油菜素內酯對甜瓜農藥殘留的降解作用分析

楊世英,馬玉娥,賈斌鑫,華震宇,沈 琦,劉峰娟,王 成,3

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院,烏魯木齊 830052,2.新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所/農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室(烏魯木齊)/新疆農產品質量安全重點實驗室,烏魯木齊 830091,3.新疆農業科學院,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】新疆是我國重要的甜瓜主產區,常年甜瓜產量約占全國甜瓜總產量的16%左右。[1-3]。研究油菜素內酯(brassinolide,BR)處理對甜瓜中啶蟲脒、多菌靈、苯醚甲環唑、腈菌唑的降解作用及其機理,對油菜內酯在甜瓜中的應用有重要意義。【前人研究進展】在病蟲害綜合防治中也運用到殺蟲劑、殺菌劑等化學農藥[4]。BR是一種廣泛存在于植物中的天然植物激素[5],對植物的生長和發育,生物和非生物脅迫的發展起著至關重要的作用[6]。【本研究切入點】0.1 mg/L BR 能夠顯著促進芹菜中阿維菌素和辛硫磷的降解[7]。BR可促進農藥在植物體內的降解和代謝[8],在鴨梨[9]等果蔬上進行過類似研究,但是對于BR能否促進甜瓜果實中農殘的降解尚鮮有報道。需油菜素內酯對甜瓜農藥殘留的降解作用分析。【擬解決的關鍵問題】研究BR處理對甜瓜果實處理后農藥殘留含量、解毒酶活性、解毒基因表達量、活性氧含量以及解毒物質的影響,分析油菜素內酯對甜瓜果實農藥殘留降解機理,為油菜素內酯在甜瓜中的應用提供理論參考和支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 甜瓜種子

供試甜瓜種子購自昌吉市金豐種植有限責任公司,種植于新疆農業科學院綜合試驗場。試驗挑選大小均勻、成熟度相同、無損傷、無病害的甜瓜果實。

2,4-表油菜素內酯(索萊寶),乙腈(賽默飛世爾科技中國有限公司),無水硫酸鎂(成都市科隆化學品有限公司),氯化鈉(天津市盛奧化學試劑有限公司)。陶瓷均質子(河北藝心逸科技有限公司)。多糖多酚總RNA提取試劑盒、FastKing RT Kit (With gDNase)試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計(UV-2700,日本島津公司),LC-MS串聯四極桿液質聯用儀(XEVO-TQ,美國沃特世),超微量核酸蛋白測定儀(Nanodrop2000,賽默飛世爾科技有限公司),實時熒光定量PCR儀(LightCycler? 96,上海騰易生物科技有限公司),PCR擴增儀(Surecyder 8800,安捷倫科技有限公司)電泳儀(DYY-8C型,北京佳航博創科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集

選擇啶蟲脒、多菌靈、苯醚甲環唑、腈菌唑。處理組將甜瓜分別用1、0.5、0.1和0.01 mg/L的油菜素內酯處理后,噴施啶蟲脒3.3 mL/L、多菌靈2.5 g/L、苯醚甲環唑2.5 g/L、腈菌唑2.5 g/L,對照組用相同體積的清水噴施,測定各處理組甜瓜果實中4種農藥含量。0.1 mg/L油菜素內酯降解這4種農藥殘留的效果最好。選取0.1 mg/L油菜素內酯噴施甜瓜。

在甜瓜成熟前24 d左右噴施油菜素內酯,以清水處理做對照,第2 d噴施4種農藥,噴施農藥后分別于2 h(0 d),1、3、5、7、9、15和24 d,按照GB/T8855-2008采集樣品,2020年6～7月完成樣品采集。

1.2.2 樣品前處理

甜瓜果實(全果不去皮)按照四分法,切分、勻漿處理,稱取10 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈(色譜純),渦旋1 min,搖床振蕩30 min,取出后向離心管中加入2 g NaCl和2 g無水硫酸鎂,再渦旋1 min,10 000 r/min常溫離心3 min取上清液加入到PSA管中液面刻度線達到10 mL即可,充分振蕩1 min,4 000 r/min常溫離心5 min取上清液過0.22 μm濾膜加入到進樣小瓶中后,測定農藥殘留。剩余部分切成均勻的小塊,用錫紙包好后在液氮中浸泡,等待徹底凝固后放于-20℃保存。

