NLRP3介導的六君子湯治療慢性萎縮性胃炎及炎癌轉(zhuǎn)化的作用機制分析*

孫慶生,黃彭,李希,張姍,張照蘭

1.鄭州市中醫(yī)院,河南 鄭州 450000; 2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院,遼寧 大連 116011;3.睢縣人民醫(yī)院,河南 睢縣 476900; 4.濰坊市人民醫(yī)院,山東 濰坊 261000; 5.虞城縣人民醫(yī)院,河南 虞城 476300; 6.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是最常見的消化系統(tǒng)疾病,以黏膜萎縮、血管外露和黏膜結節(jié)為特征,臨床主要表現(xiàn)為上腹痛、消化不良、腹脹、惡心、嘔吐、打嗝、食欲不振和體質(zhì)量減輕等。從病理學角度來講,CAG可發(fā)展為腸化生和異型增生,而這些都屬于癌前病變,也是從炎癥到腸型胃癌的重要病理階段[1]。數(shù)據(jù)顯示,1%的慢性胃部炎癥患者可能發(fā)展為惡性胃腫瘤[2]。目前CAG的西醫(yī)治療包括保護胃黏膜、抗幽門螺桿菌以及促進胃動力方面的藥物。從中醫(yī)學來講,慢性萎縮性胃炎屬于“痞滿”“胃脘痛”等范疇,臨床常見分型主要為脾胃虛弱證。六君子湯來源于《醫(yī)學正傳》,由人參、白術、茯苓、甘草、陳皮、半夏6味中藥組成,具有益氣健脾,燥濕化痰的功效,主要用于治療食少便溏、胸脘痞悶、嘔逆等脾胃氣虛兼痰濕等脾胃氣虛之證,臨床研究表明,六君子湯可緩解脾胃虛弱型CAG患者的臨床癥狀,減輕患者氧化應激及炎癥反應[3]。

網(wǎng)絡藥理學是生物信息學的重要組成部分,在解析多組分藥物作用方面發(fā)揮著重要的作用。李梢提出“網(wǎng)絡靶點”這一新概念,將單個分子藥物靶點的概念擴展到其對生物網(wǎng)絡的系統(tǒng)效應,以研究化合物的系統(tǒng)性作用機制[4]。作為網(wǎng)絡藥理學的核心觀點,“網(wǎng)絡靶點”為分析研究中藥方劑的物質(zhì)基礎及指導活性成分的挖掘提供新的研究策略。

CAG的本質(zhì)是慢性炎癥浸潤[5],在生理病理過程中,核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小體以非活性形式出現(xiàn),并被許多信號激活,在促進細胞炎癥及程序性死亡中發(fā)揮重要作用[6]。目前,NLRP3炎性小體在慢性萎縮性胃炎中的研究缺乏,且在胃炎向胃癌轉(zhuǎn)化機制中作用不明確。為了更好地研究NLRP3炎性小體介導的六君子湯治療慢性萎縮性胃炎及其炎癌轉(zhuǎn)化機制,本研究應用網(wǎng)絡藥理學進行分析,通過對六君子湯中目標化合物進行預測,將活性化學成分分別與活性靶點進行分子對接比較,同時,應用KEGG通路富集分析,進一步探究六君子湯對CAG的作用機制,并通過開源數(shù)據(jù)庫分析平臺對腸化生、異型增生、胃癌的不同病理階段的核心靶點進行分析。

1 資料與方法

1.1 NLRP3相關靶點的預測以“NRLP3”為關鍵詞,從以下數(shù)據(jù)庫中獲取NRLP3相關靶點:(1)比較毒理基因組學數(shù)據(jù)庫(comparative toxicogenomics database,CTD,http://ctdbase.org/):用于研究化學物質(zhì)、基因和疾病之間的作用關系;(2)STRING數(shù)據(jù)庫:STRING作為在線分析平臺,能夠根據(jù)置信區(qū)間的不同,對不同蛋白質(zhì)之間的功能聯(lián)系進行預測;(3)STITCH數(shù)據(jù)庫:STITCH數(shù)據(jù)庫是一個用于檢索已知的以及被預測的化合物和靶蛋白之間相互作用關系的開源數(shù)據(jù)庫平臺。

