白細胞介素4參與調控骨改建的研究進展

唐榕

1 山東大學齊魯醫學院口腔醫學院·口腔醫院骨代謝研究室 山東省口腔組織再生重點實驗室，濟南 250012；2 山東大學骨質疏松與骨礦鹽疾病研究中心；3 山東大學口腔醫學院口腔基礎醫學教研所

骨改建是指舊骨不斷吸收，新骨不斷形成的過程，是骨骼系統經歷的有序且耦合的動態連續過程。骨改建可分為3 個階段，即破骨細胞介導骨吸收、骨髓間充質干細胞（BMSC）來源的成骨細胞被募集到骨吸收的部位、成骨細胞介導骨形成［1］。成骨細胞和破骨細胞共同參與骨改建過程，它們構成的動態平衡決定體內骨骼系統的穩定。同時，骨改建的過程受多種病理因素的影響，包括雌激素缺乏、衰老、疾病、藥物和免疫系統紊亂。免疫細胞分泌的各種可溶性介質會影響成骨細胞和破骨細胞的活性，包括細胞因子、趨化因子和生長因子［1］。其中白細胞介素（IL）是免疫細胞產生的細胞因子，能夠激活和調節免疫細胞，在炎癥反應中發揮重要作用。IL-4作為一種經典的適應性免疫調節細胞因子，不僅參與免疫功能的調節，還在皮炎、過敏、哮喘、腫瘤等疾病中發揮作用。目前，免疫微環境對骨改建中的調控作用已有較多研究報道，這逐漸成為學術界的共識，然而IL-4 參與骨改建的相關研究較少，缺乏系統和全面的概括整理［2-3］。本文對IL-4 調控骨改建的相關研究進行綜述，為IL-4的應用提供新思路。

1 IL-4參與調控骨改建的作用機制

1.1 直接影響骨改建

1.1.1 對破骨細胞的影響 IL-4 對成熟破骨細胞的生成具有抑制作用，這是目前的主流認識。有研究通過體外培養人源和鼠源的破骨細胞，發現IL-4通過STAT6 依懶性方式抑制破骨前體細胞核因子κB（NF-κB）受體激活蛋白（RANK）基因的表達，抑制破骨細胞的生成［4］。另有研究表明，IL-4以STAT6依賴的方式可逆地阻止破骨細胞生成，通過阻止NF-κB 抑制蛋白的磷酸化，阻止NF-κB 活化以及阻斷c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、p38 蛋白激酶（p38）和細胞外調節蛋白激酶（ERK）3 個絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），對破骨細胞生成發揮抑制作用［5］。此外，IL-4通過作用于破骨細胞前體，使其優先向巨噬細胞分化，從而減少破骨細胞的形成；其他研究也報道了類似的結果，在IL-4刺激后，小鼠單核巨噬細胞白血病細胞在基因和蛋白表達水平以及吞噬作用方面都表現出更多的巨噬細胞特性，相比破骨細胞更傾向于分化為巨噬細胞［6］。體內研究也驗證了這一現象，向植入物添加IL-4涂層，免疫組織化學染色分析和顯微計算機斷層掃描結果均顯示大鼠骨愈合增強，IL-4 的添加抑制了破骨細胞的分化和骨吸收［7］；另有研究證實，IL-4 能夠通過抑制NF-κB 受體活化因子配體（RANKL）的表達抑制破骨細胞的形成，并在體內直接抑制破骨細胞前體的激活。

綜上所述，IL-4調控破骨細胞的具體機制包括，IL-4在細胞膜上與IL-4Rα結合后，激活STAT6，一方面，STAT6激活后形成二聚體進入細胞核，參與調控基因表達，抑制了細胞核內RANK 的轉錄，使得與RANKL 結合的RANK 減少，抑制成熟破骨細胞的形成，同時RANK信號傳導中的遠端事件還包括NF-κB復合物、JNK、p38 和ERK 的激活；另一方面，STAT6通過直接抑制NF-κB和MAPK，抑制破骨細胞生成。

1.1.2 對成骨細胞的影響 當前關于IL-4 對成骨細胞的作用，各研究結果尚不統一。早期大量學者認為，IL-4對成骨細胞有抑制作用，近幾年一些證據表明IL-4 可以促進成骨，但是尚不足以推翻之前的認識。有研究表明，向小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（MC3T3-E1）中添加IL-4和IL-13都能夠抑制其向成骨細胞分化［8］，還有證據表明IL-4 通過下調甲狀旁腺激素（PTH）誘導的MC3T3-E1 的堿性磷酸酶活性來抑制成骨細胞的生成。然而，在正畸牙齒移動大鼠模型中，IL-4 在促進成骨細胞分化的同時抑制破骨細胞活性，從而提高正畸治療的成功率，降低復發率［9］。此外，間充質干細胞（MSCs）作為成骨細胞的來源，IL-4可以通過影響BMSCs實現對成骨的調節。有研究表明，通過向小鼠移植能夠分泌IL-4 的MSCs，增加了小鼠股骨的骨礦物質密度［10］；還有文獻證明，通過在骨生物活性水凝膠珠中負載IL-4，有效促進了骨缺損再生，IL-4 促進巨噬細胞M2 極化，增加轉化生長因子β1（TGF-β1）表達水平，進而激活BMSCs 中的TGF-α1/Smad 蛋白信號通路，并促進成骨分化［11］。然而，現有證據尚不足以明確IL-4 對成骨細胞的具體影響，仍需進一步研究。