1.2.3 農藥殘留測定

(1)色譜條件

色譜柱:C18色譜柱(ACQUITY UPLC BEH,50 mm×2.1 mm,1.7 μm,沃特世Waters公司);柱溫:40℃;樣品室溫度10℃;采用二元梯度洗脫分離,以甲醇(A)和1 mmol/L乙酸銨水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫,流速0.2 mL/min,進樣體積1 μL,運行15 min。梯度洗脫條件:0.0～1.0 min,5%A;1.0～2.0 min,5%～30%A;2～3 min,30%～45%A;3～7 min,45%～95%A;7～12 min,95%A。12～13 min,95%～5%A,13～15 min,5%A。

(2)質譜條件

采用高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)電噴霧離子源,選擇反應監測(SRM)電離源模式為電噴霧離子化(ESI),離子源極性為ESI+;離子源溫度:350℃;氣體流量:N2:1.0 L/h;Ar:0 mL/min;毛細管電壓:3.00 kV;脫溶劑溫度:650℃;錐孔氣流量:0 L/h;六級桿透鏡電壓:0 V。

1.2.4 酶活、代謝產物、活性氧代謝

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性,丙二醛(MDA)、可溶性蛋白、超氧陰離子(O2-)、還原型谷胱甘肽含量的測定參照曹建康[10]方法。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、過氧化氫含量采用索萊寶試劑盒進行測定。

1.2.5 解毒基因表達量

甜瓜總RNA的提取:采用多糖多酚總RNA提取試劑盒。

反轉錄:使用快速反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA。

引物設計:從NCBI官網查找甜瓜果實中POD、APX、CAT、PAL、SOD、POD 6種解毒基因序列,再通過軟件Primer 5.0設計引物,引物設計好之后,使用blast工具對設計出的引物進行檢測,將檢測合格的引物送至上海生工生物工程有限公司合成。

RT-PCR反應:以反轉錄合成得到的cDNA為模板,根據SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)試劑盒配制反應體系。

上機測定:在實時熒光定量PCR儀(LightCycler?96)上完成。

1.3 數據處理

用Origin2018軟件錄入數據并作圖,用SPSS26.0軟件對數據進行單因素方差分析(One-wayANOVA),用鄧肯氏多重差異進行比較,當P<0.05時,表示差異顯著,當P<0.01時,表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 BR處理對甜瓜果實中農殘含量的影響

研究表明,BR處理組甜瓜果實中苯醚甲環唑含量一直低于對照組果實含量。3～24 d處理組果實中苯醚甲環唑含量基本保持在0.05 mg/kg左右,而對照組在緩慢下降,到第24 d處理組相比于對照組降低了15.26%。在整個采樣過程中甜瓜果實中苯醚甲環唑含量始終小于最大限量值0.7 mg/kg,BR能有效降低甜瓜果實中苯醚甲環唑的含量。

BR處理組甜瓜果實中啶蟲脒含量除了第1 d高于對照組外,其余采樣期間均低于對照組。3～24 d BR處理組果實中啶蟲脒含量相比于對照組分別下降了97.06%,51.30%,47.70%,53.14%,65.52%和22.30%。在整個采樣過程中甜瓜果實中啶蟲脒含量始終小于最大限量值2 mg/kg。BR能夠有效減少甜瓜果實中啶蟲脒的含量。

BR處理組和對照組分別在第1 d和第3 d達到最大值,分別為0.67和0.72 mg/kg,處理組相比于對照組降低了6.94%,第7 d,處理組與對照組果實中多菌靈含量都在0.6 mg/kg左右,7～24 d,處理組與對照組都急劇下降,第24 d,處理組果實中多菌靈含量相比于對照組降低了45.12%。BR在一定程度上能降低甜瓜果實中多菌靈的含量。

噴施農藥后第1 d,處理組相比于對照組降低了44.44%,3～7 d處理組與對照組正好相反,處理組緩慢上升,對照組緩慢下降,7～15 d兩組趨勢相同都是向上高后下降。第24 d BR處理組比對照組下降了31.25%。BR能在一定程度上降低甜瓜果實中腈菌唑的含量。圖1

圖1 不同BR處理下甜瓜果實中4種農殘含量變化

在整個采樣期間BR處理組甜瓜果實中農殘總含量顯著低于對照組。第1 d對照組果實中農藥殘留是BR處理組的1.29倍。3～24 d 2組的變化趨勢大致相同。第24 d時BR處理組果實中農藥殘留的含量相比于對照組降低了36.36%。BR處理能有效降低甜瓜果實中農藥殘留的含量。圖2

