黃芪甲苷二元醇質體凝膠的制備及其對大鼠皮膚創面愈合的影響

陳筱瑜，馮玉天嬌，吳少嬡，黃慶德*

（1.福建衛生職業技術學院藥學院，福建 福州 350101；2.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

創面愈合是機體皮膚遭受外力作用造成損傷后的修復愈合過程，整個過程由多種因素共同參與調控，復雜且有序，通常分為3 個階段：止血與炎癥期、組織形成期以及組織重塑期［1-2］。黃芪具有解毒生肌的功效，能夠改善皮膚狀態，在促進創面愈合方面療效良好［3-4］。黃芪甲苷是黃芪主要的藥理活性成分之一，具有抗炎、抗衰老、抗病毒、調節機體免疫力等多方面的藥理作用［5］。現代研究表明黃芪甲苷在創面修復以及抑制瘢痕形成過程具有重要作用［6-8］。陳希［9］研究表明：黃芪甲苷可促進皮膚膠原蛋白的有序排列、血管新生、降低Ⅰ型膠原/Ⅲ型膠原的比例，可增加角化細胞的增殖遷移能力，促進創面傷口的愈合，同時增加創傷部位的皮膚張力，使創面皮膚恢復為正常的組織。黃芪甲苷為難溶性成分［10］，難以透過表皮和在真皮層達到有效濃度，將其制成二元醇質體可增加藥物的透皮吸收和藥物在皮膚中的滯留量［11］。但二元醇質體黏度較低，單獨使用時很難使藥物在皮膚表面長時間滯留，且不能形成封閉的保護膜，不利于傷口的愈合。本實驗在前期研究基礎上，將黃芪甲苷二元醇質體制備為凝膠，并初步考察其穩定性、皮膚刺激性、體外釋放度及對大鼠創面愈合的影響，為后期的產品開發提供實驗數據。

1 實驗材料和儀器

1.1 實驗動物 SD 大鼠，清潔級，雄性，體質量200～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SCXK（滬）2017-0005；普通新西蘭兔，雄性，體質量2.3～2.5 kg，購自上海市松江區松聯實驗動物場，實驗動物使用許可證號為SCXK（滬）2017-0008。實驗前均于飼養環境中適應性飼養7 d。清潔級醫學實驗動物環境設施由福建衛生職業技術學院實驗動物中心提供。

1.2 實驗儀器 ACQUITY UPLC?TOD system 超高效液相串聯質譜儀（美國Waters 公司）；ACQUITY UPLC?BEH C18 超高效液相色譜柱（美國Waters 公司）；透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿易有限公司，型號：TK-12D）；恒溫磁力攪拌器（常州市金壇大地自動化儀器廠，型號：MPLR-702）；高速離心機（德國Eppendorf 公司，型號：Centrifuge 5418）；蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司，型號：BT100-1F）；pH酸度儀（美國OHAUS 公司，型號：STARTER3100）；萬分之一電子天平（上海精密科學儀器有限公司，型號：FA2004N）；十萬分之一電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號：XS205］；透析袋（北京索萊寶科技有限公司，型號：MD34）。

1.3 實驗試劑 黃芪甲苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：J25F10T81373，純度≥98%）；黃芪甲苷二元醇質體（自制）［12］；橡皮生肌膏（天津達仁堂京萬紅藥業有限公司，批號：206615）；卡波姆934（批號：B22A11F122191）、卡波姆940（批號：J14GS154671）、卡波姆980（批號：S18D10X106090）均購自上海源葉生物科技有限公司；羧甲基殼聚糖（青島舜博生物技術研究所有限公司，批號：210412）；甲酸、水、甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 黃芪甲苷二元醇質體凝膠的制備

2.1.1 凝膠的制備方法 稱取0.2 g 羧甲基殼聚糖溶解于100 mL 純化水中，將1.0 g 卡波姆均勻撒在上述純化水上，于4 ℃冰箱內靜置過夜，使其充分溶脹，溶脹后用適量三乙醇胺調節pH 值至中性，即得空白凝膠基質；按照1∶1 的比例將凝膠基質與黃芪甲苷二元醇質體均勻混合，即得黃芪甲苷二元醇質體凝膠。

2.1.2 凝膠基質種類的篩選 分別稱取1.0 g 卡波姆934、卡波姆940、卡波姆980，按照“2.1.1”項下方法制備黃芪甲苷二元醇質體凝膠，根據凝膠外觀、黏稠度、涂展性和穩定性分為優（1.5～2.0分）、良（1.0～1.5分）、中（0.5～1.0 分）和差（0～0.5 分）4 個等級進行評分，評分標準見表1，評分結果見表2。結果表明：使用卡波姆980 作為凝膠基質時，與二元醇質體混合無法形成凝膠；而卡波姆940 作為凝膠基質制備的凝膠過于黏稠，較難涂抺；卡波姆934 制備的凝膠評分最高，且涂展性好，具有一定的光澤性，可作為凝膠基質。

