蒲金口服液對宮內感染/炎癥致早產腦損傷大鼠腦組織PSD-95、NMDAR-2B表達的影響*

汪輝,馬丙祥,黨偉利,張晰,周榮易

1.河南中醫藥大學第一附屬醫院,河南 鄭州 450000; 2.河南中醫藥大學兒科醫學院,河南 鄭州 450046

腦性癱瘓(cerebral palsy,CP)是以運動功能障礙為主的證候群,具有終身性、致殘性的特點,是我國兒童肢體殘疾的主要因素之一,可伴多種并發損害[1]。CP在世界范圍內的發病率約為2‰,我國流行病學調查結果顯示,CP兒童的發病率為2.46‰,男童患病率高于女童[2]。目前,我國尚有部分CP患兒不能得到早期發現和診治,從而延誤最佳干預治療時機,給兒童及其家庭帶來極大的痛苦和沉重的經濟負擔,也使社會承受沉重的負擔[3]。因此,防治CP的發生已經成為小兒神經康復治療的一項艱巨任務。

CP的病因有多樣性及復雜性的特點,我國兒童CP主要致病因素為胚胎期間及新生兒期腦損傷[4]。宮內感染/炎癥易引起新生兒早產出現腦損傷,甚至出現新生兒死亡,是新生兒重癥之一。即使存活的患兒,多數伴有持續性神經功能損害,如CP、智力低下、癲癇等致殘率很高的后遺癥[5]。谷氨酸(glutamate,Glu)存在于中樞神經系統大約1/3的突觸中,是神經突觸中重要的神經遞質[6],其介導的神經通路與宮內感染/炎癥所致腦損傷相關性很高,Glu過量產生時,可造成神經系統損傷,即興奮性毒性(excito-toxicity)。CP復雜的病理發展過程中,存在多種機制引起的一系列損傷級聯反應,都以興奮性毒性起始[7]。N-甲基-D-天門冬氨酸受體-2B(N-methyl-D-aspartate receptor-2B,NMDAR-2B)是Glu受體之一,激活后參與突觸的可塑性。突觸后致密物95(postsynaptie density-95,PSD-95)是位于突觸后膜上的致密體蛋白,NMDAR是PSD復合蛋白的重要組成部分,二者共同作用于突觸,對突觸可塑性意義重大。

馬丙祥教授創制了蒲金口服液(石菖蒲、郁金、丹參、紅花),在兒童腦損傷等疾病的臨床實踐應用中效果顯著。前期研究發現,蒲金口服液能減少缺氧缺血腦損傷新生大鼠腦組織中抗氧化自由基和一氧化氮合酶的水平,下調炎性細胞因子如白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平和髓鞘相關抑制因子(Nogo、OMgp)及其受體(NgR、P75NTR)的表達,促進神經的再生及功能修復,改善神經損傷的相關癥狀[8-11]。鑒于蒲金口服液在宮內感染/炎癥致早產腦損傷中的保護作用,本研究觀察蒲金口服液對腦損傷組織中PSD-95、NMDAR-2B表達的影響,以期闡明蒲金口服液作用于宮內感染/炎癥致早產腦損傷的干預機制,為早期應用活血化瘀、化痰開竅中藥治療早產兒腦損傷提供理論支持。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠54只,雄雌比例為12,由武漢云克隆動物有限公司提供,動物合格證號:SCXK(鄂)2018-0021,實驗在鄭州科興生物科技有限公司動物實驗室進行。整個動物實驗期間大鼠體質量控制在200～300 g,本實驗經河南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會審批通過(倫理編號:YFYDW2018014)。

1.2 主要藥物及試劑蒲金口服液由石菖蒲、郁金、丹參、紅花組成,由河南中醫藥大學一附院制劑研究室提供,生產批號:20190622,其中低劑量組生藥濃度為1.2 g·mL-1,高劑量組生藥濃度為2.4 g·mL-1。銀杏葉提取物(德國威瑪舒培博士藥廠,批號:7140315,配比濃度為3 g·L-1);脂多糖(美國Sigma公司,貨號:SMB00704-5MG);Lipofectamine TM 2000(美國Invitrogen公司,貨號:11668019);ECL化學發光試劑、蛋白質marker(美國Thermo Fisher Scientific公司,貨號:34076、26616);Acrylamide、Bis-acrylamide、Tris-base、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine,TEMED)(美國Sigma公司,貨號:A9099、A2792、TRIS-R0、11667289001、1.10732);吐溫-20(Tween-20)、1 mol·L-1Tris-HCl(pH=6.8)、1.5 mol·L-1Tris-HCI (pH=8.8)(北京索萊寶科技有限公司,貨號:T8220、T1020、T1010);PSD-95單克隆抗體、NMDAR-2B單克隆抗體(美國Santa Cruz公司,貨號:sc-32290、sc-365597);HRP標記山羊抗鼠IgG二抗(美國CST,貨號:96714)。