圖2 不同BR處理下甜瓜果實中農殘含量變化

2.2 BR對甜瓜果實中活性氧代謝的影響

研究表明,甜瓜在噴施農藥后,對照組0～1 d超氧陰離子產生速率急劇下降,1～24 d超氧陰離子產生速率趨于平緩;BR處理組0～1 d緩慢下降,1～7 d緩慢上升,7～9 d緩慢下降。第24 d處理組與對照組超氧陰離子產生速率大致相等。BR處理可以能夠有效抑制甜瓜果實中超氧陰離子的產生速率。

BR處理組在噴施農藥第1 d時甜瓜果實中過氧化氫含量高于對照組32.67%(P<0.05)。噴施農藥0～1 d處理組過氧化氫含量相比于對照組急劇上升,1～3 d處理組與對照組均急劇下降,3～15 d處理組下降趨勢放緩,而對照組先急劇上升后緩慢下降,15～24 d兩者均急劇上升。BR處理能有效提高甜瓜果實中過氧化氫含量的積累。

BR可能將甜瓜果實代謝產生的不穩定的超氧陰離子轉化為更為穩定的過氧化氫,減少超氧陰離子對細胞的損害。圖3

圖3 不同BR處理下對甜瓜果實中活性氧代謝變化

2.3 BR處理對甜瓜果實中解毒酶活性和解毒基因表達量的影響

2.3.1 BR處理對甜瓜果實中解毒酶活性的影響

研究表明,在整個采樣期間,只有第3 d和第7 d BR處理組甜瓜果實中抗壞血酸過氧化物酶的活性略高于對照組果實中的酶活性,其余期間BR處理組果實中的酶活性均顯著小于對照組果實中的酶活性,并且處理組與對照組甜瓜果實中抗壞血酸過氧化物酶的活性起始值與結束值基本保持一致。BR處理未能有效提高甜瓜果實中抗壞血酸過氧化物酶的活性。

BR處理組在噴藥后的整個采樣期間甜瓜果實中過氧化氫酶的活性顯著高于對照組。0～1 d BR處理組比對照組高出46.47%(P<0.05)。1～7 d 兩組呈現出先急劇下降后急劇上升的趨勢。7～24 d BR處理組果實中酶活性先急劇下降后緩慢上升,對照組果實中酶活性一直穩定在11左右。BR處理在一定程度上能夠有效提高甜瓜果實中過氧化氫酶活性。

噴施農藥后,在整個采樣期間BR處理組甜瓜果實谷胱甘肽還原酶活性一直顯著高于對照組果實。BR處理組甜瓜果實酶活性在第7 d達到最大值1.399,是對照組果實的9.26倍(P<0.05),對照組甜瓜果實中酶活性在第1 d達到最大值0.58。BR能夠有效促進甜瓜果實中谷胱甘肽還原酶的活性。

甜瓜噴施農藥后在整個采樣期間BR處理組果實中苯丙氨酸解氨酶活性一直顯著高于對照組果實。采樣第3 d BR處理組相比于對照組高出了139.64%(P<0.05),第24 d處理組果實中酶活性比對照組高出12.34%。BR能在一定程度上有效提高甜瓜果實中苯丙氨酸解氨酶的活性。

BR處理組甜瓜果實中超氧化物歧化酶的活性在整個采樣時期除第15 d外,其余均高于對照組,但差異不顯著。BR處理組在第1 d相比于對照組上升了3.23%,第24 d BR處理組甜瓜果實中超氧化物酶活性比對照果實酶活性高0.48%。BR可以在一定程度上有效的提高甜瓜果實中超氧化物歧化酶的活性。

在整個采樣期間BR處理組甜瓜果實中過氧化物酶活性一直顯著高于對照組。第24 d BR處理組甜瓜果實中過氧化物酶活性高于對照組11.36%(P<0.05),BR處理甜瓜能夠在一定程度上有效提高果實中過氧化物酶的活性。圖4

圖4 不同BR處理下對甜瓜果實中解毒酶活性變化

2.3.2 BR處理對甜瓜果實中解毒基因表達量的影響

研究表明,APX基因表達量BR處理組始終處于對照組上方,采樣第0、3、7和9 d,BR處理組與對照組無顯著差異,采樣第1、5、15和24 d,BR處理組相比于對照組甜瓜果實中APX基因表達量分別提高了66.67%、166.67%、27.12%、104%。在整個采樣期間BR處理組與對照組相比APX基因表達量平均提高了30.43%。

