范圍采用4 000～400 cm-1,累計掃描次數采用32次。

1.3.8 持油力(持水力)測定

參照Wang等[16]的方法,稱取0.20 g干燥樣品加入一支20 mL潔凈的離心管,添加10 mL植物油(蒸餾水)并震蕩均勻,采用保鮮膜密封,在室溫條件下靜置12 h,然后在3 800 r/min的轉速下離心分離,去除上清液,并用濾紙吸干剩余的油(水),持油力(持水力)采用式(1)進行計算。

(1)

式中:m0為干燥樣品的質量/g;m1為離心管的質量/g;m2為吸油(水)后樣品與離心管的質量之和/g。

1.3.9 膨脹力測定

參考Chen等[17]方法,稱取0.25 g干燥樣品加入10 mL的量筒中,記錄樣品的體積后添加蒸餾水至5 mL刻度線處,采用保鮮膜密封,在室溫條件下靜置18 h,將樣品吸水膨脹后的體積讀取并記錄,膨脹力采用式(2)進行計算。

(2)

式中:m為干燥樣品質量/g;V0為干燥樣品自然堆積的體積/mL;V1為吸水膨脹后樣品的體積/mL。

1.3.10 陽離子交換能力測定

稱取1.00 g干燥樣品加入250 mL的錐形瓶內,迅速移入50 mL 1 mol/L的鹽酸溶液并均勻攪拌,采用保鮮膜密封,在室溫條件下靜置24 h后過濾,并用大量的蒸餾水洗滌樣品,直至濾液中檢測不出氯離子[18],將濾渣置于錐形瓶內,迅速加入150 mL的5 g/100 mL氯化鈉溶液,充分攪拌30 min,然后添加2滴酚酞溶液,最后用氫氧化鈉溶液(0.05 mol/L)滴定直到終點,空白對照試驗采用蒸餾水滴定,陽離子交換能力采用式(3)進行計算。

基層農業科研事業單位的國有資產主要包括：流動資產（貨幣資金、往來賬款、存貨）、固定資產、無形資產和對外投資等。為確保資產的安全和高效使用，應做好以下幾方面的工作。

(3)

式中:m為干燥樣品質量/g;C為滴定所用氫氧化鈉溶液的濃度/mol/L;V0為滴定空白樣所用氫氧化鈉溶液體積/mL;V1為滴定樣品所用氫氧化鈉溶液的體積/mL。

1.3.11 吸附膽固醇能力測定

取適量新鮮雞蛋蛋黃,添加9倍體積的水制成蛋黃乳液。稱取0.50 g干燥樣品加入一個錐形瓶內,加入蛋黃乳液30 mL并均勻攪拌,分別再用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調配pH=2和pH=7的緩沖液[19],然后置于36 ℃恒溫水浴中震蕩,每隔2 h取出離心分離,吸取1 mL上清液,依據鄰苯二甲醛法制成膽固醇的標準工作曲線:y=0.008 8x-0.003 7(R2=0.991 7),并測出吸附前蛋黃乳液中膽固醇質量濃度ρ2,上清液中膽固醇質量濃度ρ1,吸附膽固醇能力采用式(4)進行計算。

(4)

式中:ρ1為上清液中膽固醇質量濃度/mg/mL;ρ2為吸附前蛋黃乳液中膽固醇質量濃度/mg/mL;m為干燥樣品質量/g。

1.4 數據處理分析

2 結果與分析

2.1 基礎組成成分分析

綠豆皮改性前后的基礎成分含量如表2所示。經過擠出-酶解改性處理后,綠豆皮中TDF含量無顯著性變化,但SDF含量顯著性增加(P<0.05),IDF含量顯著降低。這表明,通過酶解-擠出復合改性處理后,綠豆皮中的一部分IDF向SDF轉化,這可能是由于纖維素酶破壞了綠豆皮緊致的細胞壁結構,SDF更有利于溶出[20],另一方面在擠出過程中,伴隨著高壓、高溫、高剪切力的作用也會使IDF內的一部分糖苷鍵斷裂轉化生成SDF。此外,經酶解-擠出復合改性后,綠豆皮中水分、脂肪、蛋白質及灰分的含量均沒有顯著性變化。