1.2 六君子湯化學成分篩選、靶點預測和NLRP3介導活性成分相關靶點的獲取藥物吸收、分布、代謝和排泄(absorption、distribution、metabolism、excretion,ADME)研究是藥代動力學的重要內(nèi)容,在藥物篩選方面占有重要的地位。藥物不僅具備較好的臨床效果,還需要擁有最佳的ADME特性[7]。ADME參數(shù)的應用,不僅有利于降低新藥研發(fā)的成本,而且有助于提高成功率。本研究基于藥物ADME特性,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和類藥性(drug-likeness,DL)作為篩選指標,設定OB≥30%且DL≥0.18[8],分別以“人參”“茯苓”“白術”“甘草”“半夏”“陳皮”為關鍵詞,從中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[9]篩選六君子湯組方中藥的活性成分。基于所篩選化學成分,通過以下2種方法預測成分相關靶點:(1)以活性成分為關鍵詞,在TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索相關靶點,選取來源于“DrugBank”的靶點以提高結果預測的準確性,其中DrugBank是生物信息學和化學信息學相結合的數(shù)據(jù)庫,詳細地將藥物數(shù)據(jù)和藥物靶標信息結合起來;(2)利用PubChem數(shù)據(jù)庫檢索成分的Canonical SMILES,并采用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)[10]預測活性成分相關靶點。作為一個在線網(wǎng)絡工具,Swiss Target Prediction基于相似原理,通過反向篩選預測小分子最可能的蛋白質(zhì)靶標。根據(jù)其結果相關性,選取“probability>0.5”的靶點進行下一步分析[11]。使用Uniport數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)[12]將成分所對應的蛋白名稱轉(zhuǎn)化為基因名,限定物種為“human”,從而獲取成分相應靶點基因。將NLRP3相關活性靶點和活性成分靶點導入Cytoscape軟件獲取活性成分相關靶點和NLRP3相關靶點的交集,并構建“中藥-活性成分-交集靶點-NLRP3”網(wǎng)絡圖,應用Network Analyzer功能對網(wǎng)絡進行拓撲分析篩選核心活性成分。利用Cytoscape插件“Network Analyzer”功能對可視化網(wǎng)絡進行拓撲學分析,獲取自由度值(Degree)等相關參數(shù)以分析網(wǎng)絡節(jié)點重要性。在網(wǎng)絡圖中,“節(jié)點”表示中藥、活性成分、靶點或疾病,“邊”是指兩個節(jié)點之間的聯(lián)系,節(jié)點的“度”是描述與節(jié)點相連的邊的數(shù)目[13],度值越大,表明節(jié)點在網(wǎng)絡中的重要性相對較高。

1.3 慢性萎縮性胃炎、炎癌轉(zhuǎn)化重要病理階段靶點預測和NLRP3介導的疾病相關靶點獲取以“慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis)、腸上皮化生(intestinal metaplasia)、胃黏膜上皮異型增生(gastric epithelial dysplasia)、胃癌(gastric carcinoma/cancer)”為關鍵詞,從以下數(shù)據(jù)庫中獲得疾病相關靶點:(1)DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/);(2)GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),選擇“Score>1”的靶點;(3)CTD數(shù)據(jù)庫,選取經(jīng)過驗證的靶點;(4)藥物靶標數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database,TTD,http://db.idrblab.net/ttd/)。通過Cytoscape3.2.1軟件Merge功能取慢性萎縮性胃炎相關靶點和NLRP3相關靶點的交集,并構建“慢性萎縮性胃炎-NLRP3”網(wǎng)絡圖。

1.4 NLRP3介導六君子湯治療慢性萎縮性胃炎潛在作用靶點的獲取靶點通常作為網(wǎng)絡中的成員發(fā)揮著整體協(xié)同作用,靶基因之間的相互作用關系在許多疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用。隨著醫(yī)學水平的高速發(fā)展,嚴重疾病的治療正在從基因水平上得到解決[14],因此,了解蛋白之間相互作用關系,也有助于進一步研究其作用機制。將NLRP3介導的活性成分治療慢性萎縮性胃炎靶點定義為潛在作用靶點,將“中藥-活性成分-交集靶點-NLRP3”網(wǎng)絡和“慢性萎縮性胃炎-NLRP3”網(wǎng)絡相交,獲取潛在靶點。為了獲取蛋白之間相互關系,通過STRING數(shù)據(jù)庫對潛在作用靶點進行分析,設定“Minimum Required Interaction Score ≥ 0.9”“Active Interaction Sources”來源于“Experiments”,獲取潛在靶點相互作用網(wǎng)絡,并利用Cytoscape將結果進行可視化,獲得蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡,通過網(wǎng)絡拓撲分析進一步揭示網(wǎng)絡中的關鍵靶點。