CAT基因的表達量BR處理組與對照組在整個采樣期間均在1附近上下波動。除采樣第3 d,BR處理組CAT表達量低于對照組,其余天數均高于對照組,其中第1 d噴施BR對甜瓜果實中CAT基因表達量促進效果顯著比對照組提高了138.71%,CAT基因表達水平BR處理組與對照組相比平均提高了17.08%。

甜瓜果實中GR基因的表達量除第9 d BR處理組比對照組低外,其余采樣時間BR處理組均在對照組上方,在整個采樣期間BR處理組與對照組相比GR基因表達量平均提高了10.08%。

采樣7、9、24 d,BR處理組與對照組相比甜瓜果實中PAL基因的表達量分別提高了17.28%、7.69%、41.90%(P<0.05),其余天數BR處理組與對照組相比甜瓜果實中PAL基因的表達量無顯著提高,在整個采樣期間BR處理組與對照組相比PAL基因表達量平均提高了5.81%。

BR處理組整體處于對照組的上方,采樣第3、7、15、24 d,BR處理組與對照組相比甜瓜果實中SOD基因的表達量分別提高了22.22%、13.33%、79.37%、21.70%(P<0.05),其余采樣天數BR處理組相比與對照組無顯著提高。在整個采樣期間BR處理組與對照組相比SOD基因表達量平均提高了14.23%。

甜瓜果實中POD基因表達量BR處理組與對照組相比,除采樣第1、7、9、24 d無顯著提高,0、3、5、15 d分別提高了58%、34.85%、12.31%、16.26%(P<0.05),在整個采樣期間BR處理組與對照組相比POD基因表達量平均提高了12.88%。

噴施BR能顯著提高APX、CAT、GR、PAL、SOD、POD解毒基因的表達量,分別平均提高了30.43%、17.08%、10.08%、5.81%、14.23%、12.88%。圖5

圖5 不同BR處理下甜瓜果實中六種解毒基因表達量變化

2.4 BR處理對甜瓜果實中生理代謝的影響

研究表明,噴施農藥后的整個采樣期間BR處理組果實中還原型谷胱甘肽含量一直顯著高于對照組果實。BR處理組第3 d相比于對照組提高了62.5%(P<0.05),3～15 d以后BR處理組與對照組果實中還原型谷胱甘肽含量都急劇下降。15～24 dBR處理組與對照組都有略微上升。BR處理能有效提高甜瓜果實中還原型谷胱甘肽含量。

噴施農藥后在整個采樣期間對照組甜瓜果實中MDA含量一直顯著高于BR處理組果實中MDA含量。第24 d處理組果實MDA含量與對照組相比,低了25%左右,BR處理能夠有效抑制甜瓜果實中MDA含量。

噴施農藥后在采樣的第0、3、5和7 d,BR處理組甜瓜果實中可溶性蛋白質含量分別顯著高于對照組果實的22.86%、150.36%、16.02%、81.36%(P<0.05),采樣第9～24 d,BR處理組果實中可溶性蛋白質含量顯著低于對照組果實中可溶性蛋白質含量,BR處理能有效提高噴施農藥后前期甜瓜果實中可溶性蛋白質含量。圖6

圖6 不同BR處理下甜瓜果實中生理代謝變化

3 討 論

3.1當植物受到農藥脅迫時,油菜素內酯可以激活植物的抗氧化防御系統,促進農藥降解[11-13]。Sharma等[14]研究發現,BR處理芥菜型油菜種子后,使得SOD、CAT、GR、POD等解毒酶活性增強,GSH含量提高,SOD、CAT、GR、POD等解毒基因的表達增強,減少了芥菜幼苗中超過38%吡蟲啉殘留。陶媛[15]的研究表明,噴灑油菜素內酯可顯著提高番茄對百菌清(CHT)的抵抗能力,且番茄體內催化降解農藥的基因增加 4%。韭菜和大蒜幼苗噴施BR后,葉片中解毒酶活性有顯著提升,從而緩解了多種農藥的毒害作用[16,17]。汪季濤[18]研究發現番茄噴施殺菌劑和殺蟲劑后,GSH含量顯著提高,且GR、POD相關解毒酶活力及解毒相關基因的表達量也有明顯升高。外源噴施BR可以顯著提高半夏的塊莖中可溶性蛋白含量和PAL酶的活性[19]。研究發現,甜瓜噴施BR后,提高了甜瓜果實中POD、CAT、GR、PAL解毒酶的活性,APX、CAT、GR、PAL、SOD、POD相關解毒基因的表達量也有所提高,促進了甜瓜農藥殘留的降解,與上述研究結果相類似。

