腸潤方對慢傳輸型便秘小鼠腸道傳輸功能的影響及機制研究

洪燕秋，林金榮，魏曉玲，肖秋平*

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬廈門中醫(yī)院，福建 廈門 361009；2.廈門市盆底動力學重點實驗室，福建 廈門 361009）

慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是慢性便秘最常見的類型，發(fā)病率高，約占慢性便秘的46%～74%［1］。結(jié)腸動力障礙是STC 最為重要的病理因素，也是目前研究的重點。多數(shù)研究認為STC 發(fā)生與腸神經(jīng)系統(tǒng)異常、神經(jīng)遞質(zhì)改變、結(jié)腸Cajal 細胞功能異常、自身免疫功能破壞、腸內(nèi)微生態(tài)環(huán)境失衡等多種因素相關(guān)［2-4］，結(jié)腸動力不足引起腸道傳輸功能減退是其重要的病理機制。腸潤方是廈門市中醫(yī)院耿學斯教授治療便秘的經(jīng)驗方，前期研究顯示本方治療功能性便秘近期有效率達90.0%，隨訪3 個月有效率達67.5%［5-6］，療效顯著，但作用機制尚不明確。本實驗采用腸潤方干預STC小鼠，探討其對腸道傳輸功能的影響和作用機制，為進一步臨床研究提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性C57BL/6J 小鼠60 只，5～6 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司，許可證號：SCXK（閩）2018-0003。動物飼養(yǎng)于廈門大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2018-0009。將小鼠置于獨立通風籠具系統(tǒng)（IVC）飼養(yǎng)，室溫22～24 ℃，相對濕度50%～60%，光暗周期各12 h，經(jīng)滅菌的全價配合飼料喂養(yǎng)，自由采食水。本實驗由廈門大學實驗動物倫理委員會審核批準（批件號：XMULAC20210057）。

1.2 實驗藥物 腸潤方由生白術(shù)20 g、枳實15 g、檳榔15 g、玄參15 g、麥冬15 g、火麻仁15 g 組成，藥材購自康美藥業(yè)股份有限公司。將上藥以蒸餾水浸泡30 min 后，煎煮2 次，每次用紗布過濾，將2 次濾液合并即為腸潤方水煎液。將腸潤方水煎液旋蒸濃縮，高、中、低劑量分別濃縮至含生藥濃度為0.5、1.0、2.0 g/mL，藥物滅菌后于-4 ℃冰箱保存，每周制備1 次。復方地芬諾酯片（新鄉(xiāng)市常樂制藥有限責任公司，產(chǎn)品批號：H41020205），用研缽研碎后加生理鹽水配制成所需濃度的復方地芬諾酯混懸液。

1.3 實驗試劑 印度墨汁（福州飛凈生物科技有限公司，批號：20210520）；蛋白質(zhì)定量試劑盒（美國Thermo Fisher 公司，批號：QB214754）；1∶1 000 稀釋的蛋白基因產(chǎn)物9.5（PGP9.5）抗體（批號：14730）、受體酪氨酸激酶（c-kit）抗體（批號：18696）、干細胞因子（SCF）抗體（批號：26582）、β-actin 抗體（批號：20536）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.4 實驗儀器 高速低溫冷凍離心機（美國Scilogex公司，批號：D3024R）；GloMax 酶標儀（美國Promega公司，批號：GM3030）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海民儀電子有限公司，批號：N-1100V）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司，批號：DGG-9070A）；電泳儀（美國Bio-Rad 公司，批號：041BR126545）；凝膠成像分析系統(tǒng)（上海培清科技有限公司，批號：JS-682D）。

2 實驗方法

2.1 動物造模與分組 將60 只C57BL/6J 雄性小鼠隨機分為正常組15 只和造模組45 只。造模組按體質(zhì)量12.5 mg/（kg·d）灌胃復方地芬諾酯混懸液制備STC 小鼠模型，正常組予等劑量生理鹽水灌胃，每日1 次，造模2 周。2 周后每組各隨機抽取5 只小鼠，禁食不禁水16 h，按體質(zhì)量0.2 mL/20 g 灌胃滅菌處理的印度墨汁，記錄小鼠首粒黑便排出時間。收集小鼠6 h 糞便，稱重（濕重）后放入電熱恒溫干燥箱中75 ℃干燥8 h，稱量干燥后的糞便重量（干重），計算糞便含水率［糞便含水率＝（濕重－干重）/（濕重）×100%］。禁食不禁水16 h，按體質(zhì)量0.2 mL/20 g 灌胃滅菌處理的印度墨汁，40 min 后頸椎脫臼處死，迅速剖腹摘除從幽門到盲腸末端的全部腸管，在無張力狀態(tài)下記錄腸道全長及墨汁前端到幽門的距離，計算墨汁推進率［墨汁推進率＝墨汁末端到幽門的距離/腸道總長度×100%］。與正常組比較，造模組首粒黑便排出時間延長、糞便含水率降低、墨汁推進率升高（P＜0.05），則判定造模成功，見表1。將剩余40 只造模組小鼠分為模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10 只。

