一株鹽堿綠藻的SE培養基優化

陳 鳳,董 宇,蔡宏宇,張蘇江,雷曼紅,孫 禹

(塔里木大學/新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室,新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】塔里木河是我國最大內陸河[1-2]。塔里木河上游階段水體具有溶解氧高、鹽度高、礦化度高、酸堿度高、電導率高、溫度較低,氧化還原電位較低的特征[3]。阿拉爾灌區塔南總排農田排水全年為咸水水質,排水屬于Na-Cl型水質,Na+為主要的陽離子,平均占比為16.7%,平均濃度為1.4 g/L,Cl-為主要的陰離子,平均占比為35.6%,平均濃度為3.1 g/L[4]。江河湖泊,水庫等淡水環境中出現水華現象是由于藻類在溫度高低、光照強度、營養鹽含量、氮磷含量、酸堿度等多種因素影響下,快速生長繁殖而形成的水質污染現象[5]。通常造成水體出現水華現象的3種藻類包括萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、綠球藻(Chlorococcum)、斜生柵藻(Scendesmusobliquue)[6]。【前人研究進展】近幾年,關于阿拉爾的相關研究主要集中在高鹽鈉污坑塘水生態修復[7]、棉田灌排水水質特征[8]、水質演變規律及生態需水[9]、基于AHP的阿拉爾市水資源系統評價[10]、苦咸水水化學的特征、分布及成因分析[11]等方面?！颈狙芯壳腥朦c】但關于阿拉爾的特殊水質中的相關藻類研究還未見報道。需針對位于阿拉爾市塔里木大學生東湖一株鹽堿綠藻的SE培養基進行優化研究?！緮M解決的關鍵問題】運用形態學觀察、分子鑒定,研究鹽堿藻生物學特性及生長最適CaCl2·2H2O、KH2PO4、NaCl、NaNO3、MgSO4·7H2O以及pH,為阿拉爾鹽堿藻類在分子生物學和生態環境保護以及漁業餌料資源的研究提供基礎性理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

2021年4月16日,從塔里木大學校園內東湖(40°54′52″N,81°30′52″E)采集藻種。將采集的樣品立即帶回實驗室,用50 mL 12 000 r/min冷凍離心2 min,濃縮成14 mL,各取2 mL置于盛有100 mL 的7種培養基的三角瓶中靜置培養,溫度(25±1)℃,光照強度7 000 lx,光暗比為12 h∶12 h,pH為8.20。采用水滴分離法和微管分離法分離純化,直到分離出單一藻細胞,每天定時搖藻3次。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

將f/2、SE、D1、BBM、BG11、LB、Kuhl培養基進行篩選,篩選出的培養基為SE培養基。根據該培養基中不同成分設置不同濃度梯度,優化SE培養基。表1

表1 SE培養基中各因素濃度

1.2.2 光學顯微鏡觀察

定期觀察藻細胞顏色、錐形瓶的附壁氣泡量,并用光學顯微鏡觀察各個培養基藻細胞的量以及運動狀況,處于指數生長期的藻細胞,用顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 基因組DNA的提取

用TIANGEN高效植物基因組DNA提取試劑盒來提取藻細胞基因組DNA。

1.2.4 PCR擴增

用于擴增真核綠藻的18S rDNA的引物:上游引物YM1(5′-CGGGATCCGGAGTCATATGCTTGTCTC-3′),下游YM2(5′-CGGAATTCCTTCTGCAGGTTCACC-3′);PCR反應體系為25 μL,dd H2O 8.5 μL,上下引物0.5 μL,DNA模板3 μL,2xTAP PCR MasterMix(TIANGEN)12.5 μL。PCR反應條件:95℃預變性5 min,95℃變性1 min,58℃退火1 min,72℃延伸2 min,30個循環;72延伸10 min,擴增結果為2%的瓊脂糖進行28 min 100V 90A電泳。

1.2.5 系統發育進化樹

測序結果與NCBI已知的數據庫比較,利用BLAST搜索引擎中的Nucleotide blast獲得所測序列的同源序列Genetyx 進行多重序列對比,采用Mega 11.0軟件繪制出(Neighbor-Joining)系統發育樹,重復1 000次計算bootstrap值。