1.5 NLRP3介導的六君子湯治療慢性萎縮性胃炎潛在作用靶點通路富集分析為了進一步闡明潛在作用靶點的作用機制,通過生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp,V6.8)對靶點進行京都基因與基因組百科全書 (Kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)通路富集分析,設定“Background”為“Homo sapiens”,以P<0.05作為顯著功能和通路的臨界值,并利用Cytoscape將“潛在靶點-通路”結果進行可視化分析。

1.6 分子對接通過對網(wǎng)絡拓撲學分析之后,篩選出NLRP3介導的度值較高的靶點和相關活性成分,從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.pdb.org/)下載候選靶點的晶體結構(http://www.pdb.org/),從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載化合物的SDF格式文件,通過SYBYL-X2.0軟件進行去水、加氫和格式轉(zhuǎn)換,執(zhí)行分子對接,計算活性化合物和靶點的結合分數(shù)。為了更好地進行對比,同樣選取陽性西藥阿莫西林進行分子對接。

2 結果

2.1 NLRP3相關靶點以“NRLP3”為關鍵詞,基于CTD、STRING和STITCH數(shù)據(jù)庫檢索相關靶點,去重后共計獲得270靶點。靶點網(wǎng)絡如圖1。

2.2 六君子湯化學成分及相關靶點和NLRP3介導活性成分相關靶點基于OB≥30%且DL≥0.18的篩選標準,從TCMSP數(shù)據(jù)庫得到六君子湯組方中藥的152個活性成分。從TCMSP和Swiss Target Prediction預測得到181個成分相關靶點。通過Cytoscape3.2.1軟件Merge功能取活性成分相關靶點和NLRP3相關靶點的交集,并構建“中藥-活性成分-交集靶點-NLRP3”網(wǎng)絡圖,如圖2所示,此網(wǎng)絡包含127個節(jié)點(6個中藥節(jié)點,107個活性成分節(jié)點,13個NLRP3介導的靶點)。應用Network Analyzer功能對網(wǎng)絡進行拓撲分析發(fā)現(xiàn),MOL000422(Kaempferol,山柰酚)和MOL004328(Naringenin,柚皮素)具有較高的Degree值,可能參與的生物功能較多,在網(wǎng)絡中的重要性相對較強。

2.3 慢性萎縮性胃炎和NLRP3介導的疾病相關靶點從DisGeNET、GeneCards、CTD和TTD數(shù)據(jù)庫獲取慢性萎縮性胃炎相關靶點10 086個,通過Cytoscape3.2.1軟件Merge功能取慢性萎縮性胃炎相關靶點和NLRP3相關靶點的交集,并構建“慢性萎縮性胃炎-NLRP3”網(wǎng)絡圖,如圖3所示,此網(wǎng)絡包含105個節(jié)點(1個疾病節(jié)點,NLRP3介導的疾病靶點103個)。

2.4 NLRP3介導的六君子湯治療慢性萎縮性胃炎的潛在作用靶點將“中藥-活性成分-交集靶點-NLRP3”網(wǎng)絡和“慢性萎縮性胃炎-NLRP3”網(wǎng)絡相交,獲取11個潛在靶點。應用STRING數(shù)據(jù)庫獲取潛在靶點的PPI關系,設定“Minimum Required Interaction Score ≥ 0.9”“Active Interaction Sources”來源于“Experiments”,獲取潛在靶點相互作用網(wǎng)絡,并利用Cytoscape將結果進行可視化,如圖4所示,PPI網(wǎng)絡由45個節(jié)點(11個潛在靶點經(jīng)STRING分析得到45個節(jié)點)構成,網(wǎng)絡拓撲學分析顯示,JUN、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARG)、蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等靶點位于最內(nèi)側(cè)圈,具有較高的度值,可能在疾病治療中發(fā)揮著重要的作用。

圖4 NLRP3介導的六君子湯治療慢性萎縮性胃炎潛在作用靶點PPI網(wǎng)絡圖

2.5 NLRP3介導的六君子湯治療慢性萎縮性胃炎潛在作用靶點通路富集分析利用DAVID在線分析平臺,45個靶點中共有36個核心靶點富集到23條通路中,利用Cytoscape構建“潛在靶點-通路”網(wǎng)絡圖,如圖5所示,此網(wǎng)絡包括60個節(jié)點,195條邊,網(wǎng)絡拓撲分析后,發(fā)現(xiàn)最內(nèi)側(cè)圈AKT1、絲裂原激活蛋白激酶10(mitogen activation protein kinase,MAPK10)、MAPK9、MAPK8、TNF和JUN等靶點具有較高的度值,MLRP3可能通過TNF和MAPK等信號通路發(fā)揮著重要的作用。

