黃連-肉桂配比對慢性心力衰竭大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響

何 霞,卿媛媛,常嘉昱,鐘思凡,朱筱婧,張 婷,莊 紅,顏 旭

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,湖南 長沙 410208;2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410006)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)是心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致射血功能下降,無法將靜脈回流的血液排出心臟,動脈血液供應(yīng)不足的疾病[1]。CHF是以呼吸困難、機(jī)體活動受限、液體滯留為特征的臨床綜合征[2]。下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分,參與調(diào)控機(jī)體應(yīng)激及全身多個(gè)系統(tǒng)[3-4]。HPA軸失?？梢鸾箲]、抑郁、失眠、阿爾茨海默病、腸應(yīng)激綜合征等[5-8]。心衰患者體內(nèi)HPA軸呈慢性持續(xù)性激活狀態(tài),隨著病情進(jìn)展,體內(nèi)腎上腺皮質(zhì)酮(Corticosterone,CORT)的峰值升高,其分泌主要由垂體產(chǎn)生的促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)調(diào)節(jié),而促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin-releasing hormone,CRH)能夠增加ACTH分泌。胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)是CHF發(fā)病機(jī)制之一,當(dāng) IR 合并心力衰竭時(shí),心肌葡萄糖代謝減少,心功能受損,因此改善IR與心功能并舉至關(guān)重要[9]。當(dāng)IR時(shí)氧化依賴葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Glucose transporter 4,GLUT4)表達(dá)量下降,引起心肌能量代謝異常,導(dǎo)致心衰發(fā)生[10-11]。交泰丸由黃連、肉桂按質(zhì)量比10∶1組成的經(jīng)典方藥。以往研究顯示,黃連-肉桂配伍可調(diào)控、改善IR,本課題組以黃連-肉桂為基礎(chǔ)組方的強(qiáng)心安神方經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察可調(diào)控多種通路,改善心衰[12-15]。本次研究通過檢測HPA 軸的激素水平及心肌 GLUT4 蛋白表達(dá),觀察黃連-肉桂不同配比對CHF大鼠作用,闡明其改善心衰大鼠心功能的作用機(jī)制,為治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物:SD 健康雄性大鼠60只,清潔SPF 級,體重 200～280 g,于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司采購[批號SCXK(湘) 2019-0004],實(shí)驗(yàn)許可證號[SYXK(贛)2020-0001]。

1.1.2 主要藥物與試劑:中藥飲片黃連、肉桂均購于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院。鹽酸阿霉素注射液(批號S17092);大鼠NT-proBNP、CORT、CRH、ACTH試劑盒(批號MM-0329R1、MM-0559R1、MM-0520R1、MM-0565R1);GADPH內(nèi)參一抗(批號HC201);GLUT4一抗(批號AF5386);RIPA細(xì)胞裂解液(批號C1053);BCA蛋白定量試劑盒(批號E-BC-K318-M);十二烷基硫酸鈉(批號151-21-3);甘氨酸(批號G8200)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:移液槍(型號5-50μl)、全自動酶標(biāo)儀(型號WD-2012B)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號DHP-9082B)、高速冷凍離心機(jī)(型號TGL-16.5M)、組織脫水機(jī)(型號KD-TS3S1)、包埋機(jī)(型號HistoCore Arcadia)、切片機(jī)(型號HistoCore BIOCUT)、蛋白垂直電泳儀(型號DYY-6C)、超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號Chemi Doc TMXRS+)、全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(型號Tanon-5200)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組、造模與模型鑒定:在SD雄性大鼠60只中,隨機(jī)取6只作為空白組,余54只造模處理。造模期間大鼠死亡14只,且4只精神欠佳亦舍去,剩余36只大鼠在灌胃期間死亡12只。最終各組均6只分成模型組、黃連組(黃連15 g、肉桂1.5 g)、肉桂組(黃連1.5 g、肉桂15 g)、黃連-肉桂組(黃連、肉桂各6 g)。除正常組6只大鼠外,其余組均腹腔注射1 mg/ml鹽酸阿霉素溶液,按1.25 mg/kg劑量腹腔注射,正常組注射等量0.9%氯化鈉溶液,每周2次,總共注射7次,總量8.75 mg/kg。觀察大鼠精神狀態(tài)、活動情況、飲食、體重、呼吸頻率等日常生活習(xí)慣情況,采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測大鼠血清N端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP),應(yīng)用心臟彩超檢測心功能,通過上述方法判斷慢性心力衰竭大鼠造模情況。

1.2.2 干預(yù)方法與取材:按照上述分組進(jìn)行藥物處理,按比例配伍飲片。將29.7 mg/kg的飲片煎熬濃縮成等體積容量灌胃,空白組、模型組予同體積滅菌蒸餾水灌胃,各組灌胃1次/d,持續(xù)4周。于末次給藥第2日早上取材,水合氯醛麻醉,后腹主動脈采血5 ml以上,離心,取上清,放冰箱備用;剪開肋骨,暴露胸腔,剪斷血管,剝離心臟,用0.9%氯化鈉溶液洗去殘留血液,分離心尖、左心室。ELISA法檢測血清ACTH、CORT、CRH水平;Western blotting法檢測心肌GLUT4蛋白。

