也迷里雞微衛星遺傳多樣性分析

姚瑩瑩,李家輝,李海英,吳盈萍,趙曉鈺,周 軍,趙全莊,李宗福

(1.新疆農業大學動物科學學院,烏魯木齊 830052;2.塔城地區畜牧科技研究推廣中心,新疆塔城 834700;3.新疆額敏縣國家級飛鵝保種場,新疆額敏 834606)

0 引 言

【研究意義】我國收錄在冊的家禽品種有189個,其中116個為雞品種[1]。外來品種引入與地方品種雜交也會造成遺傳資源的改變[2]。也迷里雞長期生長在我國新疆塔城地區額敏縣,其體型小而靈活,體質健壯,野外覓食能力極強、耐熱、耐寒、耐粗飼、適應性、抗逆性和抗病力強,且肉質細膩鮮美,蛋白含量、胸肉含量和瘦肉率高[3]。也迷里雞產品綜合利用價值高,在國內市場上雞肉的需求量也明顯呈增長趨勢[3,4]。【前人研究進展】微衛星是第二代遺傳標記,又稱簡單重復序列(Simple Sequence Repeats,SSR),由核心序列和兩側翼序列組成,長度一般在200 bp以內[5,6]。SSR是有效評價保種的分子標記之一,具有分布廣泛、位點多、穩定性好、重復性好、多樣性豐富等優點[7-9]。湯青萍等[10]對12個地方烏骨雞品種利用27個微衛星位點進行遺傳多樣性分析,結果顯示12個地方烏骨雞品種平均雜合度為0.622;平均多態信息含量為0.576;品種間遺傳距離結果表明,沐川烏骨雞與略陽雞遺傳距離最近(0.100 2),烏蒙烏骨雞與略陽雞最遠(0.254 6),各烏骨雞群體的遺傳多樣性較豐富,具有較高的選擇潛力。楊速等[11]對拜城油雞用28個微衛星位點進行標記,結果表明,各位點的有效等位基因、雜合度和多態信息含量平均值分別為7.38、0.62和0.57,拜城油雞的遺傳多樣性豐富。趙東偉等[12]對3個世代的徐海雞群體利用20個微衛星位點進行標記,分析表明,徐海雞0、1、2世代的多態信息含量均值分別為0.489、0.496和0.518,呈逐步上升趨勢;3個世代的Ho在0.32～0.39;He在0.58～0.62,徐海雞群體豐富的遺傳多樣性得到很好的保存。【本研究切入點】也迷里雞是近幾年發現的新品種,目前運用微衛星技術對也迷里雞遺傳多樣性的研究還未見報道。需利用15個微衛星位點對也迷里雞進行遺傳多樣性分析。【擬解決的關鍵問題】利用15個微衛星位點對也迷里雞2個世代共4個群體進行遺傳多樣性分析,為也迷里雞優質品種資源保護和開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取健康狀況良好的2個世代共4個群體(G1:1世代公雞、G2:2世代公雞、M1:1世代母雞、M2:2世代母雞)也迷里雞為材料,每個世代隨機抽取60只個體,其中公母比例1∶1。對120只也迷里雞個體,采用EDTA采血管取翅下靜脈血3 mL/只,搖勻后分裝于1.5 mL離心管,置于-20℃下保存備用。也迷里雞由額敏縣恒鑫實業有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

參照《分子克隆實驗指南》[13]中苯酚-氯仿抽提法(結合實驗室條件稍加修改)提取血樣中DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度,用紫外分光光度計法估計含量,-20℃保存備用。

1.2.2 引物設計及PCR擴增

試驗選取用于雞遺傳多樣性評價的15對引物。試驗采用的引物由南京康旭禾生物科技有限公司合成。PCR反應體系10 μL:2×TaqPCR Master Mix 5.0 μL,10 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL,DNA template 1.0 μL,ddH2O 3.0 μL。PCR反應條件:95℃預變性5 min,95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35個循環,72℃末端延伸20 min。取2 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。表1