圖5 “潛在靶點-通路”網(wǎng)絡圖

2.6 分子對接驗證基于網(wǎng)絡藥理學分析結果,TNF信號通路富集的基因數(shù)目較多,且度值較高的靶基因均有顯示,因此,NLRP3介導的TNF、AKT1、MAPK10、MAPK9、MAPK8、TNF和JUN等核心靶點群可能通過多種通路發(fā)揮治療慢性萎縮性胃炎的作用。通過與Protein Lounge 數(shù)據(jù)庫中的通路信息進行對比發(fā)現(xiàn),TNF可能通過JUN、MAPK8、AKT1、CASP3、NLRP3發(fā)揮作用。將活性成分度值較高的山柰酚和TNF、JUN、MAPK8、AKT1,CASP3、NLRP3進行分子對接。同時,將抗幽門螺桿菌常用藥物阿莫西林和上述靶點對接發(fā)現(xiàn),諸多靶點和中藥活性成分山柰酚、陽性藥阿莫西林均具有結合作用,其中MAPK8的結合作用相對較強。見圖6—圖7。

圖6 山柰酚、阿莫西林與TNF、JUN、MAPK8、AKT1、CASP3、NLRP3對接分值柱形圖

圖7 MAPK8 和山柰酚、阿莫西林分子對接示意圖

2.7 NLRP3介導的六君子湯治療慢性萎縮性胃炎及炎癌轉(zhuǎn)化的作用機制分析將腸上皮化生、胃黏膜上皮異型增生、胃癌相應靶點和NLRP3介導的六君子湯治療慢性萎縮性胃炎靶點相交,利用STRING平臺獲取各階段交集靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡圖并將結果可視化。如圖8所示,PPI網(wǎng)絡圖中可以看出,AKT1、TNF、JUN、CASP3等靶點均具有較高的度值,這也意味著治療慢性萎縮性胃炎的各靶點在治療腸上皮化生、異型增生、胃癌不同的病理過程中同樣發(fā)揮著重要的作用。

圖9 NLRP3介導的六君子湯治療慢性萎縮性胃炎及炎癌轉(zhuǎn)化的重要靶點機制

3 討論

CAG的發(fā)生與幽門螺桿菌感染、飲食、遺傳、藥物等因素相關[15],在多種因素作用下,胃黏膜發(fā)生損傷,進而導致黏膜萎縮、腸上皮化生等病理改變[16],其臨床主要表現(xiàn)為反復發(fā)作的非特異性消化不良,可將其歸屬于中醫(yī)學的“痞滿”“胃痛”“嘈雜”“吐酸”等范疇[17]。目前,CAG的治療以西醫(yī)對癥治療為主,缺乏特效藥物,難以從根本上逆轉(zhuǎn)其病理改變。研究表明,中醫(yī)藥不僅可改善CAG的臨床癥狀,在修復胃黏膜、延緩甚至逆轉(zhuǎn)CAG、抑制癌基因表達等方面也有顯著療效[18]。

中醫(yī)學認為,CAG病位在胃,與脾、腎密切相關,其發(fā)生發(fā)展與外邪侵襲、飲食不節(jié)、情志失調(diào)、脾胃素虛等因素有關[19]。在多種因素影響下,脾胃虛弱,納運失常,導致氣血生化無源,氣機升降失調(diào),最終引起氣滯、血瘀、痰濕等,進一步妨礙脾胃氣機。CAG臨床主要分為肝胃氣滯證、肝胃郁熱證、脾胃虛弱證、脾胃濕熱證、胃陰不足證、胃絡瘀血證等證型[20],但主要以脾胃虛弱證為基礎,故臨床多用益氣健脾之法。作為益氣健脾的中藥方劑六君子湯,以人參為君藥,具有補益元氣,健脾益肺功效;白術、法半夏為臣藥,具有健脾益氣、燥濕化痰之功;茯苓、陳皮為佐藥,能健脾和胃、理氣健脾;甘草為使藥,具有甘溫益氣兼有調(diào)和諸藥的功效;諸藥合用,共奏健脾益氣和胃之效。