表1 凝膠評分標準

表2 3 種基質制備的凝膠綜合評分比較 分

2.1.3 卡波姆934 用量的篩選 按照“2.1.1”項下方法分別制備含卡波姆934 基質0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、3.0%和4.0%的空白凝膠基質，按照1∶1 的比例將凝膠基質與黃芪甲苷二元醇質體混合均勻。取制備好的凝膠置于離心管中，用離心機以4 000 r/min離心30 min，按照表1 的評分標準考察制備凝膠的外觀、涂展性、黏稠度和穩定性，并進行綜合評分。結果表明：卡波姆934 基質的用量對凝膠的離心穩定性幾乎沒有影響；但隨著基質含量的增加，制備的凝膠黏稠度增加，涂展性變差；空白凝膠基質中卡波姆934 含量為1.6%時，黃芪甲苷二元醇質體凝膠的綜合評分最高。評分結果見表3。

表3 卡波姆934 不同用量制備的凝膠綜合評分結果 分

2.1.4 卡波姆934 與黃芪甲苷二元醇質體比例的篩選 按照“2.1.1”項下方法分別制備含卡波姆934 不同濃度的空白凝膠基質，與黃芪甲苷二元醇質體以1∶9、2∶8、3∶7、4∶6 和5∶5 的比例混合制備黃芪甲苷二元醇質體凝膠，每份凝膠中均含0.8 %卡波姆934 和0.2 %羧甲基殼聚糖，按照表1 的評分標準評分，卡波姆934 與黃芪甲苷二元醇質體不同比例制備的凝膠評分基本一致，均為7.5 分左右。為增加凝膠中含藥量，最終選擇卡波姆934 與黃芪甲苷二元醇質體的比例為1∶9，即黃芪甲苷二元醇質體凝膠的處方為：羧甲基殼聚糖0.2%、卡波姆934 0.8%、黃芪甲苷二元醇質體90.0%、純化水9.0%。

2.2 黃芪甲苷二元醇質體凝膠的質量評價

2.2.1 離心穩定性 取黃芪甲苷二元醇質體凝膠適量，置于離心管中，分別于4 000、12 000 r/min 離心15 min，平行3 份，觀察其外觀形態的變化。結果發現：黃芪甲苷二元醇質體凝膠均無分層現象，外觀、涂展性、穩定性和黏稠度無明顯變化，說明黃芪甲苷二元醇質體凝膠在低速和高速離心狀態下物理穩定性良好。

2.2.2 黃芪甲二元醇質體凝膠的皮膚刺激性考察 取3 只新西蘭兔，分別在其背部劃定4 個區域，均予脫毛處理；用1 g 左右的黃芪甲苷二元醇質體凝膠分別涂抹在其中3 個不同區域，輕揉10 s，再使用無刺激性的紗布和膠布加以固定；在另一區域涂抹生理鹽水后直接用無刺激性的紗布和膠布加以固定。給藥4 h 后，擦去殘留凝膠劑，用溫水擦洗干凈。于藥物清除后1、24、48、72 h 觀察涂抹部位紅腫及紅斑情況。結果顯示：涂抹黃芪甲苷二元醇質體凝膠的背部皮膚部位均未出現紅腫和紅斑，與生理鹽水涂抹皮膚比較無明顯差異，說明黃芪甲苷二元醇質體凝膠對皮膚無刺激性，可用于皮膚給藥。

2.2.3 黃芪甲苷二元醇質體凝膠的體外釋放度考察 以含0.25%聚山梨酯80 的PBS（pH 值7.4）為接收液，將活化后的透析袋（截留相對分子量為6 000～8 000 U）剪成半透膜，固定在供給池和接收池之間，精密稱定黃芪甲苷二元醇質體凝膠1 g 加入到供給池中，使其均勻分布于半透膜表面，接收池中加入8 mL 接收液，擴散池溫度（37±0.5）℃，磁力攪拌的速度為200 r/min。分別于0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24、36、60 h 取樣100 μL 于5 mL 量瓶中，同時在接受池中補充相同溫度的接收液100 μL，將取得的樣品溶液加50%甲醇稀釋至刻度，0.22 μm微孔濾膜濾過，采用UPLC-MS/MS 法測定樣品中黃芪甲苷的含量［13］，計算黃芪甲苷二元醇質體凝膠中黃芪甲苷的累積釋放率（Qn），計算公式如下。

注：Q0為黃芪甲苷總的藥物含量；V0為釋放介質總體積（8 mL）；V為每次取樣時的體積（100 μL）；Ci為各取樣點藥物質量濃度（μg/mL）；i、n為取樣次數。

以釋放時間（t）為橫坐標（X），以黃芪甲苷累積釋放率（Qn）為縱坐標（Y），繪制黃芪甲苷二元醇質體凝膠體外釋放曲線，結果見圖1。

圖1 黃芪甲苷二元醇質體凝膠體外釋放曲線

2.2.4 黃芪甲苷二元醇質體凝膠的體外釋放行為分析 采用零級釋藥模型、一級釋藥模型和Higuchi 釋藥模型對“2.2.3”項下黃芪甲苷的累積釋放率進行釋藥行為擬合分析，見表4。結果表明：黃芪甲苷二元醇質體凝膠中黃芪甲苷的體外釋放機制均符合Higuchi 釋藥模型，r為0.993 9，說明黃芪甲苷二元醇質體凝膠釋藥過程為溶蝕與擴散共同作用。

