放血和刮痧療法單一及聯合應用對全身炎癥反應綜合征模型大鼠炎癥的影響

林麗莉，李一純，湯文政，吳麗華，林 棟*

（1.福建省中醫藥科學院，福建 福州 350003；2.福建中醫藥大學針灸學院，福建 福州 350122；3.福建省立醫院，福建 福州 350001）

在針灸臨床干預體系中，大多采用多種干預方式的聯合應用，但是不同干預方式聯合應用會產生增效性或等效性，抑或是減效性，卻常常被忽略［1］。針灸療法不同的干預方式之間存在協同或拮抗的可能，已有研究提示體表干預的物理刺激方式對機體產生最大效應與其干預次序存在相關性［1-2］。全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）屬于中醫外感熱病學及溫病學的范疇，以“熱毒”“痰”“瘀”“虛”為基本證候特征［3］。基于經絡腧穴理論為指導的刮痧、放血干預方式屬于針灸臨床干預體系的一部分，具有開腠理、行氣血、散邪毒的功效。本研究通過制備SIRS模型大鼠，以大鼠血清、肺組織關鍵炎性因子含量與肺病理組織形態學的改變作為主要觀察指標，探究刮痧和放血療法單一和聯合應用對SIRS 模型大鼠炎癥反應的效應，以期為臨床干預及SIRS 等相關感染性疾病的救治策略提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選用SPF 級健康成年雌性Wistar大鼠42 只，6～8 周齡，體質量（200±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF 級動物實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007。動物飼養于恒溫、恒濕環境，恒定溫度（22±1）℃，濕度為50%，光照明暗時間各12 h 交替，大鼠自由進食與飲水。本實驗經福建中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（批件號：FJTC-MIACUC2020059）。

1.2 試劑與器材 酵母多糖（美國Sigma 公司，型號：Z4250-5G）；注射用烏司他丁（廣東天普生化醫藥股份有限公司）；醫用液體石蠟（南昌華鑫醫藥化工有限公司）；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、大鼠白細胞介素-6（IL-6）、大鼠γ 干擾素（IFN-γ）ELISA檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；一次性使用末梢采血針（天津華鴻科技股份有限公司）；小型刮痧板（重慶譚木匠工藝品有限公司）；全自動動物血液分析儀（日本Sysmex 公司）；RM2235石蠟切片機（德國LEICA 公司）；ZT-14V1 生物組織自動脫水機（孝感亞光醫用電子技術有限公司）。

1.3 酵母多糖-石蠟油混懸液的制備 首先在磁力攪拌器上放置已準確量取100 mL 液體石蠟的玻璃量杯，接著手持20 mL 注射器針頭，將5 g 酵母多糖粉劑逐漸少量撥入液體石蠟中，混勻后換裝至EP 管中高頻振蕩15 min；而后使用100 ℃水浴進行滅菌80 min，待冷卻后放置于4 ℃冰箱儲存備用。使用前需使用恒溫水浴鍋中加熱至40 ℃，并充分搖勻，繼而制備出50 mg/mL 酵母多糖-石蠟油混懸液以待使用。

1.4 實驗分組與造模方法 將42 只SPF 級Wistar雌性大鼠依照隨機數字表法分成空白組、模型組、放血組、刮痧組、刮痧＋放血組、放血＋刮痧組、烏司他丁組，每組6 只。空白組不予造模，以大鼠體質量500 mg/kg 腹腔注射滅菌石蠟，其余6 組參照Goris 法［4］并結合參考文獻［5-7］建立SIRS 大鼠模型。造模前18 h 大鼠禁食，不禁水，自由活動。造模時測直腸溫度，以大鼠體質量500 mg/kg 腹腔注射50 mg/mL 酵母多糖-石蠟油混懸液，當造模大鼠的直腸溫度較正常或造模前升高1 ℃、白細胞總數大于正常值2 倍時，即判定SIRS 大鼠模型造模成功［8］。