表2 綠豆皮基礎組成質量分數/g/100 g

2.2 單因素實驗結果

根據1.3.3節分別研究了纖維素酶添加量、酶解時間、水分添加量和擠出溫度對SDF得率的影響,結果見圖1。

圖1 各因素對綠豆皮SDF得率的影響

由圖1a可知,纖維素酶添加量為60～120 U/g范圍內,伴隨酶添加量的增加,綠豆皮SDF得率也顯著提高(P<0.05);然而當酶添加量由120 U/g升到180 U/g時,SDF得率提高不顯著(P>0.05),這可能是因為一定量的綠豆皮作為底物,只能同相應量的纖維素酶起作用,一旦纖維素酶超量后,超量的酶不能參與酶解反應[21]。由圖1b可知,在開始階段,SDF得率伴隨著酶解時間的進行顯著增加(P<0.05);而當酶解時間為3 h,SDF得率曲線上升幅度較小,產生這種現象的原因可能是當反應時間相對過短時,物料與酶的作用不夠充分,導致SDF得率低,反應時間過長,酶解反應速率達最大值,最后SDF得率趨于平緩。由圖1c可知,隨著水質量分數的增加,SDF得率呈現先升高后降低的趨勢,在65%時SDF得率達到最大值為(9.21±0.11)%。水分添加量是影響SDF得率的重要因素,物料在經擠出過程中水分添加量過低時,沒有充足的蒸汽與其發生作用,物料出現糊化,在擠出機中很難被擠出,易發生堵塞;水分添加量過高時,物料在擠出機中的溫度會降低,同時過于濕潤的物料也會影響其在擠出機內部的輸送能力,發生打滑現象致使擠出效果不佳從而影響SDF的得率[22]。通過單因素方差分析結合圖1d可知,擠出溫度對SDF得率的影響達到了極顯著水平(P<0.01)。SDF得率隨著擠出溫度的增加呈現先升高后緩慢降低的趨勢,在160 ℃時SDF得率達到最大值為(9.45±0.09)%。這是由于相對較低的擠出溫度會導致外部能量供應不足,滿足不了膨化動力的要求,不利于促使綠豆皮IDF內部的致密結構發生裂解,因而SDF得率不高;而相對過高的擠出溫度會使物料發生不同程度的糊化,擠出腔里的壓力增大,以致影響SDF的得率[23]。

2.3 正交實驗結果

在單因素實驗的基礎上,進行四因素三水平正交實驗,結果見表3～表4。對正交實驗的極差和方差進行分析可知,對SDF得率的影響最大的因素是纖維素酶的添加量,然后依次是擠出溫度、酶解時間、水分添加量,且4個因素對SDF得率均具有顯著性影響(P<0.01),由F值大小順序為A>D>B>C,與正交表R相對應,因此結果具有較高的可信度。最佳酶解-擠出復合改性工藝條件是A2B3C3D2,即在纖維素酶添加量為120 U/g,酶解時間4 h,水質量分數70%,擠出溫度140 ℃時,SDF得率最高。在此最佳工藝條件下進行3次驗證性重復實驗,SDF得率為(12.74±0.29)%,超過周愛麗[22]報道的擠出改性綠豆皮的SDF得率。驗證實驗結果表明,最佳酶解-擠出復合改性工藝條件的重復性較好,穩定可靠。

表4 正交實驗方差分析結果

2.4 表面微觀結構觀察

圖2表明,改性前綠豆皮膳食纖維具有光滑的表面,同時存在零星可見的褶皺,結構非常致密,表面也黏連少量粗顆粒,可能是綠豆皮上殘留的蛋白質[24](圖2a);酶解-擠出復合改性處理后,綠豆皮膳食纖維表面呈現大量明顯的孔隙與褶皺,導致表面比較粗糙,疏松多孔網狀結構十分顯著(圖2b),這可能是由于在改性處理過程中,綠豆皮膳食纖維受到高壓、高溫、高剪切力以及酶解的作用,纖維的緊密結構被打開,結構發生重組、斷裂,纖維的聚合度大幅度降低[9],這為酶解-擠出復合改性處理后的綠豆皮膳食纖維的持油力、持水力和膨脹力等理化性能的增大提供參考。王旭等[25]報道了通過擠出膨化輔助酶水解提取可溶性膳食纖維后,發現米糠可溶性膳食纖維表面呈蜂窩顆粒狀、形態疏松,其持水力、結合水力和溶脹力等物化特性均得到明顯改善。

圖2 綠豆皮膳食纖維改性前后的掃描電鏡圖(2 000×)