1.2 間接影響骨改建

1.2.1 通過調控T細胞影響骨改建 IL-4與T細胞的關系密切，相關研究和報道較多。T 細胞按功能可以分為CD4+T 細胞即Th 細胞、CD8+T 細胞即細胞毒性T 細胞和調節性T 細胞（Treg）。其中CD4+T 細胞可受不同細胞因子的調控向不同譜系分化，包括Th1、Th2、Th9、Th17、Th22 和濾泡輔助性T 細胞，未受抗原刺激的初始CD4+T 細胞為Th0。IL-4 能夠誘導Th0 向Th2 分化，其中IL-4 主要由局部內環境中的自然殺傷T 細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞等產生。在此過程中，IL-4 與細胞膜上的IL-4R 結合，激活STAT6 以及下游的GATA 結合蛋白3，從而促進Th0 細胞向Th2 細胞分化［12］。Th2 細胞能夠分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 及IL-13 等，這些細胞因子能夠促進Th2 細胞增殖，進而輔助B 細胞活化，同時抑制Th1 細胞增殖。現有證據表明Th2 細胞可能起到骨保護作用。活性Th2細胞通過增強PTH 的產生來維持成骨細胞活性［13］。此外，IL-4 激活的STAT6與轉錄因子叉頭蛋白P3啟動子的非編碼片段結合，能夠抑制Th0細胞向Treg 細胞分化［12］。當TGF-β 和IL-4共同存在時能夠誘導Th0向Th9分化，TGF-β 單獨誘導Th2細胞也能產生Th9細胞，其主要分泌IL-9和IL-10，對破骨細胞具有抑制作用。

當Th 細胞受到除IL-4 外其他細胞因子刺激時，可分化為其他亞群。其中Th1細胞通過產生γ-干擾素（IFN-γ），增加泛素連接酶TNF 受體關聯因子6（TRAF6）的降解，抑制破骨細胞的形成；但IFN-γ 還能在破骨細胞形成的晚期促進破骨細胞成熟。Th1細胞也能產生腫瘤壞死因子α（TNF-α），通過增加RANKL 的表達來增加成骨細胞凋亡，并促進破骨細胞生成。另外，Th17 細胞通過分泌各種促炎因子，包括IL-1、IL-17、IL-22 和TNF-α，從而促進破骨細胞生成。其中，IL-17 能夠上調破骨細胞前體上的RANK 受體以促進破骨細胞分化；同時，IL-17 還可以抑制骨形態發生蛋白2（BMP-2）誘導的成骨細胞分化［14］，并在體外通過NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 炎性小體途徑誘導成骨細胞的細胞焦亡。然而，最近有研究顯示，IL-17 可以促進小鼠的成骨細胞分化、骨再生和改建［15］。此外，IL-4 還能抑制Treg 細胞分化，Treg 細胞能夠產生抗炎細胞因子IL-10和TGF-β。Treg細胞可通過表達細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4以去除在破骨細胞前體表達的共刺激分子B 淋巴細胞活化抗原80/B 淋巴細胞活化抗原86，從而實現對破骨細胞成熟的抑制。然而，最近的一項研究指出，Treg 細胞通過減少破骨細胞數量而非抑制破骨細胞分化來發揮骨保護作用［16］。