1.2.6 測定指標

1.2.6.1 藻干重

擬合干重與吸光度的線性關系,藻干重測定:將待測藻液搖勻,移取呈梯度增加的不同體積藻液5份,超純水稀釋定容到同一體積,以培養液為空白,測定其在680 nm處吸光度值,而后將藻液經潔凈恒重的微孔濾膜過濾,過濾后的藻液110℃烘干至恒重,并記錄干重值。以吸光度為橫坐標,干重為縱坐標即得藻干重與吸光度的線性回歸方程G= 0.092A-0.000 9,R2= 0.997 1。

1.2.6.2 糖與蛋白

在9、14、19、24 d四個不同的時間點,采集各藻種10 mL于10 mL尖底螺口離心管,3 500 r/min離心10 min,向離心藻液中加入一定量PBS,超聲破碎,時間視藻液的多少而定,保證細胞壁破碎,然后超聲波提取1 h。處理后的藻液一部分用于蛋白質含量的測定,另一部分藻液加熱煮沸10 min用于葡萄糖的測定,每種藻的蛋白含量和葡萄糖含量平行測定2次。

葡萄糖標準曲線的繪制:取7支20 mL試管,進行編號,配制成一系列不同濃度的標準葡萄糖溶液。在冰水浴下每管中均加入4 mL蒽酮試劑,搖勻后,打開試管塞,置沸水浴中煮沸10 min,取出冷卻至室溫,在625 nm波長下比色,測各管溶液的吸光度值,以標準葡萄糖濃度為橫坐標,光密度值為縱坐標,作出標準曲線。表1

葡萄糖的標準曲線方程:A= 0.006 4C-0.014 4,R2=0.998 1。表2

表2 葡萄糖標準溶液配制

蛋白標準曲線的繪制:采用考馬斯亮藍法測定藻體內蛋白含量。

蛋白質標準曲線方程:A=0.007 3C+ 0.067 6,R2=0.997 7。表3

表3 蛋白質標準溶液配制

1.2.6.3 色素

在9、14、19、24 d四個不同的時間點,采集各藻種5 mL于10 mL尖底螺口離心管,3 500 r/min 離心10 min,去掉上清液,加入5 mL 90%的丙酮,過夜放置24 h。再次3 500 r/min離心10 min,將上清液掃描吸收曲線,測定特定波長的吸光度,計算色素含量。

葉綠素a的含量= 12.7OD663-2.69OD645.

葉綠素b的含量= 22.9OD645-4.86OD663.

總葉綠素含量= 8.02OD663+ 20.20OD645.

1.3 數據處理

用Excel 2010進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 光學顯微鏡的觀察結果及培養基篩選

研究表明,1號藻,單細胞,聚集成膜狀團塊或包被于膠質中。細胞球形,有時壓扁,大小不一。隨生長細胞結構發生變化:細胞壁不規則地增厚,并明顯分層;色素體由杯狀變成分散狀充滿細胞內部;蛋白核也由1個變成多個,并有多數淀粉顆粒。無性繁殖產生動孢子,有時可形成不動孢子。藻細胞在f/2、SE、D1、BBM、BG11、LB、Kuhl培養基中存在不同的狀態,生長狀態最佳的是SE培養基。表4,圖1

圖1 1號藻在40倍鏡觀察

表4 藻細胞在7種培養基中的不同狀況

2.2 18S rDNA序列

研究表明,TIANGEN高效植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA用核酸濃度檢測儀檢測其濃度為30.92 ng/μL,擴增出長度分別為1 730 bp的基因片段。圖2,圖3

圖2 提取DNA的成像

圖3 PCR擴增后的成像

1號藻的序列與GenBank上的Pseudochlorococcumsp.(MH683908.1)的同源性高,相似率達99.42%,比對序列中有2個堿基不同。1號藻與新穎擬綠球藻屬聚簇成一支,與Pseudochlorococcumsp.(MH683908.1)的節點支持率為100,遺傳距離值為0.00,1號藻與Pseudochlorococcumsp.(MH683908.1)親緣關系很近。圖4

