miR-199對結直腸癌細胞增殖、侵襲的影響及機制

甘新彪，劉名奎

1 武漢市武昌醫院肛腸科，武漢 430000；2 武漢市武昌醫院普外科

結直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，也是全球范圍內癌癥相關死亡的主要原因［1-2］。全球范圍內，結直腸癌發病率和死亡率在所有腫瘤中均排第3位［3］。化療與手術仍是結直腸癌的主要治療策略。盡管在開發新療法方面取得了進展，結腸癌患者預后仍然較差［4-5］。約有50%接受手術切除和積極化療的患者會復發［6］，轉移和復發是導致結直腸癌患者預后不佳的重要因素［7］。深入探討結直腸癌分子機制對開發新的治療方法及改善預后至關重要［8-9］。微小RNA（miRNA）是一類非編碼RNA，通過與相應靶信使RNA（mRNA）的3'-非翻譯區（3'-UTR）結合調節細胞生物學過程，在細胞增殖、遷移、侵襲和分化過程中發揮關鍵作用［10］。miRNA 與腫瘤轉移、耐藥性和復發密切相關［11］。miR-210、miR-21 和miR-126已被確定為診斷大腸癌的標志物［12］。miR-199 是新發現的miRNA，其在肝細胞癌中表達下調，且抑制上皮間充質轉化［13］。研究顯示，在非小細胞肺癌中，miR-199 可抑制體外培養的肺癌細胞增殖、侵襲，并促進細胞凋亡［14］。但miR-199 在結直腸癌中的表達情況及作用機制尚不清楚。2020 年1 月—2021 年1月，本研究旨在探討結直腸癌細胞系中miR-199 表達及對增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人結直腸癌細胞系（LOVE、SW620、SW480、HT29、DLD-1 細胞）和人正常結腸上皮細胞系（HCoEpiC 細胞）均購于美國ATCC 細胞中心。改良版Eagle 培養基（DMEM）、RPMI-1640 培養基和LipofectamineTM3000 試劑購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。帶有8.0 μm 孔聚碳酸酯膜插入物的Transwell 板購于美國Corning 公司，Matrigel 購自美國BD Biosciences 公司。螢火蟲和海腎雙螢光素酶檢測試劑盒購于北京碧云天生物技術有限公司。實時熒光定量PCR 試劑盒購于美國Life Technologies 公司，miR-199mimics、mimic-NC、轉鐵蛋白受體1（TFR1）過表達質粒均由廣州銳博生物科技有限公司合成。TFR1 和GAPDH 一抗及二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養、分組及轉染 將人正常結腸上皮細胞系HCoEpiC 保存在RIPM-1640 中，結直腸癌細胞系（LOVE、SW620、SW480、HT29 和DLD-1）保存在DMEM培養基中，均在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h。吸出細胞培養液，放入離心管中，1 000 r/min 離心5 min（離心半徑165 mm），吸掉上清液，加入適量新鮮培養基，混和均勻，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中培養。傳至三代，取對數生長期細胞用于實驗。將細胞隨機分為miR-199 過表達組、陰性對照組及miR-199+TFR1 共 表 達 組（miR-199mimics+TFR1組），用LipofectamineTM3000 轉染試劑分別將miR-199mimics、mimic-NC、miR-199mimics+TFR1 過表達質粒轉染至以上各組細胞，另取部分未轉染細胞作為空白對照組。