NLRP3炎性小體作為一種細胞質(zhì)多蛋白復合物,能夠?qū)Χ喾N刺激產(chǎn)生反應,引起白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18等炎癥因子的釋放[21]。然而,在中藥靶點數(shù)據(jù)庫中未有NLRP3的收錄。因此,本研究基于NLRP3炎性小體,從CTD、STRING和STITCH數(shù)據(jù)庫預測得到相關靶點270個。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫,對六君子湯中的成分進行篩選并對其靶點進行預測,然后與NLRP3相關靶點取交集,拓撲分析結果顯示山柰酚和柚皮素可能發(fā)揮著重要的治療作用。從成分歸屬來講,山柰酚和柚皮素歸屬于黃酮類化合物,均具有較好的抗炎作用[22-23]。

通過對NLRP3介導六君子湯治療慢性萎縮性胃炎相關靶點分析發(fā)現(xiàn),基于STRING平臺實驗數(shù)據(jù)來源獲取潛在靶點的蛋白間相互作用關系,網(wǎng)絡拓撲學分析顯示,JUN、PPARG、AKT1和TNF等靶點可能在疾病的治療中發(fā)揮著重要作用。KEGG通路富集分析結果表明,AKT1、MAPK10、MAPK9、MAPK8、TNF和JUN等為具有較高度值的靶點,可能通過TNF信號通路和MAPK等信號通路發(fā)揮著重要的治療作用。研究表明,中醫(yī)藥能夠通過抑制NLRP3的激活,調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路,抑制炎癥因子的聚集,發(fā)揮抗炎作用[24]。分子對接結果顯示,諸多靶點和活性成分山柰酚、陽性藥阿莫西林均具有結合作用,其中MAPK8的結合作用相對較強,表明中藥單體成分山柰酚可能通過核心靶點MAPK8發(fā)揮重要的治療作用。此外,通過炎癌轉(zhuǎn)化相關靶點的對比發(fā)現(xiàn),NLRP3介導六君子湯通過核心靶點群在腸上皮化生、異型增生、胃癌不同病理過程的治療中發(fā)揮著舉足輕重的作用。

幽門螺桿菌感染作為CAG的最常見的病因,隨著病情的遷延進展,可以引起腸化生、異型增生甚至胃癌。在分子機制中,TNF/TNFR系統(tǒng)包括可溶性和跨膜形式的TNF,在慢性炎癥的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用[25]。TNF主要由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生,能夠被細菌、炎癥和其他刺激活化,在解除對TNF表達調(diào)控的動物模型中進行的廣泛研究表明,TNF可能誘導炎癥病理過程,同時發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[26]。AKT1是三種密切相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2和AKT3)之一,稱為AKT激酶,能夠調(diào)節(jié)包括代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成在內(nèi)的許多生理和病理過程[27]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶能夠激活MAPK8/JNK1等MAPKs相關蛋白,參與細胞增殖、分化、遷移、轉(zhuǎn)化和程序性細胞死亡等過程[28]。炎性小體是應對多種不同的外源性和內(nèi)源性病原體信號的傳導平臺,NLRP3炎性小體是研究最廣泛的炎性體之一,可調(diào)節(jié)IL-1β和IL-18等多種促炎細胞因子的成熟,驅(qū)動炎癥相關級聯(lián)反應,參與多種慢性炎癥疾病[29]。因此推測,六君子湯可以根除幽門螺桿菌,進而可能阻斷疾病發(fā)展。基于NLRP3相關靶點預測,應用中藥化學和生物信息學相關理論,對六君子湯治療慢性萎縮性胃炎的活性成分進行篩選并預測相關靶點,通過KEGG通路富集分析得到,AKT1、MAPK10、MAPK9、MAPK8、TNF和JUN等靶點可能通過TNF和MAPK等信號通路發(fā)揮重要的作用。作為臨床常見病、多發(fā)病,慢性萎縮性胃炎常引起腸上皮化生、異型增生,并向胃癌發(fā)展,各病理階段潛在靶點均和六君子湯治療慢性萎縮性胃炎靶點在一定程度上重合,這也提示了六君子湯能夠在“炎癌轉(zhuǎn)化”的過程中發(fā)揮重要作用。因此,基于中醫(yī)“治未病”的理論,六君子湯能夠阻止慢性炎癥向癌癥的轉(zhuǎn)化,這也為重要靶點的研究提供了思路。