圖4 18S rDNA序列的系統發育樹

2.3 不同因素的不同濃度對1號藻的可溶性糖的影響

研究表明,選擇第3個時間點(19 d),此時間點是指數生長后期。在CaCl2·2H2O濃度為X1(0.025 g/L)、X2(0.050 g/L)、X3(0.075 g/L)、X4(0.100 g/L)、X5(0.125 g/L)時,可溶性糖濃度最高的是X2(0.050 g/L)CaCl2·2H2O,濃度為24.34%。在KH2PO4濃度為X1(0.175 g/L)、X2(0.350 g/L)、X3(0.525 g/L)、X4(0.700 g/L)、X5(0.875 g/L)時,可溶性糖濃度最高的是X1(0.175 g/L) KH2PO4,濃度為10.53%。在NaCl濃度為X1(0.025 g/L)、X2(0.05 g/L)、X3(0.075 g/L)、X4(0.100 g/L)、X5(0.125 g/L)時,可溶性糖濃度最高的是X4(0.100 g/L) NaCl,濃度為11.82%。在NaNO3濃度為X1(0.250 g/L)、X2(0.500 g/L)、X3(0.750 g/L)、X4(1.000 g/L)、X5(1.250g/L)時,可溶性糖濃度最高的是X1(0.250 g/L)NaNO3,濃度為10.64%。MgSO4·7H2O濃度為X1(0.075 g/L)、X2(0.150 g/L)、X3(0.225 g/L)、X4(0.300 g/L)、X5(0.375 g/L)時,可溶性糖濃度最高的是X5(0.375 g/L) MgSO4·7H2O,濃度為12.32%。當pH為X1(6.0)、X2(7.0)、X3(8.0)、X4(9.0)、X5(10.0)時,可溶性糖濃度最高的是X4(9.0)pH,濃度為16.57%。圖5

圖5 不同因素不同濃度下可溶性糖含量變化

2.4 不同因素的不同濃度對1號藻的可溶性蛋白的影響

研究表明,選擇第3個時間點(19 d),此時間點是指數生長后期。在CaCl2·2H2O濃度為X1(0.025 g/L)、X2(0.050 g/L)、X3(0.075 g/L)、X4(0.100 g/L)、X5(0.125 g/L)時,可溶性蛋白濃度最高的是X2(0.050 g/L)CaCl2·2H2O,濃度為16.55%。在KH2PO4濃度為X1(0.175 g/L)、X2(0.350 g/L)、X3(0.525 g/L)、X4(0.700 g/L)、X5(0.875 g/L)時,可溶性蛋白濃度最高的是X1(0.175 g/L) KH2PO4,濃度為7.70%。在NaCl濃度為X1(0.025 g/L)、X2(0.050 g/L)、X3(0.075 g/L)、X4(0.100 g/L)、X5(0.125 g/L)時,可溶性蛋白濃度最高的是X4(0.100 g/L) NaCl,濃度為8.57%。在NaNO3濃度為X1(0.250 g/L)、X2(0.500 g/L)、X3(0.750 g/L)、X4(1.000 g/L)、X5(1.250g/L)時,可溶性蛋白濃度最高的是X1(0.250 g/L),含量為6.10%。MgSO4·7H2O濃度為X1(0.075 g/L)、X2(0.150 g/L)、X3(0.225 g/L)、X4(0.300 g/L)、X5(0.375 g/L)時,可溶性蛋白濃度最高的是X5(0.375 g/L) MgSO4·7H2O,濃度為9.90%。當pH為X1(6)、X2(7.0)、X3(8.0)、X4(9.0)、X5(10.0)時,可溶性蛋白濃度最高的是X4(9.0)pH,濃度為9.46%。圖6

圖6 不同因素不同濃度下可溶性蛋白含量變化

2.5 不同因素的不同濃度對1號藻的總葉綠素的影響

研究表明,在CaCl2·2H2O濃度為X1(0.025 g/L)、X2(0.050 g/L)、X3(0.075 g/L)、X4(0.100 g/L)、X5(0.125 g/L)時,總葉綠素含量濃度最高的是X2(0.050 g/L)CaCl2·2H2O,含量為2.000 mg/L。在KH2PO4濃度為X1(0.175 g/L)、X2(0.350 g/L)、X3(0.525 g/L)、X4(0.700 g/L)、X5(0.875 g/L)時,總葉綠素含量濃度最高的是X1(0.175 g/L) KH2PO4,含量為3.607 mg/L。在NaCl濃度為X1(0.025 g/L)、X2(0.050 g/L)、X3(0.075 g/L)、X4(0.100 g/L)、X5(0.125 g/L)時,總葉綠素含量濃度最高的是X4(0.100 g/L) NaCl,含量為3.385 mg/L。在NaNO3濃度為X1(0.250 g/L)、X2(0.500 g/L)、X3(0.750 g/L)、X4(1.000 g/L)、X5(1.250 g/L)時,總葉綠素含量最高的是X1(0.250 g/L) NaNO3,含量為2.731 mg/L。MgSO4·7H2O濃度為X1(0.075 g/L)、X2(0.150 g/L)、X3(0.225 g/L)、X4(0.300 g/L)、X5(0.375 g/L)時,總葉綠素含量濃度最高的是X5(0.375 g/L) MgSO4·7H2O,含量為1.790 mg/L。當pH為X1(6.0)、X2(7.0)、X3(8.0)、X4(9.0)、X5(10.0)時,總葉綠素含量濃度最高的是X4(9.0)pH,含量為1.985 mg/L。圖7