1.3 儀器SXP-1B型手術顯微鏡(上海醫用光學儀器公司);PLM-1350型偏光學顯微鏡(上海光學儀器五廠有限公司);BZF-50型電熱恒溫干燥箱(上海博迅醫療生物儀器股份有限公司);BCD-238E/X1型醫用冰箱(中國容聲公司);H1850R型臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司);DK-8D型水浴鍋(上海博迅醫療生物儀器股份有限公司);SK-L180-S型搖床(北京大龍興創實驗儀器股份公司);DYCZ-24DN型電泳系統、DYCZ-40D型電轉系統(北京六一生物科技有限公司);PT-3502C型多功能酶標儀(北京普天新橋技術有限公司);9700型Gene Amp PCR儀(美國Applied Biosystems公司);7500型實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 模型制備及分組將18只SPF級雄性大鼠與36只雌性大鼠以12比例于下午1700分組合籠共同飼養,每籠3只大鼠,次日上午0800將雌鼠與雄鼠分開飼養,棉棒用生理鹽水濕潤后取雌鼠陰道脫落細胞進行涂片觀察,以觀察到大量絲狀精子細胞為標準并記為孕第0天,受孕后孕鼠另外飼養。隨機將36只懷孕母鼠分為LPS組(n=30)和對照組(n=6)。參考李曉捷等[12]制作宮內感染動物模型方法,在母鼠孕期第16天及第17天,LPS組孕鼠腹腔注射350 μg·kg-1的LPS,對照組則注射相同劑量的生理鹽水,然后記錄孕鼠的分娩時間及新生仔鼠體質量,胎齡<22 d記為早產仔鼠。隨機選LPS組早產仔鼠和對照組仔鼠各10只,進行HE染色以觀察仔鼠腦組織病理學變化。將80只LPS組早產仔鼠按隨機數字表法分為4組,每組20只,分別為高劑量蒲金口服液組、低劑量蒲金口服液組、銀杏葉提取物組、模型組。隨機選對照組正常分娩仔鼠20只,設為空白組。每組大鼠各隨機選取10只,于仔鼠出生第0—7天進行早期藥物干預,其余10只于仔鼠出生第7—14天進行晚期藥物干預。

2.2 藥物干預及標本采集仔鼠的灌胃劑量根據蒲金口服液臨床用量進行折算,折算后低劑量蒲金口服液組仔鼠的給藥劑量為12.5 g·kg-1,高劑量蒲金口服液組仔鼠的灌胃劑量為25 g·kg-1[13]。銀杏葉提取物組仔鼠的灌胃劑量為3 mg·kg-1。模型組和空白組均給予同等劑量的生理鹽水。早期藥物干預組和晚期干預組均連續灌胃給藥7天,灌胃體積10 mL·kg-1,給藥后同等條件飼養至21日齡。仔鼠麻醉后斷頭取腦,剝離粗大血管,冷生理鹽水多次沖洗,耳間線前2 mm水平處取一側腦組織,于4 ℃體積分數4%多聚甲醛中固定72 h,切片備用,另一側置于凍存管中,放入液氮罐內快速凍存,然后轉移至-80 ℃冰箱中保存備用。

2.3 病理學觀察隨機選對照組和LPS組產后大鼠各4只,麻醉,切取子宮、胎盤,多聚甲醛固定,HE染色,光鏡下觀察以了解孕鼠宮內感染情況。同時隨機選LPS組和對照組仔鼠各10只,斷頭取腦后組織固定,HE染色,觀察新生仔鼠腦損傷狀況。

