免疫磁珠高通量自動凈化-超高效液相色譜法快速測定飼料中玉米赤霉烯酮

王 蒙, 陳金男, 葉 金, 李 麗, 王松雪, 張 穎,吳 宇, 劉洪美

(上海理工大學健康科學與工程學院1,上海 200093)(國家糧食和物資儲備局科學研究院糧油質量安全研究所2,北京 102629)

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一種鐮刀菌屬真菌產生的次級代謝產物,分子式為C18H22O5,不溶于水,易溶于有機溶劑,具有熒光特性,在玉米和小麥等谷物類飼料中廣泛存在[1]。玉米赤霉烯酮的毒性主要體現在免疫毒性、生殖毒性、細胞毒性、遺傳毒性和器官毒性等[2]。劉雙雙等[3]研究發現ZEN在終濃度10、20、30 mol/L下均可顯著或極顯著地降低脂多糖誘導的B細胞相對活性,并導致細胞表面標識分子CD69、CD71、CD138的表達量顯著下降。此外,ZEN還可抑制B細胞的增殖,且呈劑量效應關系。玉米赤霉烯酮可直接通過抑制小鼠B淋巴細胞的活化、增殖、分化,影響體液免疫的進程,從而對動物機體產生免疫抑制作用。趙虎等[4]在基礎日糧中分別添加1、2、3 mg/kg質量分數的玉米赤霉烯酮飼喂仔豬,與飼喂基礎日糧的對照組相比仔豬脾臟、肝臟和腎臟重量顯著增加。Wu等[5]將48只青春期前母豬分為對照組和3個實驗組(分別在基礎日糧上添加200、800、1 600 μg/kg的ZEN),結果顯示ZEN添加量最大的實驗組與對照組相比母豬的血清總抗氧化能力和血清超氧化物歧化酶活性均顯著降低,天冬氨酸轉氨酶活性顯著升高,引起肝毒性。李樵峰等[6]將蛋雞分成對照組和2個實驗組(分別在全價基礎日糧上添加1和2 mg/kg的ZEN),結果顯示實驗組的肝臟病理組織切片中出現小泡性脂肪病變和肝組織壞死和纖維化。ZEN對飼料及其產品的污染不僅會導致養殖業遭受經濟損失,而且ZEN 在可食用動物組織或動物產品中的殘留對人類健康具有很大的威脅。許多國家都對ZEN制定了限量標準,目前其他國家對ZEN在谷物及飼料中的限量范圍在0.02～1 000 μg/kg[7]。我國規定谷物及其制品中ZEN的限量為60 μg/kg[8],飼料原料及其產品中的限量為0.1～1.5 mg/kg[9]。

飼料組分復雜,常摻有甜菜堿、抗菌肽、低粗蛋白、混合有機酸、霉菌毒素吸附劑等添加劑和營養物質[10-14],給ZEN的準確檢出造成阻礙。因此,樣品前處理方法就顯得尤為重要。現有的前處理方法主要有免疫親和柱法(IAC)[15]、固相萃取法(SPE)[16]、QuEChERS[17]等。上述方法存在操作繁瑣、耗時長,成本高等問題。免疫磁珠(IMB)是由載體微球和免疫配基相結合的一種磁性納米粒子,具有超順磁性、尺寸小等特點[18,19],在食品安全檢測領域展現出獨特的優勢,具有操作簡單、準確度高、凈化時間短等優點[20-22]。玉米赤霉烯酮常用的分析測試方法有免疫檢測法、薄層色譜測定法、高效液相色譜法、超高效液相色譜法和液相色譜-質譜聯用法等(表1)。綜合比較各種檢測方法,超高效液相色譜法由于使用了粒徑更小的填料色譜柱,能夠縮短分析時間而且不需要質譜儀這類價格昂貴的儀器,非常適合準確、快速地檢測大量飼料樣品中的ZEN。

表1 玉米赤霉烯酮檢測方法及特點

研究將免疫磁珠技術應用于飼料原料及其產品中的玉米赤霉烯酮的凈化,結合超高效液相色譜分析方法,旨在實現飼料原料及其產品中玉米赤霉烯酮準確、快速檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設備

