基于網絡藥理學和分子對接技術探討防己黃芪湯治療單純性肥胖的作用機制*

姜健,嚴軍

上海市嘉定區中醫醫院,上海 201800

防己黃芪湯出自張仲景的《金匱要略》,為固表益氣、祛風利濕的經典良方。全方由防己、黃芪、白術、甘草組成,防己和黃芪為君藥,具有益氣固表、祛風行水之效;臣藥為白術,佐以健脾補氣祛濕,助君藥之效;甘草為佐使藥,以助君臣,兼以調和諸藥[1]。防己黃芪湯在現代臨床運用中較為廣泛,涉及肥胖、糖尿病等代謝性疾病及腎臟疾病、心肺疾病、肢體關節痛、風濕性疾病、癌病等[2-3]。在中華醫學會內分泌學分會等撰寫的2021年《基于臨床的肥胖癥多學科診療共識》中指出,中醫辨證論治是治療肥胖癥的有效手段之一,推薦防己黃芪湯治療脾虛不運型肥胖[4]。一項隨機對照的臨床研究表明,防己黃芪湯可有效改善單純性肥胖患者的肥胖指標和血脂水平,提高臨床療效[5]。本文利用網絡藥理學和分子對接技術方法探討防己黃芪湯治療單純性肥胖的作用機制,為后續深入進行機制研究提供基礎。

1 資料與方法

1.1 防己黃芪湯有效活性成分的篩選及靶點預測運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)獲取防己黃芪湯組方中藥的化學成分,設定口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,類藥性指數(drug-likeness,DL)≥0.18,獲得防己黃芪湯的有效活性成分。同時通過TCMSP平臺預測有效藥物活性成分的作用靶點。最后利用 Uniprot 數據庫對靶點蛋白名稱進行標準化處理。

1.2 單純性肥胖的疾病靶點獲取通過查詢 GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)和 在線人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org/),以“simple obesity”為關鍵詞進行篩選,將兩個數據庫查詢的疾病靶點進行合并,刪除重復項,獲取單純性肥胖的疾病靶點。其中,GeneCards數據庫獲得的疾病靶點選取相關度評分(relevance score)≥3的靶點。

1.3 防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點通過Omicshare平臺(https://www.omicshare.com/)將單純性肥胖疾病靶點與防己黃芪湯有效成分相關作用靶點取交集,繪制藥物作用靶點與疾病靶點韋恩圖,交集靶點即為防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點。

1.4 “中藥-活性成分-潛在靶點”網絡構建和關鍵有效活性成分篩選將篩選獲得的防己黃芪湯治療單純性肥胖的交集靶點和其對應的活性成分、中藥導入Cytoscape 3.9.1軟件,構建“中藥-活性成分-潛在靶點”網絡圖,并運用Analyze Network進行網絡拓撲分析,依據Degree值大小決定節點大小,節點越大,該節點越關鍵,并依此篩選出關鍵藥物活性成分[6]。

1.5 蛋白質互作網絡(protein-protein interaction networks,PPI)構建及核心靶點篩選將防己黃芪湯治療單純性肥胖的作用靶點導入STRING數據庫(https://cn.string-db.org/),蛋白物種設置為“Homo sapiens”,最低相互作用閾值設為medium confidence>0.4,隱藏蛋白互作網絡中孤立靶點,其他參數保持默認設置,獲得蛋白互作網絡分析結果,并以TSV格式導出。運用Cytoscape 3.9.1軟件將蛋白互作網絡進行可視化,利用“Cytohubba”插件進行拓撲分析,按照Degree大小排序,將Degree排名前8位的靶點進行聚類展示,并以此作為核心靶點[7]。

1.6 防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點的富集分析應用R軟件中Bioconductor模塊軟件包“org.Hs.eg.db”運行完entrez ID轉換;采用R軟件中的“DOSE”“clusterProfiler”等模塊對篩選出防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點進行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析,以P<0.05為篩選參數,輸出富集分析結果,然后使用ImageGP平臺(http://www.ehbio.com/ImageGP/)將GO和 KEGG分析的結果進行可視化調整,制成對應的氣泡圖。