1.2.2 通過調控B 細胞影響骨改建 IL-4 能夠激活B 細胞，增強B 細胞呈遞抗原的能力，刺激B 細胞增殖和分化成漿細胞。然而，IL-4 調控B 細胞的具體作用機制目前尚未明確。有研究向體外培養的B細胞中加入IL-4，通過細胞凋亡和免疫印跡實驗發現B 細胞中IRS2 的酪氨酸磷酸化，與PI3K 結合，該通路以不依賴STAT6 的方式減少B 細胞的凋亡；通過進一步的實驗，作者認為IL-4 能夠通過MAPK 通路促進B 細胞的增殖［17］。此外，最近研究表明，IL-4能夠以STAT6 依賴性的方式，調控記憶B 細胞分化相關轉錄因子Hhex、Bach2和Zbtb32的表達，從而抑制記憶B 細胞的分化［18］。一篇關于類風濕關節炎（RA）的動物研究報道，B 細胞和漿細胞均可通過遞送RANKL 來調節破骨細胞生成［19］。然而，B 細胞也是骨保護素（OPG）的主要來源，OPG 對破骨細胞的生成具有抑制作用。盡管目前對B細胞的關注主要集中在破骨細胞生成上，但最近的一項研究在RA小鼠模型中發現，B 細胞通過激活ERK 和NF-κB 信號通路來抑制成骨細胞分化［20］，從而抑制骨形成。特別是，B 細胞的作用受T 細胞亞群的影響。當被Th1相關細胞因子激活時，B細胞可以抑制破骨細胞生成；但在Th2 細胞因子的刺激下，B 細胞促進破骨細胞生成。綜上，IL-4 通過激活B 細胞抑制成骨細胞，同時對破骨細胞具有雙重作用；IL-4還能通過調節Th 細胞的分化，從而影響B 細胞的功能，實現對破骨細胞的保護作用。

1.2.3 通過調控巨噬細胞影響骨改建 巨噬細胞根據活化狀態和功能的不同，可分為經典活化的巨噬細胞（M1 型）和M2 型巨噬細胞。促炎表型M1 極化的巨噬細胞能夠產生TNF-α、IL-1β 和IL-6，從而促進破骨細胞的形成。當巨噬細胞受到IL-4的刺激時，會極化成抗炎表型M2 巨噬細胞。精氨酸代謝的不同是M1 型巨噬細胞和M2 型巨噬細胞的區別之一，M2 型巨噬細胞高表達精氨酸酶1（Arg1）。在M2型巨噬細胞中，IL-4信號通路激活STAT6，STAT6能夠直接與Arg1 基因的啟動子結合，從而引起Arg1高表達［21］。此外，PI3K/Akt/mTOR 信號軸是參與巨噬細胞極化的主要通路，M1/M2 極化依賴于特定的Akt、PI3K 和mTOR 亞型。M1 型巨噬細胞極化依賴于Akt2 和mTORC1，而當IL-4 與IL-4R 結合后，通過IRS2激活PI3K，通過Akt1和mTORC2的激活最終誘導巨噬細胞向M2型極化。M2型巨噬細胞具有骨保護作用，通過刺激MSCs和前成骨細胞分化為成熟成骨細胞來促進骨礦化。同時，M2型巨噬細胞具有較高的血管生成潛能，間接促進成骨；M2型巨噬細胞可分泌細胞因子，如IL-10、BMP-2和TGF-β1等，其中大部分參與抑制破骨細胞骨吸收；M2型巨噬細胞亞群還能參與凋亡細胞清除，維持骨轉換穩態。因此，IL-4通過調節巨噬細胞極化間接發揮骨保護作用。

2 IL-4參與骨相關疾病的發生、發展

2.1 關節炎 IL-4與關節炎的相關研究較為豐富，是當前關節炎發病和治療的熱點研究方向之一。關節炎是一種進行性自身免疫性疾病，以滑膜關節炎癥以及全身表現為特征。其中，RA是關節炎較為廣泛的一大亞型。RA的特征之一是滑膜炎，這是由免疫細胞持續在關節組織募集引起的。IL-4 在RA 的滑膜中具有直接的抗炎作用，其減少巨噬細胞炎癥因子IL-1β 和TNF 的產生，以及人免疫球蛋白G Fc段受體Ⅰ和人免疫球蛋白G Fc 段受體Ⅲ的表達。IL-4-590 基因位點啟動子的多態性，被認為是RA 嚴重的遺傳危險因素［22］。另一種常見的關節炎是骨關節炎（OA），會導致關節部位出現疼痛、腫脹或僵硬。手部、膝蓋和髖關節OA 的發生被認為與IL-4 和IL-4Rα基因編碼的多態性有關。與健康人相比，OA患者血清中的可溶性IL-4Rα 水平升高，滑膜細胞和滑膜液中的IL-4濃度也更高。IL-4具有軟骨保護作用，其能夠通過抑制金屬蛋白酶的分泌，減少OA 發病過程中常見的蛋白多糖的產生，對關節軟骨中蛋白多糖的降解具有抑制作用。而在OA 患者體內中，軟骨細胞對IL-4作用的易感性降低，這可能是造成關節軟骨快速退化的原因之一［23］。在多種關節炎動物模型實驗中，IL-4 相關治療均顯著延緩了關節炎的進展。在膠原誘導的關節炎模型中，連續給予IL-4 延遲了關節炎的發作，關節損傷和炎癥較輕。在蛋白多糖誘導的關節炎模型中，IL-4 敲除小鼠表現出加重的關節炎趨勢，關節炎的惡化被認為與STAT6信號途徑有關。在甲基化牛血清白蛋白/IL-1誘導的關節炎小鼠中，用中和IL-4 抗體處理后顯示關節炎癥減輕30%，表明IL-4 能夠影響CD4+T 細胞依賴性關節炎［24］。與野生型小鼠相比，IL-4Rα 基因敲除小鼠和LysMcreIL-4Rαflox/-小鼠的關節炎癥嚴重程度增加［25］。IL-4通過抑制滑膜成纖維細胞中血管內皮生長因子的表達抑制血管生成［26］。巴西鉤蟲Nippostrongylus brasiliensis 造成的蠕蟲感染，導致腫瘤壞死因子轉基因關節炎小鼠體內存在大量的Th2細胞和嗜酸性粒細胞，而IL-4/IL-13 誘導的STAT6信號通路參與減輕關節炎癥［27］。大量證據表明IL-4在關節炎發病中的作用，動物模型以及體外通路驗證的結果均表明，IL-4 的抗炎特性有益于關節炎的治療，IL-4 可能是治療關節炎的新型有效方法。因此，進一步的研究對于揭示和理解IL-4 在關節炎中確切的作用機制至關重要。