2.5 X-射線衍射掃描結果

由圖3可見,2θ在17°和22°附近的結晶衍射峰比較顯著,35°處的小衍射峰是纖維素I晶體典型構型[26]。綠豆皮膳食纖維經過改性處理后,2θ變為16.89°、22.46°,差異不顯著(P>0.05),這說明酶解-擠出復合改性處理并未顯著改變綠豆皮膳食纖維的結晶構型。使用Jade 7.0 軟件擬合后發現,經酶解-擠出復合改性后,綠豆皮膳食纖維的相對結晶度降低了約17%,這可能是由于綠豆皮膳食纖維在酶解-擠出復合改性過程中,部分非結晶區和結晶區的結構受到影響甚至沖破,分子間的凝聚力大幅度降低,導致水溶性成分更容易溶出;與此同時,一部分結晶區轉化為非定性區,導致相對結晶度下降,從而使綠豆皮膳食纖維的聚合度降低,有利于改善其持油力、持水力、膨脹力、陽離子交換能力等理化特性[27]。

注:DF-1為未改性綠豆皮膳食纖維;DF-2為酶解-擠出復合改性綠豆皮膳食纖維,下同。

2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

圖4 綠豆皮膳食纖維改性前后的傅里葉變換紅外光譜圖

2.7 持油力、膨脹力、陽離子交換能力分析

由表5可以看出,綠豆皮膳食纖維在酶解-擠出復合改性處理后,其持油力、膨脹力、陽離子交換能力等理化性能都明顯得到改善(P<0.05)。這是由于綠豆皮膳食纖維在復合改性處理過程后,其比表面積大為增加,表現出較多大的孔隙與多層褶皺,有利于親油基團和親水基團暴露出來[31],這導致與油和水結合的位點增加,油和水更容易地與綠豆皮膳食纖維結合。另一方面,酶解-擠出復合改性處理也會使一些纖維質大分子降解轉化為可溶性小分子成分,這些變化有利于提高膳食纖維的持油力、持水力及膨脹力等理化性能[32]。陽離子交換能力與糖醛酸含量關系密切[33],綠豆皮膳食纖維經過酶解-擠出復合改性處理,其陽離子交換能力明顯增強(P<0.05),這可能是由于在酶解-擠出復合改性處理過程中,一些綠豆皮膳食纖維中的糖醛酸基團暴露所致[34]。

2.8 吸附膽固醇能力測定

由圖5可以看出,在pH=2和pH=7條件下,綠豆皮膳食纖維在復合改性前后,其對膽固醇的吸附能力都是伴隨時間的增加而增大,大約 12 h后吸附基本達到穩定。此外,在同一條件的pH到達吸附穩定時,綠豆皮膳食纖維經過酶解-擠出復合改性后,其吸附膽固醇能力明顯提高(P<0.05),這可能是由于SDF的分子質量小于IDF,含有更多極性基團,也有利于膽固醇的吸附[13]。Sera等[35]研究表明,膳食纖維吸附膽固醇的能力與所處條件的pH值息息相關,相同的綠豆皮膳食纖維,其吸附膽固醇能力在環境pH=7時明顯要比環境pH=2時高。另一方面,膳食纖維對膽固醇的吸附能力也會受到其表面結構的影響,由于膳食纖維對膽固醇的吸附屬于物理吸附過程,綠豆皮膳食纖維經過酶解-擠出改性處理后,其表面出現更多孔隙與褶皺,有利于對膽固醇的吸附。

3 結論

采用單因素實驗和正交實驗對酶解-擠出復合法改性綠豆皮膳食纖維工藝進行優化,結果表明:在纖維素酶添加量120 U/g,酶解時間4 h,水質量分數70%,擠出溫度140 ℃的條件下,SDF得率為(12.74±0.29)%。通過酶解-擠出復合法改性處理后,綠豆皮膳食纖維的表面結構由光滑致密變成蓬松與粗糙,出現了多孔性、多層褶皺特征,比表面積增大。傅里葉變換紅外光譜、X-射線衍射結果表明,酶解-擠出復合法改性并沒有破壞綠豆皮膳食纖維內部的分子結構,但相應特征吸收峰的強度均有所改變,這主要是因為膳食纖維內部的部分結晶區和非結晶區的結構遭到破壞,以至于一部分結晶區向非定性區轉化,最終促使相對結晶度下降。以上的改變使更多的親油基團和親水基團從膳食纖維中解放出來,可使膳食纖維得持油力、膨脹力、吸附膽固醇能力和陽離子交換能力等理化性能等理化性能均得到有效提高。后續可利用綠豆皮膳食纖維開發控制體重、降血脂、治療便秘等功能食品。