1.7 防己黃芪湯關鍵藥物活性成分與核心靶點的分子對接在Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載防己黃芪湯的關鍵活性成分和靶點的3D結構;利用PYMOL 2.5.0軟件對核心靶點蛋白進行去除水分子、去除配體等操作,并采用 AutoDock Tools 軟件進行加氫、平衡電荷等修飾,最后將受體蛋白和配體小分子分別轉化為pdbqt格式。利用 AutoDockVina軟件對受體蛋白與配體小分子進行分子對接,獲得關鍵化合物與核心靶點分子對接結合能參數,最后運用PYMOL 2.5.0軟件對分子對接結果進行可視化。

2 結果

2.1 防己黃芪湯有效活性成分及靶點通過TCMSP平臺獲得防己黃芪湯各組方中藥的有效活性成分及作用靶點,然后利用 Uniprot 數據庫對相關靶點蛋白名稱進行標準化處理,最終獲得黃芪的有效活性成分16個,相應靶點99個;防己有效活性成分2個,相應靶點18個;白術有效活性成分3個,相應靶點11個;甘草有效活性成分88個,相應靶點107個,見表1。將所有中藥的有效活性成分以及靶點整合,刪除重復項,獲得防己黃芪湯有效活性成分101個,相應靶點110個。

表1 防己黃芪湯部分藥物活性成分

2.2 防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點整合GeneCards和OMIM數據庫獲得單純性肥胖的疾病靶點總數為1 195個。將單純性肥胖的疾病靶點與防己黃芪湯有效活性藥物成分的110個作用靶點取交集,獲得61個治療靶點,即是防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點,見圖1。

圖1 單純性肥胖疾病靶點與防己黃芪湯有效活性成分靶點VEEN圖

2.3 “中藥-活性成分-潛在靶點”網絡圖和關鍵有效藥物成分篩選結果將防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點和其對應的活性成分、中藥導入 Cytoscape 3.9.1軟件進行可視化,構成“中藥-活性成分-潛在靶點”網絡圖,見圖2。運用Analyze Network進行網絡拓撲分析,獲得159個節點,708個邊,按照Degree的大小排序,排名前4位的化合物為槲皮素、山柰酚、異鼠李素、芒柄花黃素,即為防己黃芪湯的關鍵藥物活性成分,后續與核心靶點進行分子對接。

圖2 “中藥-活性成分-潛在靶點”網絡圖

2.4 PPI網絡拓撲分析及核心靶點的篩選結果防己黃芪湯治療單純性肥胖的61個作用靶點導入STRING數據庫,然后獲得PPI網絡分析結果,以TSV格式導入Cytoscape 3.9.1軟件進行可視化,形成涉及60個靶點,578對蛋白互作關系的網絡圖。利用“Cytohubba”插件篩選出 PPI網絡圖中Degree值前8位的蛋白靶點進行聚類,并以此作為核心靶點,即是白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARG)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,CASP3)、雌激素受體α(estrogen receptor alpha,ESR1)、MYC、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF1α)。見圖3。

圖3 防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在靶點PPI網絡圖

2.5 防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點的富集分析結果GO富集分析選取生物學過程(biological process,BP)、細胞成分(cellular component,CC) 和 分子功能(molecular function,MF) 中可信度前20位的條目進行注釋,見圖4。在BP中,潛在作用靶點主要富集在類固醇激素反應(response to steroid hormone)、對酮的反應(response to ketone)、活性氧代謝過程(reactive oxygen species metabolism process)、類固醇激素刺激的細胞反應(cellular response to steroid hormone stimulus)、缺氧反應(response to hypoxia)等;在CC中,靶點蛋白集中在薄膜筏(membrane raft)、膜微區(membrane microdomain)、膜區(membrane region)、囊泡腔(vesicle lumen)、線粒體外膜(mitochondrial outer membrane)、血漿脂蛋白顆粒(plasma lipoprotein particle)、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物(RNA polymerase Ⅱ transcription factor complexe)等;而MF分析顯示,潛在作用靶點主要富集在核受體活性(nuclear receptor activity),轉錄因子活性、直接配體調節序列特異性DNA結合(transcription factor activity,direct ligand regulated sequence-specific DNA binding),類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity),DNA結合轉錄激活劑活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性(DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase Ⅱ-specific),氧化還原酶活性、作用于NAD(P)H、血紅素蛋白作為受體(oxidoreductase activity,acting on NAD (P) H,heme protein as receptor),半胱氨酸型內肽酶活性參與細胞凋亡過程(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process),氧化還原酶活性、作用于配對供體、結合或還原分子氧(oxidoreductase activity,acting on paired donors,with incorporation or reduction of molecular oxygen),泛素蛋白連接酶結合(ubiquitin protein ligase binding),ATP酶結合(ATPase binding),激活轉錄因子結合(activating transcription factor binding)等。