圖7 不同因素不同濃度下總葉綠素含量變化

2.6 優化后的各因素濃度對1號藻各個指標的影響

研究表明,以SE培養基為基礎,將優化后的CaCl2·2H2O(0.050 g/L)、KH2PO4(0.175 g/L)、NaCl(0.100 g/L)、NaNO3(0.250 g/L)、MgSO4·7H2O(0.375 g/L)以及pH(9.0)配置培養基。在14 d已達到指數生長期,較前面單因素試驗提前5 d;優化后的可溶性糖、可溶性蛋白以及總葉綠素含量明顯高于優化前的相應指標含量。優化前的可溶性糖含量為10.55%,優化后的可溶性糖含量為25.32%;優化前的可溶性蛋白含量為6.86%,優化后的可溶性蛋白含量為18.15%;優化前的葉綠素含量為1.364 mg/L,優化后的葉綠素含量為3.863 mg/L。圖8,圖9

圖8 優化前后的可溶性糖和可溶性蛋白含量變化

圖9 優化前后總葉綠素含量變化

3 討 論

3.1 鈣對微藻生長的影響

鈣離子能夠參與調控生物生長發育的過程[12]。Ca2+還是胞內信使與調節蛋白的重要組成物質,調節生長和生理功能,Ca2+參與光合作用,胞外聚合物的形成,細胞鈣化等生理代謝過程,同時也作為逆境信號傳遞者并對重金屬毒害產生拮抗效應[13]。鈣是構成細胞膜的主要成分,對碳水化合物的形成與轉化起著至關重要的作用[14]。張哲等[15]研究發現,降低鈣的濃度可以有效促進微藻Desmodesmussp.WC08生長和油脂的積累。何爽[16]研究發現,高鈣時Shannona指數和Evenness指數在各個營養狀態下均略大于低鈣時的,高鈣有利于物種均勻度和多樣性的特征。王晉平等[17]研究發現,當固體劑CaCl2的濃度為300 mmol/L時,能提高藻酸鈣凝膠的機械強度。試驗研究結果與潘孝妍等[14]研究有相似之處,隨著CaCl2·2H2O質量濃度的增加,微藻的生物量出現先升高后降低的趨勢。由于藻種的不同,發生的轉折點不同,潘孝妍等[14]研究出現在15 d,而試驗的研究結果出現在19 d。潘孝妍等[14]研究顯示,CaCl2·2H2O的質量濃度為0.072 g/L時,結果最佳;而試驗的質量濃度為0.050 g/L,結果最佳。不同的結果可能是溫度、pH、光照等不同因素所導致。

3.2 氮磷對微藻生長的影響

在氮磷比為32∶1時,普通小球藻(Chlorellavulgaris)的生長性能最好,葉綠素含量也最高。在氮磷比為64∶1時,波吉卵囊藻(Oocystisborgei)的生長速率達到最大值[35]。當氮、磷含量不同時,導致了細菌菌落結構的差異,微囊藻共棲的細菌群落對外界環境氮、磷營養元素的環境變化極為敏感[36]。

3.3 NaCl和鎂離子對微藻生長的影響

梁英等[37]研究顯示,鹽度是影響微生物生長發育的重要因子。鹽度主要是通過滲透壓脅迫、離子脅迫以及改變細胞膜對離子的通透性等諸多方面來影響生物對氨氮的吸收[38]。在適宜鹽度范圍內,鈉是一種微量必需元素,可以增加植物葉綠素的含量,提高原生質的吸水性,改善光合細胞水分狀況,從而促進光合作用[39]。陳因等[40]研究,氯化鈉對藍藻固氮脅迫不僅會影響固氮酶的活性,也會影響酶的特性,其脅迫程度會不斷增大。劉春光等[41]表明,在一定時期內低于3 g/L鹽度對藻類的生長有促進作用,而高于6 g/L鹽度有抑制作用。與試驗結果相似,在NaCl濃度為0.125 g/L時最適,同時也是在較低鹽度范圍內并對藻類有促進作用。鄭逸等[42]報道,抑制作用隨鹽度升高而增加,而試驗NaCl在適宜濃度對藻類的生長趨勢為先增加再降低,而不是一直增加。因為NaCl在適宜濃度對藻類的生長是促進作用。NaCl的濃度也不能太高,因為在高鹽脅迫下會導致細胞內部溶質外滲以及藻體代謝過程紊亂[43]。Na+增加取代了質膜上的Ca2+會造成細胞膜通透性增加,Ca2+作為第二信使,其降低進一步抑制的鈣調蛋白的活性,從而對細胞各類代謝活動產生影響,植物生長發育也會受到抑制[44-45]。