2.4 RT-PCR檢測PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA表達水平取20～40 mg組織加液氮研磨成粉末,加400 μL Buffer R-I,用注射器反復抽吸8～10次,轉入1.5 mL離心管中,加200 μL Buffer R-II,渦旋振蕩15～30 s,12 000×g離心5 min,取上清液至1.5 mL離心管中,每管加入250 μL異丙醇,混合均勻,并轉移到制備管中,將制備管置于 2 mL 離心管中,6 000×g離心1 min,棄去濾液,加入500 μL Buffer W1A,在低溫離心機中12 000×g離心1 min,加入700 μL Buffer W2,12 000×g離心1 min,離心兩次后,將制備管放入干凈的1.5 mL離心管中,在制備管膜中央加入30 μL Buffer TE,靜置1 min后,12 000×g離心1 min,洗脫得RNA。將提取的RNA反轉錄為cDNA。反應體系如下:2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL,正、反引物各1 μL,待測DNA樣本2 μL,加滅菌H2O補足至20 μL。qPCR反應條件:預變性:95 ℃反應30 s;循環反應:95 ℃反應20 s,60 ℃反應20 s,72 ℃反應30 s,共40個循環;溶解曲線:95 ℃反應20 s,60 ℃反應 50 s,95 ℃反應20 s。以GAPDH為內參,檢測大鼠PSD-95、NMDAR-2B的mRNA水平。以2-ΔΔCt表示實驗組和空白組靶基因表達之間的多重比率關系,并進行三次重復實驗。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 Western Blot檢測PSD-95、NMDAR-2B蛋白表達水平取腦組織按100 g·L-1的比例加入RIPA裂解液裂解30 min,離心取上清液即為蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量后,加入6×loading buffer,100 ℃變性10 min,配 SDS-PAGE膠,按照30 μg的量計算每個樣品的上樣體積進行上樣,電壓調至50 V進行電泳,待蛋白樣品進入分離層后,調整電壓為100 V繼續電泳直至蛋白樣品完全分離。根據待測蛋白分子量以及預染蛋白marker的指示,切下對應膠塊,裁取合適大小的濾紙及NC膜,取電轉夾按照“陽極-泡沫-濾紙-NC膜-膠塊-濾紙-泡沫-陰極”的順序鋪好加緊后放入電轉槽中,設定電流為300 mA,電轉2 h。將濕轉后的NC膜放在5%脫脂牛奶中,室溫搖床封閉2 h。加入一抗(稀釋比例11 000),4 ℃搖床孵育過夜。PBST清洗4次,每次5 min,加入二抗(稀釋比例110 000),室溫搖床孵育2 h。將NC膜從二抗中取出,室溫搖床PBST洗滌4次,每次5 min。加ECL發光液,于暗室曝光5 min后,顯影,定影,膠片保存掃描。使用Image Pro Plus 6.0軟件掃描蛋白質條帶并分析蛋白質相對表達量。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況比較30只LPS組雌鼠中1只意外受孕,2只死亡,1只足月分娩(剔除),8只雌鼠流產,其余18只雌鼠均提前分娩,共產仔鼠176只,其中112只存活,64只死亡。對照組6只雌鼠均足月產仔,共產仔鼠57只,全部存活。與對照組比較,LPS組孕鼠的活產仔鼠數量顯著降低(P<0.05),仔鼠出生時體質量顯著降低(P<0.05)。LPS組仔鼠出生時皮膚暗紅,部分出現暗紫色瘀斑或瘀點,主動活動少,對外界刺激反應弱,體質量較輕。見表2。

表2 各組孕鼠活產仔鼠情況比較

3.2 LPS對孕鼠子宮、胎盤和仔鼠腦組織的影響HE染色顯示:LPS組孕鼠子宮壁充血,胎盤呈老化狀態,絨毛間質纖維組織增生,毛細血管管腔變小,子宮和胎盤內可見炎性細胞浸潤。而對照組孕鼠子宮、胎盤則未出現上述病理學改變。對照組仔鼠神經細胞排列整齊均勻,呈現圓形或橢圓形細胞核,核仁清晰,染色質較均勻;LPS組仔鼠腦室旁白質結構稀疏,神經元排列紊亂,出現明顯的結構缺陷,少量細胞出現核固縮、溶解的現象。見圖1。

注:A:LPS組孕鼠子宮;B:對照組孕鼠子宮:C:LPS組孕鼠胎盤;D:對照組孕鼠胎盤;E:LPS組仔鼠腦組織;F:對照組仔鼠腦組織;A-D,HE染色(×200);E-F,HE染色(×400)。圖1 LPS對孕鼠子宮、胎盤和新生仔鼠腦組織的影響

3.3 各組大鼠PSD-95、NMDAR-2B蛋白表達水平比較不論在早期干預或晚期干預,與空白組比較,模型組PSD-95及NMDAR-2B蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量蒲金口服液組PSD-95、NMDAR-2B 蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05);與銀杏葉提取物組比較,高劑量蒲金口服液組PSD-95、NMDAR-2B 蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)。與同時期低劑量蒲金口服液組比較,高劑量蒲金口服液組PSD-95、NMDAR-2B 蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05);與晚期干預組比較,早期干預的低、高劑量蒲金口服液組和銀杏葉提取物組PSD-95、NMDAR-2B 蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)。以上結果表明,早期高劑量的蒲金口服液干預上調PSD-95及NMDAR-2B蛋白表達效果更顯著。見表3、圖2—圖3。