1.2.3 心臟彩超檢測大鼠心功能:大鼠麻醉后應(yīng)用小動物超聲系統(tǒng)檢測左室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室軸縮短率(Left ventricular fraction shortening,LVFS)。

1.2.4 HE染色檢測心肌組織形態(tài):大鼠腹主動脈取血后迅速解剖心臟組織,洗去殘留血液,切取心尖組織,放置于4%多聚甲醛固定48 h,石蠟包埋,切片、烤片,蘇木素水溶液染色5 min,流水沖洗15 min,梯度乙醇各脫水10 min;伊紅染色1～2 min,乙醇脫水,將玻片置于二甲苯中透明2次,3 min/次,中性樹膠封片,放入65 ℃烘箱15 min,光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.2.5 ELISA 法檢測大鼠血清NT-proBNP、ACTH、CORT、CRH水平:大鼠麻醉后腹主動脈采血5 ml,3000 r/min離心,15 min后,保留上清液,運(yùn)用 ELISA 法測定各組蛋白含量,嚴(yán)格按說明書操作。

1.2.6 Western blotting法檢測大鼠心肌組織GLUT4蛋白表達(dá):取大鼠心肌組織,提取總蛋白,凝膠電泳分離蛋白后使用BCA法測定蛋白濃度,半干式轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,封閉后加一抗稀釋液,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,5 min/次;二抗稀釋,室溫孵育,TBST洗膜3次,5 min/次,配制ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色檢測,Image J軟件讀取灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 造模后各組大鼠狀態(tài)比較 空白組大鼠精神狀態(tài)良好,體重處于正常范圍,正?；顒?呼吸脈搏次數(shù)無明顯變化,進(jìn)食正常,二便正常。模型組、肉桂組和黃連-肉桂組大鼠精神狀態(tài)差,存在腹水,毛色干枯變黃,活動明顯減少,呼吸脈搏頻率增快,二便減少。黃連組大鼠精神一般,不喜活動,身體蜷縮,進(jìn)食較少,二便稍減。

2.2 各組大鼠LVEF、LVFS、NT-proBNP水平比較 見表1。與空白組比較,模型組、黃連組、肉桂組、黃連-肉桂組的LVEF、LVFS 均低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。藥物干預(yù)后,黃連-肉桂組NT-proBNP 值低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠LVEF、LVFS、NT-proBNP蛋白比較

2.3 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)比較 見圖1?？瞻捉M心肌細(xì)胞形態(tài)排列致密,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,無明顯炎性浸潤現(xiàn)象。模型組心肌組織結(jié)構(gòu)重度異常,心肌細(xì)胞廣泛排列紊亂,細(xì)胞輪廓不清晰,間隙增大,可見部分細(xì)胞空泡變性,如黑色箭頭所示。黃連-肉桂組、肉桂組心肌組織結(jié)構(gòu)中度異常,部分區(qū)域心肌細(xì)胞排列紊亂,間隙增大,細(xì)胞輪廓不清晰,可見空泡變性,如紅色箭頭所示;間質(zhì)可見少量纖維組織增生,如黃色箭頭所示;炎癥細(xì)胞浸潤,如黑色箭頭所示。黃連組心肌組織結(jié)構(gòu)基本正常,細(xì)胞排列較為緊密,偶見細(xì)胞水腫,胞漿疏松空泡化,如黑色箭頭所示;組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤。

圖1 各組大鼠心肌病理形態(tài)比較(HE染色,×400)

2.4 各組大鼠CRH、ACTH、CORT蛋白表達(dá)比較 見表2。給藥結(jié)束后,模型組心衰大鼠 CRH、ACTH、CORT表達(dá)均高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。黃連組、肉桂組、黃連-肉桂組大鼠ACTH、CORT表達(dá)均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠CRH、ACTH、CORT蛋白表達(dá)比較(ng/ml)

2.5 各組大鼠心肌組織中GLUT4蛋白表達(dá)比較 見表3(圖2)。給藥結(jié)束后,模型組心衰大鼠 GLUT4蛋白表達(dá)低于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。黃連組、肉桂組、黃連-肉桂組大鼠GLUT4蛋白表達(dá)均高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 各組大鼠心肌組織GLUT4蛋白表達(dá)電泳圖

表3 各組大鼠心肌組織中GLUT4蛋白表達(dá)比較

3 討 論

中醫(yī)學(xué)對“心衰”的最早描述是西晉醫(yī)家王叔和的《脈經(jīng)》:“心衰則伏,肝微則沉,故令脈伏而沉”[16]。歷代醫(yī)家根據(jù)心衰癥狀診斷為“心水”“痰飲”“喘證”“水腫”等[17]。中醫(yī)藥可緩解心衰癥狀、改善心功能、預(yù)后。本課題組在多年臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn),心衰病位在心、腎,心主血,腎主水,心火推動血脈運(yùn)行,腎主全身水液代謝,心衰時(shí)心火亢盛,邪氣亢進(jìn),腎水難以制約心火,心腎水火失調(diào),故從心腎水火相關(guān)性論治心衰?！俄n氏醫(yī)通》中記載:“黃連為君,佐官桂少許,煎百沸,入蜜,空心服,能使心腎交于頃刻”是黃連-肉桂最經(jīng)典配伍的出處,此配比為交泰丸,是“交通心腎”“水火共濟(jì)”治法的代表方。本課題組前期臨床研究證實(shí),以黃連、肉桂為基礎(chǔ)的“強(qiáng)心安神方”可改善心衰癥狀,調(diào)控多條通路,改善阿霉素致心衰大鼠的心功能[13-15]。