注:圖中的點越大,說明富集的基因越多,圓點顏色越紅,說明富集的可信度越大。圖4 GO功能富集分析

KEGG通路富集分析的結果選取可信度排名前30位的通路,見圖5。靶點基因主要富集的信號通路為胰島素抵抗(insulin resistance)、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease)、脂質和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)等,同時還涉及卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、丙型肝炎(hepatitis C)、愛潑斯坦-巴爾病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、乙型肝炎(hepatitis B)等病毒感染相關通路,以及結直腸癌(colorectal cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、乳腺癌(breast cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)等癌癥相關通路。

注:圖中圓點越大,說明富集的基因越多,圓點顏色越紅,說明富集的可信度越大。圖5 KEGG信號通路富集分析

2.6 防己黃芪湯關鍵活性成分與核心靶點分子對接將槲皮素、山柰酚、異鼠李素、芒柄花黃素四個關鍵活性成分與PPI網絡中篩選的核心靶點IL-6、PPARG、VEGFA、CASP3、ESR1、MYC、EGFR、HIF1A進行分子對接,結果見表2,圖6。一般認為,當配體與受體結合能量越低時,其結合構象越穩定,相互作用的可能性越大,當最低化學結合能<0 kcal·mol-1

注:圖中關鍵成分與靶點交叉點的顏色代表其分子對接結合能的大小,顏色越紅,代表其結合能越高;顏色越藍,代表其結合能越低。圖6 防己黃芪湯關鍵藥物活性成分與核心靶點的分子對接結果熱圖

表2 防己黃芪湯關鍵活性成分與核心靶點的分子對接結果 (kcal·mol-1)

時可以在自然狀態下對接;最低化學結合能<-5 kcal·mol-1時,對接結果良好;結合能<-7.0 kcal·mol-1表示受體與配體之間具有強烈的結合活性[8-9]。根據分子對接結果可知,關鍵活性成分與核心靶點均具有良好的結合活性。而HIF1A、CASP3、PPARG、EGFR與關鍵活性成分結合能較低,因此上述4個蛋白是治療靶點的可能性更大,其中PPARG涉及脂質與動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝信號通路;HIF1A涉及卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、化學致癌-活性氧、HIF-1信號通路、癌癥中的蛋白聚糖信號通路;CASP3涉及脂質與動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、麻疹、酒精性肝病、TNF信號通路、大腸癌、弓形蟲病、丙型肝炎、EB病毒感染、乙型肝炎、IL-17信號通路、人巨細胞病毒感染、細胞凋亡、鉑類耐藥性、p53信號通路、非酒精性脂肪肝、癌癥中的蛋白聚糖、細胞凋亡信號通路;EGFR涉及化學致癌-受體激活、化學致癌-活性氧、前列腺癌、大腸癌、丙型肝炎、內分泌抵抗、人巨細胞病毒感染、乳腺癌、HIF-1信號通路、胰腺癌、癌癥中的蛋白聚糖、肝細胞癌、子宮內膜癌等。相關蛋白涉及的信號通路及蛋白間的網絡圖見圖7。其中PPARG、HIF1A與關鍵活性成分(槲皮素、山柰酚、異鼠李素、芒柄花黃素)之間具有強烈的結合活性,因此運用PYMOL 2.5.0軟件對分子對接結果進行可視化,見圖8。