玉米赤霉烯酮單克隆抗體(純度>97.3%)、NHS基團-磁珠[20%(體積分數),10～30 μm]、玉米赤霉烯酮免疫親和柱;甲醇、乙腈(色譜純)、無水乙醇(分析純);甲醇中玉米赤霉烯酮溶液標準物質[GBW(E)100301];定性濾紙(直徑為15 cm)。

1.2 主要儀器與設備

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀,Waters Acquity FLD熒光檢測器,JJHZ10真菌毒素全自動凈化儀,MTV-100多管漩渦混合儀,SQP電子天平,N-EVAP112快速溶劑吹干器。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱:Waters BEH-C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫 40 ℃,樣品溫度 10 ℃;進樣量 10 μL。流動相:水-乙腈,按體積比 45∶55 混合,等度洗脫,流速為 0.2 mL/min。熒光檢測波長:激發波長 303 nm,發射波長 440 nm。

1.3.2 免疫磁珠的制備

將抗體恢復至室溫,吸取一定量加到離心管中,加入適量MES緩沖液制成抗體稀釋液,混勻備用。NHS基團-磁珠充分混勻后,吸取一定量,用無水乙醇洗2遍后,快速加入抗體稀釋液混勻,孵育2 h。孵育結束后,磁分離棄去上層液。加入適量體積分數為2%甘氨酸溶液封閉2 h。封閉結束后,磁分離棄去上層液。用0.1%(體積分數)PBST、PBS各清洗2次磁珠,4 ℃冷藏保存在PBS中。

1.3.3 樣品前處理方法

免疫磁珠自動凈化前處理方法流程如下:將飼料恢復至室溫備用,稱質量前充分混勻。準確稱量(10.00±0.01)g樣品(基質加標樣品應靜置過夜以揮發標準溶液中的有機溶劑),加入40 mL體積分數為90%的乙腈水;充分震蕩20 min,使用定性濾紙過濾。準確吸取2 mL濾液加到試劑盒1孔位,將試劑盒放到真菌毒素全自動凈化儀中,啟動程序自動凈化。凈化結束后,準確吸取洗脫溶液0.5 mL于10 mL離心管中,在55 ℃氮氣環境下緩慢吹至近干。吹干后用0.5 mL流動相復溶。使用0.2 μm濾膜過濾復溶溶液,上機檢測。

1.3.4 分析方法驗證

用逐級稀釋法,以信噪比(S/N=3)和(S/N=10)確定檢出限和定量限。對該方法進行加標回收率、重復性、穩定性測試。對飼料樣品進行3個不同濃度(低、中、高)基質加標回收率的測定。基質加標后在室溫下放置過夜,以蒸發加入的標準溶液溶劑。在1個加標水平(150 μg/kg)下測定重復性,重復測定4 d,測試該方法的穩定性。

1.3.5 標準工作曲線的繪制

配制ZEN標準溶液方法:根據需要準確吸取適量標準儲備液,用流動相稀釋,配制成10、25、50、100、200、500 ng/mL的系列標準工作液,4 ℃避光保存。將標準溶液混勻后使用超高效液相色譜檢測,以目標物質的濃度為橫坐標,目標物質的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.6 數據處理軟件

采用Empower?3軟件進行數據采集、整理和導出。使用Microsoft Excel?2016和OriginPro8.5軟件對實驗數據進行統計分析、作圖。

2 結果與分析

2.1 稀釋液的優化

飼料組分豐富,成分復雜,容易對毒素的凈化及檢測過程造成不利影響,試劑盒樣品孔稀釋液作為抗原與抗體反應的溶劑環境,對凈化效果有顯著影響。經過預實驗后選擇仔豬飼料進行稀釋液的優化。比較了6種稀釋液及二次離心的方式對樣品孔稀釋液進行了優化,結果如圖1a所示。常用的PBS和0.1%(體積分數)PBST緩沖液回收率分別為107.0%和93.0%,但是凈化后樣品孔和第1個清洗孔出現大量絮狀物,磁珠有不同程度的殘留,因此平行性較差,相對標準偏差偏大。在稀釋液中加入1%(體積分數)PEG作為分散劑,回收率降低且絮狀物殘留狀況沒有改善。在0.1%(體積分數)PBST中添加BSA和0.1%(體積分數)TBST 2種稀釋液的回收率分別為96.8%和108.1%滿足測試需求,但凈化后樣品孔仍有部分絮狀物。二次離心法和0.1%(體積分數)吐溫20-水凈化效果最好,回收率約100%,且凈化后各孔位干凈清澈,無雜質。圖1b液相色譜圖顯示豬飼料使用0.1%(體積分數)吐溫-20水作為稀釋液,目標峰后幾乎無雜峰,凈化效果優于二次離心,同時二次離心法增加了前處理步驟和時間。之后用0.1%(體積分數)吐溫-20水作為稀釋液凈化其他3種不同飼料,凈化效果液相色譜圖如圖1c所示,各色譜峰峰型一致。因此,樣品孔位稀釋液為水中加入0.1%(體積分數)的吐溫20。

