腫瘤壞死因子受體相關因子6高表達對子宮內膜癌細胞侵襲、遷移及上皮間質轉化的影響

馮一平,袁浩鑫,曾尚云,王思雨

(大同市第五人民醫院婦科,山西 大同 037009)

子宮內膜癌在女性惡性腫瘤中有較高的發病率,多發于女性絕經后,陰道不規則流血是其最典型癥狀[1-2]。目前手術聯合放化療可提高患者的5年生存率,但對于子宮內膜癌的復發和轉移的防治還沒有較好的治療策略。上皮間質轉化是癌癥轉移的關鍵步驟,在子宮內膜癌的惡性進展過程中起到重要的推進作用[3-5]。腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)是一個泛素連接酶,與腫瘤的發生發展以及侵襲轉移過程密切相關[6]。據報道,TRAF6可抑制上皮間質轉化和結直腸癌轉移[7]。本研究以人子宮內膜癌細胞Ishikawa作為研究對象,提高TRAF6的表達,探究TRAF6對人Ishikawa細胞惡性生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人子宮內膜癌Ishikawa細胞、人子宮內膜上皮細胞ESC,上海ATCC細胞庫提供;BCA蛋白定量試劑盒,購自南京森貝伽生物科技有限公司提供;空載質粒慢病毒載體、TRAF6質粒慢病毒載體,廣州源井生物科技有限公司提供;兔抗人TRAF6、E-cadherin、Occludin、N-cadherin、Vimentin抗體,艾博抗(上海)貿易有限公司提供;Trizol RNA分離試劑,賽默飛世爾科技(中國)有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞轉染與分組:將Ishikawa細胞用胰酶消化,移液器配合少量培養基進行吹打,收集細胞,1500 r/min、4 ℃低溫離心10 min,制備單細胞懸液(5×104/ml),接種于6孔板(2 ml/孔)。通過轉染試劑將空載質粒慢病毒載體或TRAF6質粒慢病毒載體轉染入Ishikawa細胞中,記為NC組或TRAF6高表達組,對照組為未轉染的Ishikawa細胞。各組細胞置于細胞培養箱中繼續培養48 h。

1.2.2 RT-qPCR和WB法檢測人子宮內膜癌細胞、人子宮內膜上皮細胞中TRAF6 mRNA和蛋白表達:胰酶消化收集Ishikawa細胞和ESC細胞于離心管。向離心管中滴加1 ml Trizol混勻充分裂解,12000 r/min、4 ℃低溫離心10 min,取上清與異丙醇混合后離心,留沉淀進行RNA洗脫和再溶解。取RNA逆轉錄得到cDNA,隨后進行RT-qPCR。設置β-actin為內參,引物序列見表1,以2-ΔΔCt法處理數據。分別提取Ishikawa、ESC細胞總蛋白,并定量蛋白濃度。將50 μg蛋白與3倍體積的上樣緩沖液(4×)混勻,沸水浴變性10 min,凝膠孔中上樣,80 V電泳至蛋白Marker出現紅色標度(70 kD),調整電壓為130 V,溴酚藍距底部約0.5 cm,停止電泳,轉膜。5%脫脂奶將膜封閉后,與一抗溶液(1∶500稀釋的TRAF6抗體)孵育1 h,洗滌后浸入二抗溶液(1∶1000稀釋的羊抗兔IgG抗體)孵育1 h,顯色后拍照,通過Image J軟件分析結果。

表1 引物序列

1.2.3 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力:1.2.1中細胞經胰酶消化,并重懸(2×105個/ml),在Transwell上室(基質膠包被)中加入100 μl細胞懸液,將500 μl細胞培養基(含10% FBS)加入下室,孵育24 h后,將穿過膜的細胞固定、結晶紫染色,光鏡下計數穿膜細胞數。

1.2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力:取1.2.1中細胞,細胞層用無菌槍頭(200 μl)垂直劃線形成劃痕,繼續培養24 h,光鏡下于0 h和24 h分別拍照。通過Image Pro Plus 6.0系統分析0 h和24 h的劃痕面積,計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(1-24 h劃痕面積/0 h劃痕面積)×100%。

1.2.5 WB檢測細胞E-cadherin、Occludin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達:取1.2.1中細胞,根據全蛋白提取試劑盒說明書操作,提取細胞總蛋白,檢測E-cadherin、Occludin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達。

1.2.6 裸鼠移植瘤實驗:取1.2.1中細胞,胰酶消化收集,無菌PBS重懸為5×106/ml的單細胞懸液,注射器抽取200 μl注射于裸鼠右側腋窩皮下,對應細胞分組分別記為對照組、NC組和TRAF6高表達組,每組10只。接種后對裸鼠狀況密切關注,14 d后處死裸鼠,觀察腫瘤侵襲周圍臟器情況以及肺、肝臟有無腫瘤轉移情況。