注:A1:早期干預高劑量蒲金口服液組;B1:早期干預低劑量蒲金口服液組;C1:早期干預銀杏葉提取物組;D1:早期干預模型組;E1:早期干預空白組。圖2 早期干預組仔鼠腦組織PSD-95、NMDAR-2B蛋白表達條帶圖

注:A2:晚期干預高劑量蒲金口服液組;B2:晚期干預低劑量蒲金口服液組;C2:晚期干預銀杏葉提取物組;D2:晚期干預模型組;E2:晚期干預空白組。圖3 晚期干預組仔鼠腦組織PSD-95、NMDAR-2B蛋白表達條帶圖

表3 蒲金口服液對大鼠腦組織PSD95、NMDAR-2B蛋白表達水平的影響

3.4 各組仔鼠腦組織PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA表達水平比較不論在早期干預或晚期干預,與空白組比較,模型組PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相對表達量顯著降低(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量蒲金口服液組PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相對表達量顯著升高(P<0.05);與銀杏葉提取物組比較,高劑量蒲金口服液組PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。與同時期低劑量蒲金口服液組比較,高劑量蒲金口服液組PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相對表達量顯著升高(P<0.05);與晚期干預組比較,早期干預的低、高劑量蒲金口服液組和銀杏葉提取物組PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。以上結果表明,早期高劑量的蒲金口服液干預上調PSD-95mRNA、NMDAR-2BmRNA表達效果更顯著。見表4。

表4 蒲金口服液對大鼠腦組織PSD95 mRNA、NMDAR-2B mRNA表達的影響

4 討論

中醫學認為,早產兒腦損傷的病位在腦,累及神志及四肢,且病況變化多樣,臨床治療應以醒腦開竅、調理氣血、疏通經絡為治療原則。早產兒腦損傷在中醫學中無專有病名,目前普遍認同依據臨床相關癥狀將其歸于傳統醫學“五遲”“五軟”“五硬”等范圍,從病因學理解為孕婦“難產”和小兒“不啼”等。在中醫古代相關文獻中,“胎弱”“胎怯”等病癥與腦損傷臨床表現相符合。

《小兒衛生總微論方》針對早產兒出生窒息、不啼的病因進行具體分析,并提出了相應的處理方法和一些切實可行的、有針對性的防治方案。對于早產兒腦損傷的中醫病因病機研究,目前尚無統一論斷,臨床多以相關癥狀反推病因病機,結合辨證,常見如先天不足,孕婦氣血虛弱,精衰氣弱,導致胎稟不良;胎婦嗜酒貪欲,亦或憤怒跌仆,胎形受損,導致胞損,筋骨不榮。父母暮年育之,或孕婦產多,成胎時元精澆漓,受胎則氣血難養,導致生而怯弱。后天不足如幼小養護失當,飲食失調,或疾病纏綿不斷,或受累于藥害,或跌仆外傷,臟腑功能失司,氣血損耗,百脈宗筋失于濡養而致病。

本研究中蒲金口服液由石菖蒲、郁金、丹參、紅花四味藥組成,具有化痰開竅、活血化瘀的功效。有研究發現,中藥制劑丹參注射液能改善缺氧缺血腦損傷大鼠腦神經及突觸結構的損害,提升突觸素(synapsin,SYN)表達,改善突觸超微結構[14-15]。現代研究證實,石菖蒲揮發油既能安神益智,又可開竅醒神,其有效成分具有顯著控制腦損傷大鼠腦皮質神經細胞凋亡的效果,其水提醇沉液可使AlCl3所致癡呆大鼠的學習記憶能力提升,減少通過迷宮的時間,促進海馬CA3區突觸后膜致密物質增厚[16-17];郁金性寒,味辛、苦,歸肝、心、肺經,其主要化學成分為揮發油和姜黃素,具有活血行氣、涼血解郁、利膽退黃等功效,其中姜黃素還具有降血脂、抗氧化、抗炎、保護腦缺血再灌注和抗動脈粥樣硬化等作用[18-20]。前期相關的實驗研究結果顯示,蒲金口服液能下調ROS產生、提升SOD活力、抗自由基,以實現擴腦膜血管、控制瘀血形成,有效改善腦損傷大鼠的缺氧缺血癥狀[8-11]。銀杏葉提取物是目前臨床應用最普遍的中藥制劑之一,功效為活血通絡化瘀,其主要成分為黃酮苷、銀杏內酯和白果內酯等,具有顯著的促神經突觸生長、控制神經細胞凋亡、清除自由基、促腦血管擴張、抑制腦缺血再灌注損傷、抗炎等效果[21]。有動物實驗表明,銀杏葉提取物治療新生缺血缺氧性腦損傷鼠有一定的療效,所以本研究應用銀杏葉提取物作為對照[22]。

