線粒體相關內質網膜-細胞凋亡途徑在動脈粥樣硬化發病中的作用*

趙微,王帥

遼寧中醫藥大學附屬醫院,遼寧 沈陽 110031

線粒體相關內質網膜(mitochondria associated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)是內質網(endoplasmic reticulum,ER)與線粒體兩者之間的偶聯區域,構成其通訊的物理基礎,可以在不同的信號通路中進行生物分子快速交換。MAMs的不同蛋白質組學分析發現,MAMs中有上百個不同的蛋白質,這些蛋白質廣泛參與了多個細胞過程。MAMs通過物理連接的平臺效應和其獨特的脂質與蛋白質發揮作用,目前MAMs在脂質的合成與轉運、氧化應激、鈣穩態的維持、炎癥反應、細胞凋亡以及自噬等過程中的作用已經被逐步證實,而這種種因素,尤其是細胞凋亡都是誘發心血管疾病的高危因素[1]。MAMs上富集蛋白是心血管疾病治療的潛在新靶點,內質網-線粒體通訊中斷或缺失在各種心血管疾病,如HF、PAH和血管疾病的發病機制中至關重要。動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性多因素性血管疾病,是誘發冠心病、腦梗死、腦出血、外周血管病等多種心腦血管疾病的主要因素[2],因此AS的積極防治對降低心血管疾病的發生及惡化具有鮮明的現實意義。

1 MAMs與細胞凋亡

維持細胞內穩態涉及多個細胞器的參與,這些細胞器在時間和空間上相互關聯,在功能上相互配合或拮抗。研究表明細胞器之間,特別是ER和線粒體之間的信號轉導是影響細胞命運的一個不可忽視的因素。ER作為蛋白質折疊和修飾的細胞中心,可以通過調節蛋白質的數量和質量影響一系列生理過程。細胞的“能量工廠”——線粒體也參與了細胞凋亡,ER是細胞應激的傳感器,線粒體則是細胞應激反應的促動器,ER和線粒體之間進行的雙向交流能夠進一步影響細胞凋亡過程。最近的研究證實,凋亡信號可以在兩個細胞器之間穿梭,MAMs則在ER和線粒體之間的復雜串擾中起著至關重要的作用,并且介導細胞凋亡,進而影響細胞命運。在內質網合成、Ca2+穩態調節、ER線粒體功能協調以及ER和線粒體之間死亡信號轉導等方面都有MAMs的介導。MAMs中的死亡信號以多種形式參與,如Ca2+從ER轉移到線粒體,調節蛋白質-蛋白質相互作用,分子易位或控制脂質代謝。在應激條件下,ER作為傳感器會立即做出反應。同時,如果應激強度超過ER的適應性,會向線粒體傳遞凋亡信號,啟動凋亡事件。其傳導途徑如下:(1)ER向線粒體灌注Ca2+,線粒體中大量Ca2+作為死亡信號啟動細胞凋亡;(2)磷酸簇分選蛋白-2(phosphofurin acidic cluster sorting protein 2,PACS-2)由ER向線粒體易位,伴隨免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein,Bid)活化和易位,導致線粒體外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)通透性增加,促凋亡因子釋放;(3)神經酰胺的合成和積累引起OMM通透性增加,誘導細胞色素C(cytochrome C,CytC)或其他促凋亡物質在膜間空間釋放和應激信號從ER傳遞到線粒體;(4)線粒體分裂蛋白-1(mitochondrial fission protein,Fis-1)作為線粒體凋亡的下游分子可以通過裂解BAP31(B細胞受體相關蛋白)將凋亡信號傳回ER。凋亡信號的ER-線粒體-ER擴增環有助于協調兩個細胞器之間的凋亡事件[3]。見圖1。