1.3 miR-199、TFR1 mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取各組細胞，用TRIzol 試劑從細胞中提取總RNA，用cDNA 合成試劑盒反轉錄以獲得cDNA。用iQ SYBR Green Supermix Kit（Bio-Rad）行qRT-PCR實驗，基因表達量用循環閾值（Ct）法計算，并將GAPDH 作內部對照。miR-199 正向引物序列5'-TGTGTAGTAGTTTTTGTTTATAGTG-3'、反向引物序列5'-CCAACTCTACAACTACTAAATC-3'；TFR1正向引物序列5'-GCAGGATGAAGGGAGGACAC-3'、反向引物序列5'-GCGATCTGTCAGAGCACCTC-3'；GADPH 正向引物序列5'-GTGAACCATGAGAAGTATG-3'、反向引物序列5'-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3'。將 引 物SYBR Green I Master Mix 和DNA模板混合。反應體系：2× SYBR Green Mix 10 μL，RT Product 2 μL，Bulge-LoopTMmiRNA Forward Primer 0.8 μL，Bulge-LoopTMReverse Primer 0.8 μL，加ddH2O 至 20 μL。反應條件：95℃預變性10 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s 共45個循環。實驗重復3次。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用MTT 實驗。取各組細胞，以4×106/孔置于96 孔板中，分別于0、24、48、72 h 每孔加入10 μL MTT 溶液和90 μL 培養液，37 ℃下培養2 h，用酶標儀測定490 nm 處吸光度（A490）值。

1.5 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。將懸浮在100 μL 無血清DMEM 中的2×104個細胞接種到小室的上層隔室中，在上層隔室中預涂100 μL基質膠，將800 μL 含10% FBS 的DMEM 添加到該室的下層隔室中；將細胞用4%多聚甲醛固定30 min，并用0.1%結晶紫染色；用棉簽小心除去上室中的非穿膜細胞。隨機選擇5 個視野，用Olympus IX70倒置顯微鏡（×200）拍照，用Image-Pro Plus6.0 軟件計數穿膜細胞。實驗重復3次。

1.6 TFR1 蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞，用RIPA 緩沖液裂解，總蛋白進行高溫變性定量，按每孔50 μg 進行蛋白電泳，電泳條件：80 V 40 min，120 V 2 h，轉膜至NC 膜，采用5%脫脂奶粉封閉2 h，并與TFR1一抗（1∶400）及GAPDH一抗（1∶400）在4 ℃下孵育過夜；漂洗3次，加入二抗（1∶500）并常溫孵育2 h；漂洗3 次，用ECL 試劑盒檢測條帶，GAPDH 用作內參對照。目的蛋白相對表達量=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.7 miR-199 靶基因檢測 采用雙熒光素酶報告基因實驗。用生物學軟件TargetScan 分析miR-199的靶基因，發現TFR1 為miR-199 的靶基因。將TFR1 基因的3'-UTR 區域的全長克隆和擴增，PCR產物克隆到pGL4.49 載體克隆位點，其在激活時表達螢火蟲熒光素酶，以形成pGL4.49-TFR1-WT載體或pGL4.49-TFR1-MUT 載體。將含有miR-199 的野生型（WT）或突變型（MUT）結合位點的TFR1基因的3'-UTR 區克隆到pGL4.49［luc2p/TCF-LEF RE/Hygro］載體中，而表達海藻熒光素酶的pGL4.73［hRluc/SV40］載體用于控制轉染效率。按照說明書，將貼壁細胞分別與pGL4.49-TFR1-wt 載體或pGL4.49-TFR1-mut 載 體 和pGL4.73［hRluc/SV40］載體與Lipofectamine LTX＆PLUS 試劑共轉染。孵育24 h 后，用TECAN Infinite F500 平臺和Dual-Luciferase Reporter Assay System 檢測細胞，并檢測熒光素酶信號，將螢火蟲熒光素酶活性標準化為海腎熒光素酶活性。計算兩種熒光素酶的相對活性（ΔCt）。實驗重復3次。

1.8 統計學方法 采用Graphpad2.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，進一步兩兩比較用Tukey多重比較檢驗法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌細胞系中miR-199 的表達 結直腸癌細胞系（LOVE、SW620、SW480、HT29、DLD-1 細胞）、人結腸上皮細胞系HCoEpiC 細胞中miR-199 相對表達量分別為2.12 ± 0.25、1.38 ± 0.15、2.49 ±0.31、2.18 ± 0.19、2.15 ± 0.28、12.10 ± 0.59。人結直腸癌細胞系中miR-199 相對表達量均低于人結腸上皮細胞系（P均＜0.05），且SW620 細胞中miR-199相對表達量最低，故選SW620細胞為實驗細胞。