3.2植物處于逆境環境中,體內的代謝平衡被打破,使解毒系統整體下降,活性氧不斷累積,從而使機體受到脅迫傷害,但外源BR處理可以維持活性氧代謝的平衡,減緩脅迫造成的傷害。外源2,4-表油菜素內酯預處理能夠降低黃瓜葉片中H2O2和O2-的積累,維持植物體內氧化還原平衡[20]。番茄提前噴施BR,能使番茄在逆境環境中更加迅速地激活抗氧化酶系統來清除細胞所產生的H2O2和O2-[21]。BR噴施黃瓜后葉片中H2O2水平顯著提高[22],研究發現H2O2在活性氧代謝中對機體的毒害作用最小,可以以一種重要的信號分子來調節植物的生長發育過程[23]。試驗中BR處理使甜瓜果實中O2-含量在0～5 d顯著降低,可能由于BR提高了SOD、CAT、POD等解毒酶活性以及蛋白質等解毒物質的總體含量,進而達到加速機體中過氧化物質的排除。試驗中經處理后的甜瓜H2O2含量顯著升高,且BR處理組甜瓜果實中H2O2含量始終高于對照組,BR在一定程度上能提高甜瓜果實中H2O2含量,激活甜瓜的活性氧代謝系統,降低農藥殘留。

3.3葉片噴施不同濃度的EBR可使可溶性蛋白質含量顯著升高,對穩定細胞膜的結構具有積極作用[24]。試驗結果表明,BR處理可以在前期增高甜瓜果實滲透調節物質(可溶性蛋白)含量,使得植物細胞膜保持穩定狀態。在非生物脅迫下,MDA含量會顯著增高,降低細胞膜的流動性,破壞離子平衡,對植物細胞膜造成損傷[25]。EBR處理有效抑制了辣椒果實MDA含量的積累,減緩了總解毒能力的下降,較好地保持辣椒果實中解毒酶的活性,防止活性氧的過量積累對辣椒機體造成損害,保護細胞膜的完整性和功能性[26]。在整個采樣期間,BR處理組甜瓜果實中丙二醛含量顯著低于清水對照組。GSH是農藥降解代謝中重要的中間物質,在植物體內農藥降解代謝中起著重要的調控作用,BR能夠促進植物體內谷胱甘肽等相關物質的合成,通過調控谷胱甘肽相關物質代謝而促進植物體內的農藥代謝[27]。研究表明,BR處理使甜瓜果實中GSH含量顯著增加,可能由于噴施農藥而激發了植物體內的保護機制,進而使解毒物質含量快速升高。

BR可顯著加速農藥殘留的降解,其機制可能與激發植物內在解毒機制有關。油菜素內酯處理能顯著促進番茄、黃瓜、辣椒等作物中毒死蜱、百菌清等農藥殘留的降解[28,29]。Zhou 等[30]指出0.1 mmol/L EBR處理可使水稻、茶葉、西蘭花、草莓等植物上常見有機磷、有機氯、氨基甲酸酯類農藥殘留量減少 30%～70%。試驗中,甜瓜通過噴施BR而使得最終甜瓜果實中啶蟲脒、多菌靈、苯醚甲環唑、腈菌唑四種農殘含量都顯著降低,是因為BR提高了甜瓜果實中解毒酶活性、解毒基因表達量、解毒物質含量,從而達到的效果。

4 結 論

4.1BR能有效加速甜瓜果實中啶蟲脒、多菌靈、苯醚甲環唑、腈菌唑的降解速率,在采樣第24 d,相比于對照組的4種農藥殘留量分別降低了22.30%,45.12%,15.26%,31.25%。

4.2BR處理使在農藥處理下甜瓜果實中O2-產生速率顯著降低,而H2O2在一定程度上含量有所上升;BR處理使得甜瓜果實中解毒酶(POD、CAT、GR、PAL)活性總體處于較高的水平;同時BR處理可以增高甜瓜果實前期滲透調節物質(可溶性蛋白)含量,顯著降低MDA含量,顯著提高GSH的含量。

4.3噴施BR能顯著提高APX、CAT、GR、PAL、SOD、POD解毒基因的表達量。