1.5 干預方法 參考《實驗針灸學》［9］及人體相關穴位的解剖標志，采用擬人對照法取穴，放血部位取大鼠雙側少商穴，定位和取穴方法參考文獻［10-11］，取第1 指橈側、爪根角旁開0.1 cm 處；刮痧部位取大鼠雙側肺俞穴（第3 胸椎下兩旁肋間）和大椎穴（背部正中第7 頸椎與第1 胸椎之間）。① 刮痧操作：輕按大鼠頭部進行固定，持小型刮痧板與皮膚夾角約在45°～60°，自頭部向尾部方向進行刮痧，操作頻次為2 次/s，持續60 s。② 放血操作：在大鼠雙側少商穴處使用一次性無菌末梢采血針，固定大鼠前肢，直刺穴位后迅速出針，出血量約4～6滴（約0.2～0.3 mL）。③ 烏司他丁給藥：根據注射用烏司他丁的臨床使用說明［12］，結合《實驗針灸學》中“實驗動物與人用藥量的換算方法”［9］，本實驗中烏司他丁組的給藥劑量定為2.7 萬U/kg。④ 各組具體干預方法：空白組和模型組僅模擬抓取動作；烏司他丁組分別于造模后2、24 h 進行腹腔注射烏司他丁；放血組分別于造模后2、24 h 進行放血；刮痧組分別于造模后2、24 h 進行刮痧；放血＋刮痧組于造模后2 h 進行放血，于造模后24 h 進行刮痧；刮痧＋放血組于造模后2 h 進行刮痧，于造模后24 h進行放血。

1.6 取材

1.6.1 收集血清 采集大鼠腹主動脈血3～4 mL，將血液標本置于一次性真空采血管中靜置1～2 h，使其血清與血漿初步分層；而后使用高速冷凍離心機以4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，將血清從采血管移置EP 管內，進行二次離心操作；最后將所得血清樣本分裝，并放入-80 ℃冰箱保存備用。

1.6.2 肺組織取材 在采集完腹主動脈血后按大鼠體質量0.5 mL/100 g 腹腔注射20%烏拉坦對大鼠進行麻醉，解剖大鼠取出肺組織，并使用預冷的0.9% NaCl 洗滌，去除水分；取大鼠左肺組織置于提前裝有4%多聚甲醛固定液的EP 管中用于HE 染色；取大鼠右肺下葉組織放置于EP 管中并即刻放入干冰，短時間內轉移至-80 ℃冰箱保存，用于檢測炎癥因子含量。

1.7 觀察指標

1.7.1 肺組織病理形態學觀察 左肺組織在4%多聚甲醛固定液中固定24 h 后，使用流水沖洗清除組織上的多聚甲醛殘留液體，隨后放置于70%乙醇中過夜后進行梯度脫水、透明及浸蠟、石蠟包埋、HE染色，HE 染色后的載玻片放置于干燥通風的櫥窗內自然風干封片后，在光鏡下觀察肺組織病理學變化。1.7.2 大鼠血清TNF-α、IL-6和INF-γ含量檢測 取出保存在-80 ℃冰箱的血清樣本，取上清液加樣于酶標本孔，余下操作嚴格按照相應指標ELISA 檢測試劑盒說明書進行，用酶標儀測定吸光度后繪制標準曲線，計算TNF-α、IL-6 和INF-γ 含量。

1.7.3 大鼠肺組織TNF-α、IL-6 和INF-γ 含量檢測 在一次性研磨管內加入1 mL 增強型RIPA 裂解液、10 μL PMSF 蛋白酶抑制劑及一次性研磨磁珠，稱取100 mg 右肺組織，剪碎后放入各研磨管內；研磨管置于研磨機中已提前預冷的金屬槽內，并以64 Hz 頻率研磨50 s，共運行2 次使其充分勻漿；研磨后使用移液槍將上清液抽取至新的EP 管內，并置于高速冷凍離心機中以4 ℃、12 000 r/min 離心10 min；取上清液加樣于酶標本孔，余下操作嚴格按照相應指標ELISA 檢測試劑盒說明書進行，用酶標儀測定吸光度后繪制標準曲線，計算TNF-α、IL-6 和INF-γ 含量。

1.8 統計學方法 采用SPSS 23.0 軟件進行實驗數據處理和分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD-t檢驗，若方差不齊則采用Games-Howell 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 7 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ含量比較 見表1。

表1 7 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ 含量比較（±s） pg/mL

表1 7 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ 含量比較（±s） pg/mL

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與烏司他丁組比較，3） P＜0.05；與刮痧組比較，4） P＜0.05。

IFN-γ 64.81±16.32 198.19±33.231）132.16±30.09 153.72±36.47 103.16±23.962）107.63±14.972）124.39±31.08組別空白組模型組烏司他丁組刮痧組放血組放血＋刮痧組刮痧＋放血組n6 6 6 6 6 6 6 TNF-α 4.37±1.79 29.29±2.181）14.29±2.452）16.63±1.662）11.56±3.392）12.72±3.412）12.18±6.372）IL-6 65.82±20.12 238.68±46.421）209.39±14.31 203.90±29.47 184.65±28.282）141.17±39.132）3）4）174.84±60.092）