慢性心力衰竭的病理機(jī)制錯綜復(fù)雜,主要涉及氧化應(yīng)激、心室重構(gòu)、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞因子系統(tǒng)的過度激活等[18]。研究表明,HPA軸與心力衰竭密切相關(guān),心衰患者HPA軸處于慢性持續(xù)性激活狀態(tài),隨著病情進(jìn)展,體中CORT峰值進(jìn)一步升高,CORT可調(diào)動血管及心臟的鹽皮質(zhì)激素受體(Mineralocorticoid receptor,MR),參與其病理過程,加重心衰程度[19]。HPA軸調(diào)節(jié)異常時(shí)皮質(zhì)醇分泌增多,抑制HPA軸反饋能力降低,皮質(zhì)醇進(jìn)一步上升,中樞信號紊亂,導(dǎo)致高血壓的發(fā)生[20]。HPA軸對人體調(diào)控與腎對人體調(diào)節(jié)作用一致,腎上腺皮質(zhì)激素的生理功能相當(dāng)于中醫(yī)腎氣或腎陽的功能。曹利華等[21]提出“腎通于腦”的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)可能與HPA軸調(diào)控機(jī)制相關(guān)。中醫(yī)“腎主水”理論認(rèn)為,腎調(diào)控全身水液的輸送、代謝,且應(yīng)四時(shí)而調(diào)節(jié),春夏季以蒸騰氣化為核心,秋冬季以收藏為主,這與HPA 軸可能是腎陽發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)有異曲同工之妙。腎為相火,與心交濟(jì),互為交感互藏。腎為相火,與心交濟(jì),互為交感互藏。心陽溫煦為火主升,以降為順,居上而屬陽;腎主水藏精歸水,主靜,以升為和居下而屬陰。一陰一陽之間,腎水滋潤心陰而心火不亢,心火溫煦腎陰使腎水不寒。本研究中,黃連性苦寒,可上清亢盛之心火,使心火下交腎水;肉桂辛甘大熱,可助陽補(bǔ)火,引火歸元,腎陰可上濟(jì)心陽;二者合用則有瀉南補(bǔ)北、交通心腎之功,使心腎水火陰陽相調(diào)。本研究中黃連、肉桂按不同比例配伍,探求藥物配比對慢性心力衰竭大鼠的作用。與空白組比較,模型組大鼠ACTH、CORT、CRH含量上升,經(jīng)過黃連、肉桂不同比例干預(yù)后ACTH、CORT含量下降,說明在心衰大鼠體內(nèi)HPA軸處于激活狀態(tài),且黃連、肉桂配伍可抑制HPA軸應(yīng)激,且以黃連組效果最佳,而對CRH調(diào)控?zé)o影響,考慮可能是黃連、肉桂組方只調(diào)控HPA軸下游,或是CORT負(fù)反饋調(diào)控HPA軸,使CRH上調(diào)。上述研究說明,交泰丸通過干預(yù)下丘腦-垂體-腎上腺軸治療慢性心力衰竭,且黃連、肉桂抑制ACTH、CORT分泌,改善慢性心力衰竭大鼠心功能。

心肌葡萄糖的攝取和氧化依賴GLUT-4蛋白,出現(xiàn)IR時(shí),激活胰島素的蛋白通路受阻,GLUT4蛋白表達(dá)或易位減少,導(dǎo)致心肌攝取葡萄糖減少,引起心肌能量代謝異常,心功能受損,心衰發(fā)生[22]。IR會削弱心肌代償力,激活交感神經(jīng)系統(tǒng),影響斑塊穩(wěn)定性,破壞凝血、纖溶系統(tǒng)平衡,鈣信號通路異常等導(dǎo)致HF發(fā)生發(fā)展。因此,GLUT4蛋白表達(dá)可反映心肌胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。本實(shí)驗(yàn)中,模型組大鼠 GLUT4蛋白表達(dá)下降,說明心衰時(shí)存在胰島素抵抗;黃連、肉桂配伍干預(yù)后,大鼠GLUT4蛋白表達(dá)上升,說明其可上調(diào)GLUT4 蛋白表達(dá),改善胰島素抵抗,且比黃連組更有效。由此可見,心力衰竭與HPA軸功能調(diào)節(jié)失衡密切相關(guān),黃連、肉桂配伍從整體上調(diào)控HPA軸功能,抑制胰島素抵抗,改善大鼠慢性心力衰竭。

綜上所述,黃連、肉桂配伍可改善心衰大鼠癥狀,降低大鼠血清NT-proBNP水平,保護(hù)心功能,調(diào)控HPA軸,改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。