表1 15對微衛星引物序列

1.3 數據處理

利用GenAIex軟件統計等位基因數(Na)、有效等位基因(Ne)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、基因流(Nm)、香農信息指數(I)、F-統計量(Fis、Fit、Fst、Nm)以及群體遺傳距離相關參數。利用Cervus軟件對各個位點的多態信息含量(PIC)進行計算。利用Phylip軟件基于Nei’s遺傳距離構建UPGMA遺傳進化樹。利用GenAIex軟件基于群體遺傳距離進行主坐標分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)。利用STRUCTURE軟件評估群體遺傳結構。用SPSS軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 微衛星位點遺傳多樣性參數

研究表明,15個微衛星位點在也迷里雞4個群體中共檢測出102個等位基因,平均等位基因數為6.800個,其中LEI0192和LEI0234位點檢測出的等位基因數最多,均為13個;各位點的有效等位基因數介于2.191～7.485,平均值為3.688,其中LEI0234位點檢測出的有效等位基因數最多,為7.485個,等位基因數(6.800)與有效等位基因數(3.688)兩指標差異較大,也迷里雞群體還存在一定的選育空間;觀測雜合度在0.425～0.817,平均值為0.660;期望雜合度在0.544～0.790,平均值為0.708,Ho低于He,各微衛星位點存在一定程度的雜合子缺失;多態信息含量介于0.439～0.854,平均值為0.661,其中MCW0248位點表現為中度多態性(0.250.5),其遺傳多樣性豐富。

Nm在6.192～29.689,其中MCW0216位點最大(29.689),LEI0166位點最小(6.192),均大于1,各位點Nm平均值為15.091,4個群體間存在高度的基因交流;Fis在-0.152～0.385,平均值為0.051;Fit在-0.137～0.392,平均值為0.070,也迷里雞4個群體在世代內的近交程度較低;Fst在0.011～0.039,平均值為0.020,其中所有位點的遺傳分化系數均小于0.05,4個群體的遺傳分化并不明顯。表2

表2 各位點遺傳多樣性參數

2.2 觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)及等位基因

研究表明,1世代15個微衛星位點的Ho范圍在0.350～0.902,平均值為0.630;2世代15個微衛星位點的Ho范圍在0.455～0.812,平均值為0.680。2個世代中ADL0268位點Ho值最高(0.902),LEI0192位點值最低(0.350)。2個世代Ho差異極顯著(P<0.01),也迷里雞經過2個世代的繁育,其遺傳多樣性增加。1世代15個微衛星位點的He范圍在0.549～0.862,平均值為0.681;2世代15個微衛星位點的He范圍在0.514～0.824,平均值為0.704。2個世代中LEI0234位點He值最高(0.862),MCW0248位點低最值(0.514)。2個世代He無顯著差異(P>0.05)。1世代的Na范圍在3～10.5,平均值為5.367;2世代的Na范圍在2.5～10.5,平均值為5.8。2個世代Na無顯著差異(P>0.05)。

世代間Ho、He和Na的變化趨勢均呈現出上升趨勢,其中Ho呈差異極顯著(P<0.01),He和Na無顯著差異(P>0.05),也迷里雞群體的遺傳多樣性較為豐富。表3

表3 2個世代不同位點觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)及等位基因數(Na)

2.3 群體間的遺傳距離、遺傳相似性和聚類

研究表明,4個群體的遺傳距離范圍為0.042～0.081;遺傳相似性范圍為0.922～0.959。其中,M2和G2遺傳距離最近(0.042),遺傳相似性最高(0.959);G2與G1遺傳距離最遠(0.081),遺傳相似性最低(0.922),2個群體間的遺傳變異程度相對較高。也迷里雞4個群體主要分為2類,G1單獨聚為一類,其他3個群體聚為一類,其中,M2與G2先聚為一類,再和M1聚為一類,與群體間的Nei’s遺傳距離結果一致。表4,圖1