2.2 7 組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IFN-γ 含量比較 見表2。

表2 7 組大鼠肺組織炎性因子TNF-α、IL-6、IFN-γ 含量比較（±s） pg/mL

表2 7 組大鼠肺組織炎性因子TNF-α、IL-6、IFN-γ 含量比較（±s） pg/mL

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

IFN-γ 40.09±1.87 66.00±6.191）50.98±6.552）47.71±4.542）44.12±1.252）45.85±3.592）49.53±4.862）組別空白組模型組烏司他丁組刮痧組放血組放血＋刮痧組刮痧＋放血組n6 6 6 6 6 6 6 TNF-α 46.89±1.86 69.85±8.061）60.76±4.06 55.42±1.98 53.79±2.562）53.17±3.882）55.94±3.96 IL-6 32.91±13.01 226.34±73.931）98.32±33.80 75.84±37.582）63.16±30.492）56.56±21.592）78.57±26.242）

2.3 7 組大鼠肺組織病理形態學比較 7 組大鼠肺組織HE 染色結果顯示：空白組肺泡結構正常、清晰且完整，無明顯病理改變，肺泡之間無明顯融合，肺泡壁無增厚，肺泡腔內及肺泡壁未見明顯的炎癥細胞滲出、浸潤及透明膜形成等情況；模型組存在明顯肺組織結構破壞，肺泡壁明顯增厚，肺泡腔塌陷、縮小、變狹長，肺間質以炎癥改變為主，在肺間質及肺泡腔內明顯可見有大量中性粒細胞、單核巨噬細胞等炎癥細胞浸潤，部分肺間質區域有紅細胞滲出、充血、水腫、肺實變等病理改變；而各干預組大鼠肺組織仍有部分肺泡融合、肺泡壁增厚情況，但已有明顯改善，與模型組比較，肺泡結構較為明晰，肺泡腔及肺間質仍見有少量炎癥細胞聚集。見圖1。

圖1 7 組大鼠肺組織病理形態學HE 染色圖（×200）

3 討 論

根據SIRS 炎癥急性反應期所表現出“熱”“毒”的病機與臨床特征，SIRS 屬中醫溫病學的范疇，因此SIRS 也常被辨為“痧證”［13-15］。清初瘟疫派醫家郭志邃所著《痧脹玉衡》有言：“血肉痧，看青紫筋刺之，則痧毒有所泄”“痧在肌膚者，刮之而愈；痧在血肉者，放之而愈”“滿則瀉之，菀陳則除之”，可見具有開腠理、行氣血和散邪毒功效的放血與刮痧療法在古代溫病急救中已得到了廣泛應用。在針灸臨床干預中，大多采用刮痧和放血聯合應用的治療策略［16-17］，然而放血與刮痧單一或聯合應用，在SIRS炎癥急性反應期的干預過程中是否會帶來不同的治療效應？以及聯合應用產生的效應是否具有增效性，或僅僅具有等效性，抑或是減效的作用，這些問題目前尚未有系統的研究與解釋。

本研究結果表明刮痧和放血療法能夠抑制促炎因子的釋放，從而對SIRS 所導致的大鼠急性肺部炎癥反應能夠起到一定的緩解和保護作用。刮痧所導致的表皮輕度促炎反應，可激活抗原提呈細胞及皮膚免疫反應，促使皮膚肥大細胞釋放組胺等物質，從而誘導體液免疫應答［18］，最終降低TNF-α、IL-6、INF-γ 的表達。另有研究表明：放血可以使顱腦創傷后的大鼠腦干IL-1β、TNF-α 的表達降低，并能夠抑制JNK/p38MAPK 信號通路，改善炎癥反應［19］；手十二井穴放血能夠使大鼠血漿IL-6 水平降低［20］。本研究發現多數干預組對炎癥因子均有影響，但多數干預組血清和肺組織各炎癥因子含量組間比較，差異均無統計學意義，表明放血和刮痧療法單一和聯合應用對SIRS 模型大鼠的治療效應相當，不同次序的放血和刮痧聯合應用對SIRS 模型大鼠炎癥反應的抑制作用亦無差別。