2 結 果

2.1 人子宮內膜癌細胞、人子宮內膜上皮細胞中TRAF6 mRNA和蛋白表達比較 相較于ESC細胞,Ishikawa細胞的TRAF6 mRNA水平和蛋白表達顯著降低(均P<0.05),見表2。

表2 ESC和Ishikawa細胞中TRAF6 mRNA和蛋白表達比較

2.2 TRAF6對Ishikawa細胞侵襲和遷移能力的影響 與對照組相比,TRAF6高表達組穿膜細胞數、劃痕愈合率降低(均P<0.05);NC組與對照組相比,穿膜細胞數、劃痕愈合率比較差異無統計學意義(均P>0.05),見表3。

表3 各組穿膜細胞數和劃痕愈合率

2.3 TRAF6對上皮間質轉化標志蛋白表達的影響 與對照組和NC組相比,TRAF6高表達組E-cadherin、Occludin蛋白表達升高,N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平降低(均P<0.05),見表4。

表4 TRAF6對E-cadherin、Occludin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響

2.4 TRAF6對裸鼠大體腫瘤侵襲周圍臟器的影響 接種各組細胞后密切關注裸鼠狀況,三組裸鼠在成瘤后均表現出不同程度的精神欠佳和消瘦。裸鼠大體解剖肉眼觀察,可見皮下腫瘤包膜完整、光滑、質硬,與皮膚及周圍組織無明顯粘連。其中對照組和NC組相較于TRAF6高表達組,可見裸鼠肺、肝臟表面存在粗糙暗沉,質硬、粟粒狀改變,表明對照組和NC組Ishikawa細胞可引起腫瘤侵襲周圍臟器肺及肝臟,而TRAF6高表達組未出現明顯轉移情況。

3 討 論

子宮內膜癌是女性生殖道常見惡性腫瘤[8-9]。大量研究[10-12]發現,子宮內膜癌有淋巴轉移的患者在進行手術以及放化療后,5年生存率仍不可觀,而無淋巴轉移的患者則預后較好。因此,如何阻斷子宮內膜癌的侵襲和轉移,成為提高其臨床治療效果和患者生存率的關鍵。

TRAF6可介導細胞內多條信號通路,參與細胞發育、免疫、穩態等過程[13-15],并且在癌癥的發生發展中具有重要作用[16]。Hu等[17]研究發現,降低TRAF6的表達會使宮頸癌細胞活力增強。Muto等[18]研究發現,TRAF6通過直接靶向MYC致癌活性在髓系惡性腫瘤中發揮腫瘤抑制作用。本研究發現,與人子宮內膜上皮細胞ESC相比,人子宮內膜癌細胞Ishikawa中TRAF6低表達;本研究進一步構建穩定高表達TRAF6的Ishikawa細胞來驗證其作用,結果顯示高表達TRAF6的Ishikawa細胞的侵襲和遷移能力均顯著低于對照組,裸鼠移植瘤實驗結果也證實高表達TRAF6的Ishikawa細胞的體內成瘤轉移現象不明顯。以上結果提示高表達TRAF6可抑制子宮內膜癌的侵襲遷移,表明TRAF6在子宮內膜癌的發生發展中可能具有重要作用。

在上皮間質轉化過程中,腫瘤細胞的上皮特征消失,獲得成纖維細胞樣形態,隨后發展為間質表型[19]。此時細胞的上皮標志蛋白(如E-cadherin、Occludin等)表達減少,細胞極性和黏附性降低,而間質標志蛋白(如N-cadherin、Vimentin等)表達增加,細胞侵襲和遷移能力升高[20]。研究顯示,在婦科癌癥(卵巢癌、宮頸癌和子宮內膜癌)上皮間充質轉化中,E-cadherin下調,N-cadherin、Vimentin上調[21];且E-cadherin是子宮內膜癌預后良好的潛在標志物[22]。據報道,TRAF6可通過抑制上皮間質轉化來抑制癌細胞轉移[7]。本研究結果顯示,相較于對照組,TRAF6高表達組E-cadherin、Occludin蛋白水平升高,N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平降低。提示TRAF6可阻斷上皮間質轉化過程,抑制子宮內膜癌細胞的侵襲遷移。

綜上所述,TRAF6在子宮內膜癌的發生發展中具有重要的調節作用,過表達TRAF6抑制子宮內膜癌細胞的侵襲、遷移與上皮間質轉化。本研究為子宮內膜癌治療靶標的相關研究提供理論和實驗依據,后續將進行TRAF6作用機制的深入探討。