圖1 細胞凋亡通路示意圖

1.1 MAMs與鈣穩態ER與線粒體之間的Ca2+轉運對線粒體穩態和能量的維持至關重要,但不受限制的Ca2+轉移可能導致線粒體Ca2+超載,線粒體損傷及細胞凋亡。ER是細胞內的一個精細的膜系統,通過廣泛的膜結構與其他細胞器產生結構與功能上的交互,參與細胞內Ca2+儲存與流動。內質網鈣平衡主要由位于內質網膜上的蛋白雷尼啶受體、1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R)和鈣泵維持。在生理狀態下,內質網腔中Ca2+的濃度高于細胞質中的Ca2+濃度,正常狀態下ER中的鈣離子呈游離狀態,RyR和IP3R兩種受體負責將游離的Ca2+由內質網腔轉移到細胞質內,然后又通過鈣泵將細胞質中的鈣離子攝取回到ER中[4],以此維持鈣平衡。在應激狀態下,ER不僅會直接釋放Ca2+進入細胞質,Ca2+也很有可能通過“IP3R1/GRP75/VDAC1鈣離子通道”流入線粒體。IP3R的亞基IP3R1是參與ER與線粒體之間鈣流動的復合蛋白IP3R1/GRP75/VDAC1的成員之一,也是ER-線粒體偶聯結構MAM的主要成分,在兩大鈣庫間維持鈣平衡。線粒體外膜電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channels,VADC)介導線粒體內外多種代謝物和離子的運動,并參與細胞凋亡、物質代謝和Ca2+的調節等一系列細胞過程[5]。葡萄糖調節蛋白75(glucose regulated protein 75,GRP75)連接IP3R1和VDAC構成“IP3R1/GRP75/VDAC1鈣離子通道”維持MAMs的結構。電子斷層掃描技術檢測到MAMs與線粒體膜相距僅10～25 nm,極近的距離為內質網中的鈣離子能夠迅速流向線粒體提供了便利。線粒體-Ca2+單向轉運蛋白(mitochondrial calcium uniporter,MCU)也集中在MAMs結構,調節內質網上鈣離子單向轉移至線粒體。IP3R1打開時鈣離子從ER釋放出,引起MAMs局部鈣離子濃度增高,同時鈣離子通過MCU進入線粒體。心肌細胞中糖原合成酶激酶-3β與IP3R1相互作用可以改變線粒體滲透性進而調控線粒體鈣離子穩態,線粒體通透性轉換孔的重要組成分子親環素D(cyclophilin,CypD)與VDAC/GRP75/IP3R1蛋白復合物相互作用,也可介導鈣離子從內質網流向線粒體[6]。線粒體攝取過量Ca2+會導致其功能紊亂,釋放細胞色素氧化酶等多種物質[7],誘導Bcl-2相關促凋亡蛋白的寡聚和激活,促進OMM的透化作用,各種促凋亡因子釋放,啟動細胞內源性凋亡通路[8]。

1.2 MAMs與氧化應激線粒體中過量的Ca2+可與心臟磷脂結合,促進呼吸鏈復合體II的解體,導致多個亞基的釋放,同時伴隨過量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的產生,啟動應激機制[9]。MAMs介導細胞內ROS引起的氧化損傷,來自內質網的過量的Ca2+會引起線粒體嵴產生大量活性氧,并且在MAMs處生產氧化還原納米域,產生內質網應激誘導的內源性細胞凋亡。Ca2+就像一把雙刃劍,既能促進新陳代謝,又能促使細胞凋亡。Ca2+通量決定了哪些細胞事件發生,從而也突出了MAMs結構對細胞的重要性。MAMs與氧化應激聯系另一方面表現在MAMs結構上的某些分子能直接促進ROS產生,氧化激活的蛋白激酶Cβ(protein kinase Cβ,PKCβ)誘導存在于線粒體基質、線粒體內外膜之間的磷酸化酪氨酸信號適配蛋白(66 kDa isoform of the growth factor adapter Shc,p66Shc)的36位絲氨酸磷酸化,使p66Shc轉移至MAMs 進而產生 ROS,促進多種心血管疾病的發展。MAMs可以通過Ero1和p66Shc直接產生ROS。Ero1包括Ero1-α和Ero1-β兩種亞型,其中75%的Ero1-a定位于MAMs上。Ero1是ER中控制氧化還原穩態的重要分子,其表達增高可引起ROS產生增多。生物或細胞應激狀態下產生的氧化應激會破壞其DNA和蛋白質,產生氧化應激損傷。面對干擾機體亦會激活其特殊的防御機制來對抗ROS水平的升高,以保護其免受氧化損傷。在氧化損傷以及一些實體腫瘤和髓系白血病細胞中存在一種抗氧化、抗炎、抗凋亡和促進血管生成的微粒體應激蛋白血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1),在應激狀態下被誘導激活,以截斷和酶活性不活躍的形式遷移到細胞核[10]。核因子紅系2相關因子(nuclear factor erythroid 2 related factor,Nrf2)是一種轉錄因子,也是許多抗氧化劑和抗凋亡蛋白(包括HO-1)的主要調節因子,也會隨著氧化損傷和各種類型的癌癥在細胞核中積累。在氧化應激中,核HO-1與Nrf2兩者協同作用,通過糖原合成酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)介導的磷酸化和泛素蛋白酶體降解穩定拮抗氧化應激,延緩其在細胞核中的積累,降低氧化應激損傷以保護血管[11]。