圖1 4個也迷里雞群體的Nei's遺傳距離UPGMA聚類

表4 4個群體間的Nei’s遺傳距離和遺傳相似性

2.4 4個也迷里雞群體PCoA

研究表明,G2與M2之間相似度高,遺傳距離較近,差異最小,G1與其他3個群體間差異較大,存在一定的遺傳距離,同UPGMA聚類圖分析結果一致。圖2

圖2 4個也迷里雞群體PCoA分析

2.5 群體遺傳結構

研究表明,隨著假設亞群數目K的增加,LnP(D)逐漸增加,但沒有出現急劇的波動,在K=2～4時變化幅度最大。當K=4時,LnP(D)的衍生值ΔK取到最大值(31.1463),遠大于其它對應的ΔK值,并且,當K=4時,ΔK出現拐點,在一定范圍內取到極大值。以K=4為反映供試群體真實情況的最佳取值,即采集的120個個體被分為4組。圖3,圖4

圖3 K值與ΔK關系

圖4 120個個體STRUTURE類聚(K=4)

3 討 論

3.1 15個微衛星位點及也迷里雞的遺傳多樣性

遺傳多樣性是指群體內所有個體的遺傳變異總和,群體遺傳多樣性越豐富,該群體對環境變化的適應能力越強,進化潛力越大[14]。群體內遺傳變異的程度一般用遺傳參數來度量,基因雜合度、多態信息含量等均能對多態位點或群體的遺傳多樣性進行評估,數值越高遺傳多樣性越高,所攜帶的遺傳信息越豐富[15]。

3.1.1 多態信息含量

多態信息含量是表示微衛星位點變異程度高低、衡量基因片段多態性的一個指標[16]。當微衛星位點PIC>0.5時,表示高度多態性位點;當0.25

試驗利用15個微衛星位點對也迷里雞2個世代共4個群體進行遺傳多樣性檢測,結果表明,15個微衛星位點上共檢測出102個等位基因;平均等位基因數為6.800個;平均有效等位基因數為3.688個;多態信息含量平均值為0.661,且15個微衛星位點中,僅MCW0248位點表現為中度多態性(0.250.5)。試驗結果同前人對地方雞品種的研究結果一致,微衛星位點均呈現出高度多態性,也迷里雞整個群體的選擇潛力較大,遺傳多樣性豐富。

3.1.2 雜合度

雜合度分為觀測雜合度和期望雜合度,數值越高說明群體遺傳變異越大,遺傳多樣性越豐富;Ho與He越接近,該品種受外來選擇影響越小,群體接近遺傳平衡狀態。尚嵩洋[20]在3個莊河大骨雞群體20個微衛星位點上共檢測出168個等位基因,觀測雜合度平均值為0.611 1,低于平均期望雜合度0.717 1,觀測雜合度與期望雜合度數值的不同是由于在進化過程中出現了基因突變或者隨機性的基因漂移造成的。李興才等[21]在香爐山雞群體21個微衛星位點上共檢測出85個等位基因;觀察雜合度平均值為0.575 7;期望雜合度平均值為0.637 1,群體內出現一定程度的雜锃子缺失。伍革民等[22]對4個貴州烏骨雞群體進行微衛星標記分析,發現各群體平均雜合度在0.706 9～0.738 5,平均值為0.727 2,其中廣西烏骨雞群體雜合度最高(0.738 5),4個烏骨雞群體在7個微衛星位點均表現出較高的基因雜合度,具有豐富的遺傳多樣性。

試驗中15個位點的觀測雜合度平均值為0.660;期望雜合度平均值為0.708,觀測雜合度低于期望雜合度,該結果同莊河大骨雞[17]、香爐山雞[18]研究結果一致,群體內出現純合子過剩、雜合子缺失的現象。此外,也迷里雞1世代的Ho、He平均值分別為0.630、0.681;2世代的Ho、He平均值分別為0.680、0.704,2世代的雜合度高于1世代,也迷里雞群體遺傳變異得到保存,仍具有較高水平的遺傳多樣性,與PIC結果一致。