表1 造模后2 組小鼠首粒黑便排出時間、糞便含水率、墨汁推進率比較（±s）

表1 造模后2 組小鼠首粒黑便排出時間、糞便含水率、墨汁推進率比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05。

墨汁推進率/%61.95±7.51 42.23±6.221）組別正常組造模組n5 5首粒黑便排出時間/min 54.70±7.20 167.80±17.711）糞便含水率/%51.73±6.06 43.53±7.271）

2.2 給藥 給藥劑量根據(jù)人和動物間按體表面積折算的等效劑量系數(shù)9.1 倍換算［7］，高、中、低劑量組按體質(zhì)量24.7、12.35、6.175 g/（kg·d）灌胃腸潤方水煎液，模型組、正常組按體質(zhì)量12.5 mL/（kg·d）灌胃生理鹽水，連續(xù)干預2 周。

2.3 取材 末次給藥結(jié)束后，小鼠禁食不禁水16 h，脫頸椎處死后切開腹部取出幽門到直腸末端肛管上方的全部腸管組織，截取結(jié)腸，取出腸道內(nèi)容物，剪開腸壁，用0.9%生理鹽水將腸管沖洗干凈后用OTC 保鮮劑固定，放置于凍存管，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。

2.4 觀察指標

2.4.1 首粒黑便排出時間、糞便含水率、墨汁推進率 操作和計算方法同“2.1”項下方法。

2.4.2 Western blot 檢測PGP9.5、c-kit、SCF 蛋白表達量 稱取結(jié)腸組織100 mg，裂解后取上清，采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗（PGP9.5、ckit、SCF）孵育；添加對應的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液孵育，ECL 化學發(fā)光顯色，曝光顯影。采用ImageJ 軟件進行灰度分析，結(jié)果與內(nèi)參β-actin 灰度比值進行相對定量分析。

2.4.3 qPCR 檢測PGP9.5、c-kit、SCF mRNA 相對表達水平 稱取約100 mg 結(jié)腸組織樣品，加液氮研磨，加入裂解液后勻漿，提取總RNA，微量酶標儀測定RNA 濃度。將樣品RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為 模板，β-actin 為內(nèi)參，進行qPCR 檢測：預變性94 ℃ 5 min，35 個循環(huán)，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃30 s。反應結(jié)束后根據(jù)2-ΔΔCt計算目標基因的mRNA表達水平。引物序列見表2。

表2 引物序列

2.5 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學分析。計量資料屬正態(tài)分布以（±s）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 5 組小鼠首粒黑便排出時間、糞便含水率、墨汁推進率比較 見表3。

表3 5 組小鼠首粒黑便排出時間、糞便含水率、墨汁推進率比較（±s）

表3 5 組小鼠首粒黑便排出時間、糞便含水率、墨汁推進率比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05。

墨汁推進率/%83.00±10.74 27.75±7.771）77.32±10.372）3）80.55±14.482）3）60.73±14.092）組別正常組模型組高劑量組中劑量組低劑量組n 10 10 10 10 10首粒黑便排出時間/min 95.80±11.20 265.00±45.051）128.50±42.362）135.10±30.802）136.50±43.372）糞便含水率/%50.46±5.81 39.47±5.731）45.46±4.692）3）47.71±8.362）43.11±3.42

3.2 5 組小鼠結(jié)腸PGP9.5、c-kit、SCF 蛋白表達量比較 見表4、圖1。

圖1 5 組小鼠結(jié)腸PGP9.5、c-kit、SCF 蛋白條帶圖

表4 5 組小鼠結(jié)腸PGP9.5、c-kit、SCF 蛋白表達量比較（±s）

表4 5 組小鼠結(jié)腸PGP9.5、c-kit、SCF 蛋白表達量比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.05。

組別正常組模型組高劑量組中劑量組低劑量組SCF 1.00±0.15 0.16±0.041）0.57±0.052）4）0.42±0.032）3）0.54±0.202）n 10 10 10 10 10 PGP9.5 1.00±0.07 0.60±0.051）0.84±0.072）3）0.70±0.02 0.64±0.03 c-kit 1.00±0.05 0.34±0.131）0.99±0.042）3）4）0.70±0.112）0.60±0.012）

3.3 5 組小鼠結(jié)腸PGP9.5、c-kit、SCF mRNA 相對表達水平比較 見表5。

表5 5 組小鼠結(jié)腸PGP9.5、c-kit、SCF mRNA相對表達水平比較（±s）

表5 5 組小鼠結(jié)腸PGP9.5、c-kit、SCF mRNA相對表達水平比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.05。