表4 黃芪甲苷二元醇質體凝膠體外釋藥曲線擬合結果

2.3 黃芪甲二元醇質體凝膠對大鼠皮膚創面愈合作用的初步考察

2.3.1 大鼠皮膚創面模型建立 將18 只SD 大鼠隨機分成空白對照組、黃芪甲苷二元醇質體凝膠組和橡皮生肌膏組，每組6 只。將3 組SD 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，用刮毛刀剃去背部毛發，使用脫毛膏脫細毛；24 h 后再次麻醉，采用碘伏對大鼠背部皮膚消毒后用打孔器在背部制造出直徑為1 cm 的圓形創面，碘伏對創面邊緣進行消毒，建立創面模型。

2.3.2 動物給藥及創面愈合率比較 創面形成30 min后開始給藥：黃芪甲苷二元醇質體凝膠組、橡皮生肌膏組分別將黃芪甲苷二元醇質體凝膠、橡皮生肌膏涂抹于無菌紗布（寬度以超過創面邊緣2 mm 為宜）后覆蓋創面，使藥物與創面充分接觸；空白對照組將生理鹽水噴濕無菌紗布后覆蓋創面，每2 d 給藥1 次，療程20 d。于給藥前（第0 天）及給藥后第3、7、11、15、19 天對創面拍照，應用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析計算創面面積和創面愈合率，應用SPSS 25.0 軟件對創面愈合率數據進行單因素方差分析。3 組大鼠給藥后各時間點創面圖像見圖2，3組大鼠給藥后各時間點創面愈合率比較見表5。創面愈合率計算公式：

圖2 3 組大鼠給藥后各時間點創面圖像

表5 3 組大鼠給藥后各時間點創面愈合率比較（±s）

表5 3 組大鼠給藥后各時間點創面愈合率比較（±s）

注：與空白對照組比較，1） P＜0.01。

第19天86.46±2.12 94.30±0.791）98.15±0.491）組別空白對照組黃芪甲苷二元醇質體凝膠組橡皮生肌膏組n6 6 6第3天13.57±1.30 36.39±2.691）42.11±1.881）第7天26.49±2.40 57.32±1.431）62.16±3.371）第11天55.98±3.45 76.25±2.141）83.22±2.821）第15天73.40±2.83 86.05±2.331）95.34±0.581）

創面愈合率＝（給藥前創面面積－第n 天創面面積）/給藥前創面面積×100%

由表5可知：黃芪甲苷二元醇質體凝膠組和橡皮生肌膏組創面愈合率與空白對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），說明黃芪甲苷制成二元醇質體凝膠及橡皮生肌膏組均能促進皮膚創面愈合。

3 討 論

在進行黃芪甲苷二元醇質體凝膠體外釋放度考察時，由于HPLC-ELSD 方法無法測定較低濃度樣品中的黃芪甲苷含量，所以本實驗采用實驗室前期建立的黃芪甲苷UPLC-MS/MS 測定方法中的色譜條件和質譜條件［13］測定釋放介質中藥物濃度，并對方法專屬性試驗、加樣回收率試驗等項目進行了方法學考察，結果均符合規定。

橡皮生肌膏源自明代外科大家陳實功的《外科正宗》，具有潤膚生肌、祛腐生新、解毒鎮痛、活血化瘀、消炎長皮的功效，有利于加強局部抗感染能力，加快瘢痕組織軟化，促進瘢痕吸收，對促進創面愈合具有很好效果［14］，所以本實驗選擇橡皮生肌膏作為陽性對照組藥物。

大鼠皮膚創面愈合的初步考察試驗表明，黃芪甲苷二元醇質體凝膠組及橡皮生肌膏組均能促進大鼠皮膚創面愈合，且2 組效果相當，分析原因可能是黃芪甲苷二元醇質體凝膠應用二元醇質體技術可以增加黃芪甲苷在皮膚中的滯留量。且凝膠處方中添加的羧甲基殼聚糖，是殼聚糖在強堿性條件下與氯乙酸反應，并在分子結構中導入羧甲基形成的衍生物，幾乎為無定形狀態，因此具有良好的水溶性，可以單獨或與卡波姆等其他成分共同用作凝膠劑的基質［15］。有研究表明：高、低分子量的羧甲基殼聚糖組均可以有效促進傷口愈合，創面愈合時間比生理鹽水對照組縮短了41%，且沒有明顯的炎癥或感染現象，具有良好的促創面愈合作用［16］。細胞水平實驗表明：羧甲基殼聚糖可以減少皮膚傷口處的膠原分泌，有助于減少瘢痕的形成［17］，這可能是黃芪甲苷二元醇質體凝膠組能促進創面愈合的原因。