3 討論

肥胖是由遺傳和環境等因素共同作用,導致機體總脂肪含量過多和/或局部脂肪含量增多及分布異常的慢性代謝性疾病[10],其常導致或伴發心血管疾病、2型糖尿病、癌癥和膽囊疾病等[11]。雖然飲食、身體活動和行為改變是減重的基石,但僅通過改變生活方式實現的體質量減輕通常是有限的并且難以維持,而且從長遠來看是無效的[12],因此藥物治療的手段必不可少。目前用于治療肥胖的藥物主要有奧利司他、利拉魯肽等[13],但其胃腸道反應常導致患者不能耐受,而針灸、中藥等傳統中醫藥療法是減重的有效方法[14-15],其易于接受,引起的不良反應相對較少。

中醫認為肥胖的發生多與飲食不節、多逸少勞、脾虛不運、腎陽虛衰、肝氣郁結等因素有關[16],在2021年《基于臨床的肥胖癥多學科診療共識》[4]中指出,依據肥胖的病因病機進行辨證分型論治是治療肥胖癥的有效手段之一,推薦防己黃芪湯治療脾虛不運型肥胖。一項臨床研究結果表明,防己黃芪湯能夠有效降低肥胖患者的BMI和血脂,且可調節瘦素(leptin)、神經肽Y(neuropeptide Y,NPY)、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)水平[17]。

目前,尚無防己黃芪湯治療單純性肥胖的作用機制研究,因此,本研究基于網絡藥理學和分子對接技術探討防己黃芪湯治療單純性肥胖的作用機制,為后續圍繞其關鍵靶點與信號通路進一步深入開展實驗研究提供方向。

本研究通過防己黃芪湯作用靶點和單純性肥胖靶點蛋白取交集,獲得潛在治療靶點61個;潛在的治療靶點通過擴展的網絡分析,篩選出前8位關鍵治療靶點,即IL-6、PPARG、VEGFA、CASP3、ESR1、MYC、EGFR、HIF1A;而結合分子對接結果顯示,HIF1A、CASP3、PPARG、EGFR與關鍵活性成分結合能的絕對值排名靠前,因此上述4個蛋白是治療靶點可能性更大。缺氧抑制因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha,HIF1A)是一種高度保守的轉錄因子,在組織對缺氧的反應中起關鍵作用,在肥胖的脂肪組織中表達增加[18],從而誘導白色脂肪組織纖維化和炎癥,導致肥胖相關的代謝功能障礙[19]。CASP3是一種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶,在多細胞生物中高度保守,作為細胞凋亡的中樞調節因子[20],可以誘導脂肪細胞的凋亡[21]。PPARG主要在白色和棕色的脂肪組織中表達,與靶基因啟動子調控序列結合,作為調節脂肪組織中前脂肪細胞分化的關鍵因子,在調節脂肪細胞代謝中起重要作用[22];EGFR是受體酪氨酸激酶ErbB家族的成員,在調節脂肪組織的存活、增殖、遷移和分化中起著核心作用,可以調控下游RAS/RAF/MAPK和PI3K/Akt途徑影響糖酵解和葡萄糖轉運,改善胰島素抵抗[23]。

HIF1A表達增加受EGFR/MEK/ERK通路的激活控制[24],而HIF1A可誘導產生和分泌血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)。分泌到微環境中的PDGF通過作用于脂肪前體細胞表達的PDGF受體,從而激活胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK),特異性地磷酸化PPARG,從而抑制PPARG活性以及脂肪前體細胞的分化潛能[25]。CASP3轉化為其活性形式被認為是細胞死亡信號級聯中的關鍵過程[26],而有研究結果顯示,抑制HIF1A蛋白水平可以誘導脂肪細胞CASP3的表達[27],進而促進脂肪細胞的凋亡。因此,HIF1A、EGFR、PPARG、CASP3可共同調控脂肪細胞的分化與凋亡。