1.3 MAMs與分子易位外源性凋亡途徑主要通過細胞膜上的死亡受體與其配體結合的方式來傳遞凋亡信號,從而介導細胞凋亡。當細胞受到刺激時,會啟動相關細胞凋亡機制,同時相關胱天蛋白酶(Caspase)被激活來執行細胞凋亡[12]。活性Caspase-8 可以直接激活 Caspase-3/6/7 以執行細胞凋亡,也可以通過裂解Bid,同時伴隨Bid向線粒體易位,激活內源性細胞凋亡途徑,誘導細胞凋亡。PACS-2是位于內質網膜上的一種分選蛋白,參與ER的穩態調節、脂質合成以及MAMs的結構連接,在線粒體、內質網和溶酶體穩態中發揮重要作用。PACS-2也介導凋亡信號從ER轉導到線粒體的過程,高水平的ER可導致全長Bid結合的 PACS-2從ER轉位到線粒體,然后Bid被caspase-8在線粒體表面切割,截短的Bid易位到線粒體后引起大量促凋亡蛋白的聚集,激活線粒體凋亡途徑,同時促進OMM通透性增加和細胞色素C釋放,進一步引發不可逆的細胞凋亡。

1.4 MAMs與脂質代謝MAMs上存在脂質代謝的相關蛋白,其主要功能是參與脂質從ER到線粒體的轉運,在脂質代謝中起核心作用。MAMs中合成了多種脂類,目前已知有幾種脂質代謝物可以影響細胞的命運,其中神經酰胺是最典型的[13]。正常情況下,神經酰胺是通過神經酰胺合成酶途徑合成的。然而在應激條件下(如熱休克、化療、毒素、輻射等因素),神經鞘磷脂酶中的鞘磷脂可以快速合成神經酰胺[14]。神經酰胺的積累不僅可以(直接或間接)調控多種參與凋亡信號轉導的分子,還可以導致OMM形成孔道,誘導細胞色素C等促凋亡因子釋放,影響細胞凋亡。

2 細胞凋亡與AS

機體過多或過少的細胞凋亡能夠影響多種疾病的進展[15]。病理狀態下,血管內皮細胞(vascular endothelial cell,VEC)、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)和巨噬細胞凋亡被認為是AS疾病啟動和發展的關鍵參與者[16]。研究表明AS斑塊破裂或侵蝕是心血管疾病患者猝然發病和死亡的主要原因,造成多種急性心血管事件發生[17]。

2.1 血管內皮細胞凋亡與AS作為血管抵御外界侵襲的第一道防線,血管內皮細胞緊密排列在機體整個循環系統中,通過抗炎、抗血小板聚集、抗凝和調節血管生成等方式來保護和維持血管功能[18]。VEC大量過度凋亡會直接破壞血管內壁完整性,釋放出大量血管內細胞黏附分子,單核細胞與之結合進入內膜形成巨噬細胞,最終結合相關蛋白轉化為泡沫細胞——斑塊形成的標志物。

2.2 血管平滑肌細胞凋亡與ASAS 病變晚期VSMC過度凋亡會導致纖維帽不斷變小和變薄,增加斑塊不穩定性和血栓形成,且大量凋亡細胞會聚集在血管壁上引起炎癥反應加速AS疾病惡化[19]。因此采用抗VSMC細胞凋亡的措施在AS治療方面具有重要臨床意義。

2.3 巨噬細胞凋亡與AS在病理狀態下,巨噬細胞凋亡一定程度上可扮演組織修復的角色,也能夠促進疾病惡化,而且在疾病的不同階段特性不一,作用復雜多元[20]。在AS發生早期,巨噬細胞凋亡可抑制疾病發展,有利于AS治療。在晚期AS中,由于機體清除壞死物質和組織修復能力減弱,巨噬細胞凋亡會導致壞死碎片聚集,促進動脈粥樣硬化斑塊形成[21]。