宮內感染/炎癥后,誘導tPA依賴性膠質細胞的激活,釋放潛在的神經毒性物質和炎性因子,其中包括興奮性氨基酸谷氨酸,谷氨酸釋放增多,代謝減少,在突觸間大量堆積,谷氨酸受體調控異常,突觸后膜神經元過度興奮,神經細胞因滲透性腫脹、變性、壞死而數量減少,軸突、樹突發育不良,導致突觸生成受阻和功能性修飾障礙,最終導致腦損傷,甚至CP。CP、中風及腦缺氧等疾病與谷氨酸受體介導的神經通路密切相關,谷氨酸受體介導的神經通路參與眾多代謝活動,如神經元和神經膠質細胞的存活、發育、增殖及凋亡、突觸可塑性變化等[23-24]。谷氨酸受體是中樞神經系統中極為重要的興奮性神經遞質受體,谷氨酸受體分為離子型和代謝型,而在中樞神經系統中突觸前膜釋放的谷氨酸主要與突觸后膜的兩種離子型谷氨酸受體結合從而發揮作用,即NMDAR和AMPAR[25]。NMDAR在突觸后膜上常常與多種蛋白(黏附蛋白、骨架蛋白、銜接蛋白等等)共價結合形成復合物從而發揮其特定功能,所以當NMDAR與神經遞質結合后,信號蛋白受到刺激進而激活下游信號通路,進而完成了NMDAR對突觸可塑性的調節作用[26]。此外,突觸可塑性亦可反向調節NMDAR的活性,當受到外界特定刺激后,神經元內NMDAR及相關蛋白(如PSD-95、eNOS、CaMKIIa等)表達增加,從而實現了二者間的雙向調控。PSD-95主要通過兩個PDZ結構與NMDAR的C末端相結合,參與NMDAR在突觸上的富集、錨定以及胞內信號通路的激活,從而發揮其對突觸可塑性的調節作用。因此,PSD-95對谷氨酸受體的成熟、神經元的發育以及突觸可塑性的調節至關重要[27-32]。

本研究用RT-PCR、Western Blot法檢驗宮內感染/炎癥造成早產腦損傷大鼠腦組織PSD-95、NMDAR-2B的表達,探討蒲金口服液對宮內感染/炎癥致早產腦損傷大鼠的作用機制,結果顯示,與對照組比較,早產腦損傷大鼠腦組織內PSD-95、NMDAR-2B的mRNA和蛋白表達量下降,表明LPS感染引起的子代大鼠腦損傷與突觸后致密物質密切相關。經過蒲金口服液治療后,各組大鼠腦組織PSD-95、NMDAR-2B的mRNA、蛋白含量均提高,突觸后膜致密物增多,且可能激活相關信號通路,促進神經元的增殖,抑制腦損傷的細胞凋亡,保證突觸的結構完整性,有利于腦損傷細胞的恢復。早期高劑量蒲金口服液組的效果明顯高于銀杏葉提取物組與低劑量蒲金口服液組,表明早期高劑量蒲金口服液干預在促進神經細胞恢復方面作用顯著,其機制與促進PSD-95、NMDAR-2B的表達,改善突觸后膜致密物積聚與修復,調節突觸可塑性,保持突觸的結構完整性有關。

綜上,高劑量蒲金口服液可上調宮內感染/炎癥致早產腦損傷大鼠腦組織PSD-95及NMDAR-2B的表達,且早期干預效果更顯著。神經細胞的再生、修復與重組機制比較復雜,本研究選取觀察的時間點數量單一,無法完全明確宮內感染/炎癥所致早產腦損傷仔鼠腦組織中PSD-95、NMDAR-2B表達水平的趨勢。局限于突觸后致密物PSD-95和NMDAR-2B兩種靶因子,靶點單一,仍需進一步研究其他突觸后致密物質和相關信號通道的影響及作用機制。