鎂是限制浮游植物生長的主要因素之一,對浮游植物有效利用碳、氮和磷以及葉綠素的生物合成和光合作用等諸多方面都起著重要的作用[46]。Mg2+不僅是葉綠素的組分之一,而且還是酶的活性劑[47]。金屬元素的適宜濃度范圍對藻類的生長繁殖和群體形式存在起著至關重要的作用,只有在適宜濃度范圍內,金屬元素含量的增長才會促進藻類形成群體,反之則使群體解聚死亡[48]。Ankush等[49]發現較高的Mg2+濃度不利于Chlorococcuminfudionum生物量的積累。Kuan等[50]對ChlorellaprototheoidesUTEX 250的研究發現,和原始加鎂的原始培養基相比,移除Mg2+的培養基對小球藻生物量和油脂積累都有積極的影響。劉建坤[51]認為當鎂離子濃度為3mmol/L時,杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)胞內甘油含量最高,可達167.449 mg/L,當鎂離子濃度為7 mmol/L時,杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)細胞可溶性蛋白含量最高,可達到346.664 mg/L。試驗鎂離子濃度為0.375 g/L時,可溶性蛋白、可溶性糖和總葉綠素均是最高,可能是培養基、藻種、藻種來源等因素不同所導致而成。

3.4 酸堿度對微藻生長的影響

只有在適宜的酸堿度范圍內,藻細胞才能正常生長繁殖。另一方面影響碳酸鹽平衡系統及不同形態無機碳分配關系,從而對藻類生長造成影響[52]。pH也影響藻類光合作用和呼吸作用速率,pH為8時,藻類光合速率和呼吸速率均達到最大值[53]。pH還影響細胞膜的滲透壓及細胞內多種酶的活性,從而影響藻類的生長[54]。藻類有其適宜生長的pH范圍,過高或者過低均會抑制藻類生長[55]。過量的H+降低碳酸酐酶活性,從而使CO2濃縮機制受到影響,導致藻類死亡[56]。過量的H+對藻細胞的內部結構有直接的破壞作用,從而使光合作用受到影響,特別是降低細胞質和葉綠體內pH值,阻止卡爾文循環,因此降低了開放式光合系統Ⅱ反應位點數量[57]。藻類喜歡生長于偏堿性水體(pH7.7～9.4),在一定的范圍內,可以把養殖水體pH值調到偏酸性,進而可以抑制藻類生長[58]。該研究結果與試驗結果相似,試驗結果中1號藻適宜的pH 為9.0,其喜歡偏堿性水體生長。不同的藻類,其適宜的pH范圍各不相同,銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa),水華魚腥藻(Anabaenaflos-aquae),浮游顫藻(Oscillatoriales)適宜的pH 分別為9.0、8.0～9.0、7.0～8.0,斜生柵藻(Scenedesmsobliquus),綠球藻(Chlorococcum),雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)適宜的pH分別為9.0～10.0、8.0～9.0、7.0[59]。1號藻是隸屬于綠球藻屬(Chlorococcum),pH為9.0,也是與其研究結果相同。各種藻類生長都有它適合的pH范圍,改變pH會影響藻類的生長繁殖,進而影響到種類的演替[60]。pH對浮游植物的種類組成以及分布有著重要的影響[61-62]。

4 結 論

1號鹽堿綠藻與新穎擬綠球藻屬(Pseudochlorococcumsp.)聚簇成一支,以SE培養基為基礎,在不同濃度的CaCl2·2H2O、KH2PO4、NaCl、NaNO3、MgSO4·7H2O以及pH中,0.050 g/L CaCl2·2H2O、0.175 g/L KH2PO4、0.100 g/L NaCl、0.250 g/L NaNO3、0.375 g/L MgSO4·7H2O、pH9.0 為最適濃度。