3 MAMs-細胞凋亡通路與AS的相互作用

關于MAMs-細胞凋亡通路的形成對于AS病理改變的作用有著多方面多角度的探討,一方面MAMs可通過促進線粒體自噬進而抑制 VSMC凋亡,抑制動脈粥樣硬化斑塊破裂[22]。也有研究認為血管內皮細胞上的MAMs促進ER中的鈣離子過量轉移至線粒體,影響鈣平衡,導致內皮細胞凋亡,加劇動脈粥樣硬化斑塊的形成和不穩定性。而形成斑塊的巨噬細胞和T細胞中MAMs的增多能夠促進炎癥因子的不斷釋放,引起動脈粥樣硬化[23]。在內源性凋亡通路中,AS中氧化型低密度脂蛋白 (human oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)可降低抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白的比例,抗凋亡蛋白減少從而更容易誘發細胞凋亡;在外源性細胞凋亡通路中,AS中巨噬細胞ox-LDL激活細胞膜表面的死亡受體介導細胞凋亡[24];內質網應激凋亡通路是目前新研究的凋亡通路,尚未有完整明確的機制,但內質網應激已經被證實與多種心血管疾病動物模型相關[25],如缺血性心肌病、心肌肥厚及心力衰竭等[26]。在相關臨床疾病模型的研究中,細胞發生內質網應激還會激活其相關炎癥因子[27]和自噬等機制參與疾病的發展。相關研究表明,AS中巨噬細胞凋亡的過程中伴隨有鈣轉移的發生,促進凋亡通路的啟動。內質網應激通路中也存在跨膜鈣梯差的變化[28]。顯然二者均存在細胞內鈣離子的濃度改變,間接表明內質網應激通路可以通過改變細胞內鈣平衡參與影響細胞凋亡,進而作用于AS疾病。因此MAMs-細胞凋亡通路可能為治療AS疾病提供新的角度與方向。

4 中醫理論與MAMs-細胞凋亡通路的相關性

從中醫角度而言,根據AS導致的心腦血管疾病的臨床表現與疾病特點,其中醫病機多為本虛標實,臨床上從痰、瘀、毒、虛論述AS。治療AS當活血化瘀、清熱利濕等,通過多種藥物配伍,達到多成分、多靶點、多途徑的綜合調節作用[29]。治療AS疾病的代表性中藥多為補益類中藥,如人參、黃芪;祛瘀類中藥,如三七;清熱解毒類中藥,如黃連等。細胞凋亡的發生與炎癥、氧化應激等密切相關,抑制細胞凋亡與中醫運用活血祛瘀、解毒除濕之理法方藥有異曲同工之效。相關研究證實中醫藥某些活性成分作用于相關因子抑制細胞壞死性凋亡能夠增強AS防治效果[30]。

5 中醫藥干預細胞凋亡通路治療AS

中藥因其特有的藥理活性發揮獨特作用。隨著科技發展對中醫藥探究逐漸深入,中醫藥治療AS疾病已在臨床上得到廣泛應用,而中醫藥介導調控細胞凋亡影響AS疾病成為目前研究熱點之一[31]。因此,探究中醫藥干預MAMs-細胞凋亡通路的具體作用機制,對防治AS具有重要意義。相關研究證實某些中藥特有成分及中藥方劑能夠基于MAMs-細胞凋亡通路發揮其藥效,在AS疾病進展中起到治療作用[32]。相關文獻表明含有黃酮類、生物堿類、多酚類等成分的中藥能夠通過抑制氧化應激,介導細胞自噬,延緩細胞凋亡來控制AS病程;含有三萜類、皂苷類以及多酚類等成分的中藥能夠抑制細胞焦亡及鐵死亡相關通路,進而減緩斑塊形成和促進斑塊穩定性。

6 討論

目前對于心血管疾病的分子機制研究是多角度、多維度的,一方面包括干預各種炎癥通路、自噬機制、免疫機制、血管生成機制、基因轉錄調控等分子生物學及免疫學;另一方面則是研究細胞的顯微結構層面——細胞器的功能以及細胞器間的交互作用。近年來逐漸認識到ER-線粒體偶聯結構——MAMs參與了各種疾病發生發展。盡管MAM在20世紀60年代就已經被電子顯微鏡觀察到,但是其在心血管系統中的作用是近20年才開始認識到。心血管疾病由多種危險因素和病理機制引起[33]。在細胞水平上,各種畸變包括代謝異常、能量缺乏、自噬缺陷、內質網應激、ROS產生和細胞凋亡激活,都可能導致心血管疾病發生[34]。不可否認MAMs與這些細胞過程之間關系密切,與細胞生存命運相關,是全身各系統疾病包括心血管疾病治療的靶點,也是動脈粥樣硬化防治的新方向。