組別正常組模型組高劑量組中劑量組低劑量組SCF 1.00±0.27 0.28±0.101）0.91±0.072）3）4）0.65±0.112）0.46±0.12 n 10 10 10 10 10 PGP9.5 1.00±0.23 0.29±0.121）0.87±0.192）3）4）0.50±0.14 0.22±0.10 c-kit 1.00±0.16 0.25±0.111）0.96±0.112）3）0.72±0.122）0.53±0.142）

4 討 論

STC 屬于中醫(yī)“便秘”的范疇，患者病程長，以老年人居多。年老虛損或長期使用瀉藥導致脾胃功能受損，脾虛失運，一則氣機升降失常，腸腑推動不足，二則脾虛無法為胃行其津液，脾陰不足，氣血津液失于合降而不能濡潤大腸，最終導致腸腑傳導失職，糟粕滯結(jié)，釀生便秘，因此，脾虛兼有氣滯不運是STC 的病機關(guān)鍵。STC 以脾虛為本，氣滯為標，屬虛實夾雜之證，可兼有血虛、津虧等。腸潤方是我院耿學斯教授治療便秘的經(jīng)驗方，具有運脾行氣、養(yǎng)陰潤腸的功效，應用臨床療效顯著。

STC 的發(fā)病機制復雜，其關(guān)鍵病理機制是腸道動力不足。腸道動力涉及腸肌的收縮運動、腸壁敏感性、腸道的生物力學功能和內(nèi)容物的腔內(nèi)流動等一系列復雜的生理問題［8］。腸道運動受中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）和自主神經(jīng)系統(tǒng)共同支配，其中ENS 通過廣泛分布、聯(lián)系密切的神經(jīng)叢對腸道運動、分泌進行獨立調(diào)控，在三者中起關(guān)鍵作用。PGP9.5 是神經(jīng)纖維中的特異性泛素羥基水解酶，對神經(jīng)纖維特異性強。對PGP9.5 進行定位發(fā)現(xiàn)：STC 患者肌間及黏膜下層神經(jīng)元數(shù)量減少50%，神經(jīng)節(jié)之間的距離增大，并出現(xiàn)神經(jīng)元腫脹和軸突變性，其病理改變與癥狀嚴重程度相關(guān)［9］。另一方面，結(jié)腸Cajal 間質(zhì)細胞（ICC）被認為是胃腸運動的起搏器，ICC 接受神經(jīng)信號后產(chǎn)生去極化電流，將產(chǎn)生的慢波以及興奮性或抑制性神經(jīng)遞質(zhì)傳遞至平滑肌細胞，引起平滑肌的舒張和收縮，調(diào)控腸道運動。STC 患者結(jié)腸組織中ICC 數(shù)量與體積較正常人明顯降低［10-11］，并伴見ICC 發(fā)育不全［12］。ICC 的發(fā)育、分化及表型維持由受體酪氨酸激酶c-kit 及SCF調(diào)控［13］。

本研究中模型組小鼠首粒黑便排出時間延長，糞便含水率和墨汁推進率均下降，表明造模成功。腸潤方高、中、低劑量組干預均能明顯縮短首粒黑便排出時間，提高糞便含水率及墨汁推進率，表明腸潤方可改善STC 小鼠腸道傳輸功能。模型組小鼠結(jié)腸組織PGP9.5、c-kit、SCF 蛋白表達量和mRNA 相對表達水平明顯降低，表明STC 小鼠存在腸神經(jīng)受損、ICC數(shù)量與功能異常。腸潤方干預后可提高小鼠結(jié)腸組織PGP9.5、c-kit、SCF 蛋白表達量和mRNA 相對表達水平，其中高劑量組干預效果更為顯著，表明腸潤方對腸道神經(jīng)元及ICC 的表達具有促進作用?，F(xiàn)代藥理學研究表明：白術(shù)、枳實可興奮性神經(jīng)元，調(diào)節(jié)腦腸肽、ICC 表達等從而促進胃腸道排空和推進［14-15］；檳榔有效成分檳榔堿可興奮M 型受體，刺激腸道平滑肌收縮，促進腸道運動［16］；火麻仁富含油脂和膳食纖維，有利于潤滑腸道，增強腸道蠕動［17］；麥冬中含有多種多糖和甾體皂苷，可保護黏膜屏障、促進血液循環(huán)［18］；玄參中含有的環(huán)烯醚萜類、苯丙素類成分，具有抗氧化、抗細胞凋亡、促進血流動力學恢復的作用［19］。

綜上所述，腸潤方治療可顯著縮短STC 小鼠首粒黑便排出時間，提高糞便含水率和墨汁推進率，對腸道傳輸功能具有促進作用，其機制可能通過提高PGP9.5、c-kit、SCF 蛋白表達量和mRNA 相對表達水平，恢復腸神經(jīng)損傷，提高ICC 的數(shù)量和功能，從而恢復腸道動力，有效治療STC。