2.2 轉染效率 miR-199 過表達組、陰性對照組、空白對照組miR-199 相對表達量分別為8.10 ±0.93、1.38 ± 0.36、1.35 ± 0.33。miR-199 過表達組miR-199 相對表達量高于陰性對照組、空白對照組（P均＜0.05）。

2.3 過表達miR-199 對SW620 細胞增殖能力的影響 見表1。

表1 各組轉染48、72 h細胞增殖能力（A490值）比較（± s）

表1 各組轉染48、72 h細胞增殖能力（A490值）比較（± s）

注：與miR-199過表達組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組陰性對照組miR-199過表達組A490值轉染72 h 1.36 ± 0.52#1.42 ± 0.41#0.65 ± 0.28#轉染48 h 0.67 ± 0.25#0.71 ± 0.31#0.41 ± 0.18

2.4 過表達miR-199 對SW620 細胞侵襲能力的影響 miR-199 過表達組、陰性對照組、空白對照組侵襲細胞數分別為（123 ± 5）、（210 ± 8）、（213 ± 7）個。miR-199 過表達組侵襲細胞數少于陰性對照組、空白對照組（P均＜0.05），陰性對照組、空白對照組侵襲細胞數比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。

2.5 miR-199 的靶基因 用TargetScan 軟件分析發現，TFR1 為miR-199 潛在的預測靶基因，TFR1 存在與miR-199 結合的位點，TFR1 mRNA 的3'UTR 中存在與miR-199互補的序列。空白對照組、miR-199過表達組野生型3'UTR 的TFR1 熒光素酶活性分別為1.05 ± 0.08、0.40 ± 0.03，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；空白對照組、miR-199 過表達組突變型3'UTR 的TFR1 熒光素酶活性分別為1.04 ± 0.06、1.06 ± 0.05，比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.6 過表達miR-199對SW620細胞中TFR1表達的影響 見表2。

表2 各組TFR1表達比較（± s）

表2 各組TFR1表達比較（± s）

注：與miR-199過表達組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組陰性對照組miR-199過表達組TFR1 mRNA 4.02 ± 0.59#4.23 ± 0.48#1.83 ± 0.10蛋白1.40 ± 0.63#1.48 ± 0.52#0.63 ± 0.19

2.7 過表達TFR1對miR-199抑制SW620細胞增殖作用的影響 見表3。

表3 各組轉染24、48、72 h細胞增殖能力（A490值）比較（± s）

表3 各組轉染24、48、72 h細胞增殖能力（A490值）比較（± s）

注：與miR-199過表達組比較，#P＜0.05。

組別A490值轉染72 h 1.39 ± 0.18*1.41 ± 0.21*0.62 ± 0.13 1.45 ± 0.23*轉染48 h 0.70 ± 0.26*0.68 ± 0.21*0.41 ± 0.10 0.69 ± 0.18*轉染24 h 0.21 ± 0.04 0.23 ± 0.05 0.25 ± 0.03 0.26 ± 0.05空白對照組陰性對照組miR-199過表達組miR-199mimics+TFR1組

2.8 過表達TFR1對miR-199抑制SW620細胞侵襲作用的影響 miR-199 過表達組、陰性對照組、空白對照組、miR-199mimics+TFR1 組侵襲細胞數分別為（110 ± 19）、（212 ± 25）、（221 ± 32）、（178 ± 29）個。miR-199過表達組侵襲細胞數少于陰性對照組、空白對照組、miR-199mimics+TFR1組（P均＜0.05）。