3.2 遺傳距離及聚類

一般認為分化時間越短,遺傳距離越小[23]。楊速等[24]對7個番鴨群體遺傳距離及聚類分析的研究結果顯示,7個番鴨群體主要被分為2類;福建花羽番鴨與法國巴巴里番鴨遺傳距離最遠(0.164 1),且福建花羽番鴨與其他6個群體遺傳距離均較大,結合福建花羽番鴨的遺傳多樣性最高,福建花羽番鴨攜帶較多獨特的遺傳信息。劉雅麗等[25]利用微衛星標記檢測仙居雞保種效果中發現,9世代與10世代的遺傳相似性系數極高(0.973 5),遺傳距離極低(0.026 9),2個世代的保種群沒有受到外來品種的影響。曾濤等[26]在雁蕩土雞及其他3個雞群遺傳距離和系統聚類結果中顯示,5個群體聚為3類,雁蕩麻雞2個群體為一類,仙居雞為一類,蕭山雞與龍游麻雞為一類。雁蕩麻雞與其他3個品種間的遺傳距離大于3個品種內部的遺傳距離,雁蕩麻雞Ⅰ系和Ⅱ系是不同于仙居雞、蕭山雞和龍游麻雞而單獨存在的一個品種。

研究中也迷里雞4個群體的遺傳距離范圍為0.042～0.081;4個群體間遺傳分化系數范圍為0.008～0.018。其中,M2和G2遺傳距離最近(0.042),遺傳分化系數最小(0.008),遺傳相似性最高;G2與G1遺傳距離最遠(0.081),遺傳分化系數最大(0.018),遺傳相似性最低。UPGMA聚類圖結果顯示,也迷里雞4個群體主要分為2類,G1單獨聚為一類,其他3個群體聚為一類,其中,M2與G2先聚為一類,再和M1聚為一類,該結果同主成分分析結果一致。

3.3 遺傳分化

F-統計量反映群體近交程度、群體間遺傳分化程度,主要包括Fis、Fit、Fst和Nm。白優[27]對烏蒙鳳雞、威寧雞等6個群體用19個微衛星位點進行遺傳多樣性分析,F-統計量研究結果表明,Fis、Fit和Fst平均值分別為-0.224 0、0.034 3和0.211 0,群體間存在較大的遺傳分化;Nm平均值為0.934 8(Nm<1),遺傳漂變可能會對群體的遺傳結構造成影響。吳俊峰[28]對固始雞和浙川烏骨雞利用29個微衛星位點進行遺傳多樣性研究,結果顯示,固始雞2個遷地保種群間Fst值為0.082,原位保種群與2個遷地保種群Fst值分別為0.102和0.130,均出現中度遺傳分化(0.05

研究中也迷里雞15個微衛星位點上的Fis、Fit平均值分別為0.051、0.070;Fst平均值為0.020,其中所有位點遺傳分化系數均小于0.05;Nm平均值為15.091,遠大于1。Fis、Fit結果高于烏蒙鳳雞群體[27],低于北京鴨群體[29];Fst結果低于烏蒙鳳雞[27]、固始雞[28]和北京鴨群體[29],也迷里雞4個群體的近交程度較低、遺傳分化不明顯,群體間存在高度的基因交流,也迷里雞保持著豐富的遺傳多樣性。

4 結 論

也迷離雞15個微衛星位點上的PIC平均值為0.661,Fis、Fit、Fst平均值分別為0.051、0.070、0.020,且2世代的雜合度高于1世代,也迷離雞群體選擇潛力大、近交程度低、遺傳分化不明顯,具有較豐富的遺傳多樣性。