GO富集分析結果表明,潛在的作用靶點主要集中在類固醇激素反應、活性氧代謝過程、缺氧反應等生物學過程,定位在薄膜筏、膜微區、膜區、囊泡腔等細胞部位,影響核受體活性、轉錄因子活性,類固醇激素受體、細胞凋亡過程、氧化還原酶活性等分子功能,調節脂肪細胞的生命活動。KEGG 富集分析顯示,防己黃芪湯治療單純性肥胖的重要信號通路包括脂質與動脈粥樣硬化、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、細胞凋亡、p53信號通路、胰島素抵抗、HIF-1信號通路、非酒精性脂肪肝等。脂肪毒性誘導的肝臟炎癥與肥胖引起的脂肪組織改變和重塑有關,導致非酒精性脂肪性肝病。脂聯素及其同源受體,特別是肝臟中的脂聯素受體-2的全面串擾通過與肝PPARG的相互作用改善肥胖誘導的非酒精性脂肪性肝病[28]。缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一種重要的轉錄因子,可誘導人類癌癥低氧條件下的適應性反應[29],通過下調HIF-1信號通路中Akt1和HIF-1α的蛋白表達,上調VEGFA蛋白表達[30],可以促進微血管生成,改善細胞氧供。AGEs與AGE受體相互作用,產生氧化應激、炎癥、胰島素抵抗和細胞衰老等生物過程;有研究表明,脂肪細胞中AGE/RAGE軸在調節肥胖和胰島素抵抗中具有關鍵作用;另外,RAGE可以上調Caspase 3,從而誘發細胞死亡[31-32]。TNF信號傳導途徑的關鍵基因有Ptgs2和Socs3、Caspase-3基因[33]。細胞膜上TNFR1在與活性形式的TNF-α結合后,可以激活Caspase等凋亡級聯反應,誘發細胞凋亡[34]。IL-17是一個重要的促炎癥細胞因子,由輔助性T細胞17(helper T cell 17,Th17)及先天性免疫細胞等分泌,在多種炎性反應及自身免疫性疾病病理過程中發揮關鍵作用[35];IL-17信號通路主要活化核轉錄因子-κB信號通路、蛋白酪氨酸激酶/信號轉導及轉錄激活因子信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B 信號通路和絲裂原活化蛋白激酶信號通路,從而導致炎癥、腫瘤細胞增殖、細胞凋亡等多個生理過程[36]。因此,防己黃芪湯治療單純性肥胖的重要通路與炎癥、氧化過程、胰島素抵抗、細胞凋亡等通路密切相關。

分子對接的結果顯示,槲皮素、山柰酚、異鼠李素、芒柄花黃素與關鍵靶點結合良好,其中槲皮素、山柰酚、異鼠李素分子對接結果更優。有實驗研究表明,槲皮素能夠抑制脂肪細胞和巨噬細胞中的MAPK信號因子ERK1/2、JNK、p38MAPK以及 MCP-1、TNF-α和炎性細胞因子IL-1β和IL-6的分泌,并刺激抗炎細胞因子IL-10的分泌,從而抑制脂肪形成和炎癥相關細胞因子的表達[37]。山柰酚可抑制TLR4/NF-κB通路來改善腸屏障完整性并抑制腸道炎癥以及調節肥胖盲腸微生物群的生態失調[38]。另有一些研究顯示,山柰酚可能通過調節下丘腦中樞以達到減重效果[39]。異鼠李素可以降低內質網應激標志物和產脂酶的mRNA表達以減少肝臟脂質含量[40],亦有抗炎、減少高糖高脂誘導胰島β細胞凋亡的作用[41]。

綜上所述,本研究通過網絡藥理學與分子對接分析防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在靶點及作用機制,發現防己黃芪湯治療單純性肥胖可能的核心活性成分是槲皮素、山柰酚、異鼠李素等,潛在關鍵靶點是 HIF1A、CASP3、PPARG、EGFR等,關鍵信號通路包括AGE-RAGE、TNF、IL-17、細胞凋亡、p53、胰島素抵抗、HIF-1、非酒精性脂肪肝等。提示,防己黃芪湯可以通過多組分、多靶點、多通路協同機制治療單純性肥胖,是臨床治療單純性肥胖的基方,后續將進一步對關鍵靶點與信號通路開展實驗及臨床研究。