3 討論

miRNA 在結直腸癌的發生、發展中扮演重要角色。多 種miRNA（miR-21、miR-26、miR-31、miR-141、miR-145、miR-196 和miR-200）與結直腸癌的遷移和侵襲有關［15］。識別與結直腸癌相關的miRNA及其靶基因對于理解miRNA 在結直腸癌進展中的作用至關重要。

miR-199 是一種具有多種功能的RNA 分子，其在癌癥中的作用最先是在肝細胞癌［16］中被發現。血清miR-199和miR-21可聯合診斷早期肝細胞癌，后來在肝癌組織中發現miR-199 表達顯著下調，miR-199可抑制體外培養的肝癌細胞的遷移和侵襲并抑制ROCK1 基因表達［17］。研究發現，miR-199a/b-5p 在結腸癌細胞系中表達下調，且可靶向下調GCNT2 表達，調控上皮間質轉化進程，但該文獻并未在結腸癌組織中檢測miR-199 的表達水平，也未在細胞系中研究miR-199 對細胞增殖、侵襲的影響［18］。這與本研究不同，本研究發現相較于正常腸上皮細胞系，結直腸癌細胞系中miR-199 表達顯著降低，提示其在結直腸癌中可能發揮抑癌基因的作用。研究顯示，在頭頸部鱗狀細胞癌中，miR-199 表達下調，也發揮抑癌基因的作用［19］。

本研究通過在結直腸癌細胞系（SW620）中過表達miR-199 后，結直腸癌細胞增殖能力受到顯著抑制，且細胞侵襲能力顯著降低。證實miR-199 可在體外培養的結直腸癌細胞系中發揮抑癌基因作用。為探討miR-199 參與結直腸癌發生和進展的作用機制，本研究進一步通過生物學軟件TargetScan 分析發現，TFR1 為miR-199 的靶基因，TFR1 mRNA 的3'UTR 中存在與miR-199 互補序列；雙熒光素報告基因實驗發現，miR-199 的靶基因為TFR1 基因。SW620 細胞中過表達miR-199 后，TFR1 mRNA 和蛋白表達均顯著降低。上述結果提示miR-199 的靶基因為TFR1。這與CHAO 等［18］報道的靶標不一致，原因可能是miRNA 分子有多個不同的靶基因，依據所結合的靶基因不同，所起的作用也不盡相同。

TFR1 是一種跨膜糖蛋白，其由位于3 號染色體上的3q29 上TFR1 基因編碼，可協助運鐵蛋白通過內吞作用進入細胞，在細胞的鐵循環和代謝及輔助細胞葡萄糖代謝，并參與細胞內酶的合成和分解［20］。研究顯示，在乳腺癌［21］、非小細胞肺癌［22］和惡性神經膠質瘤［23］中，TFR1 的表達均顯著增加，被認為是腫瘤治療的靶標［24］。在結直腸癌中TFR1 可參與癌細胞內鐵轉運和代謝，并且TFR1 過表達促進結直腸癌細胞增殖［25］。研究發現，在結直腸癌組織中TFR1 表達上調，且可通過激活JAK/STAT 信號通路促進細胞侵襲、增殖和腫瘤發生［26］，被認為是結直腸癌潛在的治療靶點。JAK/STAT 信號通路的激活可促進多種實體腫瘤的惡性進展，通過活性JAK 磷酸化受體細胞質區域中的酪氨酸殘基，并與STAT的結合位點結合，形成STAT 二聚體游向細胞核，結合特定的啟動子序列，調控細胞增殖、分化、凋亡等基因轉錄過程［27］。TFR1 表達上調與肝細胞癌的惡性表型相關，并且可促進癌癥干細胞增殖和侵襲［28］。本研究發現，miR-199 過表達組侵襲細胞數少于其他三組，且miR-199過表達組A490值低于其他三組；而同時轉染miR-199 mimics 和TFR1 質粒，可減弱miR-199 介導的對SW620 細胞增殖、侵襲的抑制作用。說明miR-199 是通過調控TFR1 的表達影響細胞增殖、侵襲過程。

綜上所述，miR-199 在結直腸癌細胞中表達下調，過表達miR-199通過靶向TFR1抑制SW620細胞增殖和侵襲，其可能是結直腸癌治療中有希望的分子靶標。本研究也存在不足，TFR1的潛在機制尚不完全清楚，miR-199 表達與結直腸癌患者預后的關系尚未可知，有待進一步研究。