注:a 不同稀釋液及上清液處理方式凈化后回收率;b 不同稀釋液及上清液處理方式液相色譜圖;c 稀釋液為0.1%(體積分數)吐溫20-水對不同飼料凈化效果。方法1表示稀釋液為PBS;方法2表示稀釋液為0.1%(體積分數)PBST;方法3表示稀釋液為1%(體積分數)PEG/0.1%(體積分數)PBST;方法4表示稀釋液為0.1%(體積分數)吐溫20-水;方法5表示稀釋液為0.1%(體積分數)PBST+BSA;方法6表示稀釋液為0.1%(體積分數)TBST;方法7表示樣品離心后上清液與0.1%(體積分數)PBST混勻后二次離心。

2.2 方法的線性關系、檢出限、定量限

在10～500 ng/mL濃度范圍內制備標準工作液。Y=225.57X+184.2,R2=0.999 93,線性關系良好。方法的檢出限為4.5 ng/mL,定量限為15.0 ng/mL,滿足飼料中玉米赤霉烯酮的日常檢測。

2.3 方法準確性與精密度

選取雞飼料和豬飼料作為基質,參照GB/T 27404對方法及方法確認的要求進行方法準確性和精密度的檢驗。選擇加標質量分數為飼料限量標準的0.5、1.0、2.0倍。充分混勻靜置后,按照1.3.3樣品前處理方法處理樣品,計算加標回收率和相對標準偏差(RSD),雞飼料3種質量分數的加標回收率在96.0～99.8%,RSD在1.8%～3.7%,豬飼料3種濃度加標回收率在92.6%～112.9%,RSD在1.0%～8.8%。結果表明,本法具有良好的準確性。具體結果見表2。

表2 免疫磁珠法凈化后基質加標回收率

2.4 日間精密度

連續4 d采用免疫磁珠凈化法進行同種飼料加標回收測試,所得結果如表3。方法連續4 d的加標回收率在97.0%～98.9%,日間精密度在5.7%～5.9%,具有良好的重現性。

表3 該方法的日間精密度

2.5 實際樣品測試及方法比對

表4表示的是采用國標法中的免疫親和柱法和免疫磁珠法對豆粕、DDGS(4個不同廠家)及14種牛、羊、雞飼料分別進行前處理后得到的檢測結果,采用t檢驗,評價2種凈化方法的測定結果是否一致。經t檢驗分析,2種凈化方法的測定結果無顯著性差異(P>0.05)。因此,本方法可用于大批量飼料產品中ZEN含量的檢測。

表4 實際樣品的測定結果

3 結論

本研究建立了一種自動、高通量免疫磁珠凈化-超高效液相色譜檢測方法,用于測定飼料原料及其產品中的玉米赤霉烯酮。在研究中發現,樣品稀釋液組成對凈化后樣品檢測結果起重要作用,在水中加入0.1%(體積分數)吐溫-20凈化效果最好。在雞飼料和豬飼料樣品中玉米赤霉烯酮的加標回收率為92.6%～112.9%,相對標準偏差為1.0%～8.8%。連續4 d基質加標回收率在94.0%～106.3%,日間精密度在0.5%～3.0%。本方法簡化了前處理步驟,實現凈化過程的自動化,減少因實驗人員操作造成的實驗誤差,提高了檢測效率,采用超高效液相色譜進行分析測試,具有良好的準確性和精密度。目前,使用免疫磁珠凈化飼料中的真菌毒素鮮有報道,多是對糧油產品的檢測,其中大部分是對單一毒素的檢測,未來需要研發能夠同時凈化多種真菌毒素的免疫磁珠,提高免疫磁珠的凈化效率,降低檢測成本,制定相關標準,使其得到廣泛的應用。