2.2 骨質疏松癥 骨質疏松癥作為一種全身代謝性疾病，主要以患者骨量降低、骨微結構損傷以及骨脆性增加為臨床表現，嚴重的骨質疏松癥可能導致骨折和死亡。骨質流失與破骨細胞骨吸收和成骨細胞骨形成的不平衡有關。骨質疏松癥的發病原因是多方面的，增齡和衰老造成的器官功能減退是主要因素，上述提到的T 細胞、B 細胞和巨噬細胞也參與骨質疏松癥的發病。目前關于IL-4直接影響骨質疏松癥的相關文獻較少，但是有研究證明過度表達IL-4的小鼠出現類似人類骨質疏松癥的全身性骨丟失，在小鼠體內觀察到骨改建活動減弱，成骨細胞和破骨細胞募集受到抑制［28］。如前所述，IL-4 可以通過影響破骨細胞和成骨細胞的平衡調節骨改建［4-11］，從而實現對骨質疏松癥的影響，因此IL-4 可能作為骨質疏松癥治療的新靶點。

2.3 牙周炎 牙周炎是一種免疫性炎癥性疾病，伴隨著牙周骨組織和結締組織的進行性破壞。在牙周炎患者中檢測到相關細胞因子的改變，其中促炎和抗炎細胞因子的相互作用與疾病發展密切相關［29］。由于IL-4的抗炎作用以及對破骨細胞的抑制，IL-4在牙周炎疾病發展中可能起到保護作用，已有研究證明了這一猜想［30］。此外，IL-4 通過促進巨噬細胞M2極化，改善糖尿病牙周炎患者的牙槽骨吸收［22］。因此，在牙周炎的治療中，IL-4的作用值得進一步研究。

2.4 骨移植不良反應 IL-4 在緩解骨移植不良反應造成的骨溶解方面的相關研究較多，是當前的研究熱點之一。骨移植是修復大面積骨缺損的有效策略，然而，對生物支架和種植體的宿主免疫反應經常導致臨床植入失敗，被認為是影響再生功效的關鍵因素。針對植入物產生的磨損顆粒引起慢性巨噬細胞介導的炎癥反應，調控巨噬細胞極化和預防趨化因子配體2 誘導的巨噬細胞趨化是減少骨溶解和無菌全關節置換松動的新興策略［31］。通過種植體遞送IL-4 或在水凝膠上負載IL-4 的方式，可實現骨小梁體積的增加以及骨溶解的降低［32］，表明IL-4 可誘導巨噬細胞M2 極化，促進BMSCs 的成骨分化［33］，增加骨缺損愈合能力［34］，證明IL-4 是減輕磨損顆粒誘導植入物周圍骨溶解的潛在治療策略。此外，載有IL-4 的植入物在皮下植入后，通過直接刺激內皮細胞和間接調控免疫微環境，誘導新血管形成，表現出優異的促血管生成能力［35］，促進周圍組織的愈合。因此，負載IL-4 是臨床種植體修復骨缺損的熱點方向和未來希望，值得專家學者的深入研究。

IL-4 作為一種適應性免疫調節細胞因子，不但直接參與機體的免疫調節，還直接或間接影響骨改建的平衡。眾多研究表明，IL-4 在骨相關疾病中具有重要作用。然而，目前針對IL-4 治療骨相關疾病的研究仍停留在基礎研究層面，臨床研究尚未充分展開。因此，推動基礎研究轉化為臨床應用是當前工作的重點，未來的研究工作方向應該是探索IL-4在改善骨改建相關疾病方面的可行性以及相關治療方法的開發。