六種商品化血促性素的活性成分含量檢測和生物學活性分析

張 洪 宋星星 韓一嘯 汪 澎 潘華柱 張佳妮 李 珣*

（1 吉力生物科技有限公司，浙江寧波 315000；2 廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530004）

隨著我國畜牧業養殖規模的擴大和飼養技術的日益提升，血促性素的需求量也逐步遞增。血促性素是動物繁殖激素的重點產品，比較不同的商品化血促性素的活性，有利于推進行業激素產品高質量發展，提高母畜受胎率，促進養殖場集約化經營，提升畜牧業養殖的生產效益。血促性素的主要成分是孕馬血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin,PMSG），也稱為馬屬動物絨毛膜促性腺激素[1]。PMSG 是一種在懷孕母馬血清中發現的糖蛋白激素，主要由雌性馬屬動物的子宮內膜杯狀細胞分泌[2]。從健康孕馬的血清或血漿中提取的血促性素具有調控動物繁殖力的作用，主要應用于奶牛、綿羊、豬等動物[3,4]。神英超等[4]、羅昊澍等[5]研究發現，PMSG 具有促卵泡素和促黃體素活性。此外，PMSG 已被證明可以用于誘導發情[6]、治療不孕、增強動物生育能力[7-9]、促進卵泡發育或胚胎移植時的超數排卵[10,11]、誘導多胎[12]、治療母畜卵巢機能疾病和提高公畜繁殖性能等[1,13]方面。通過使用血促性素可以使養殖場中動物的發情率有效提高，從而盡可能地實現母畜同期發情，便于集約化養殖場的生產管理和衛生防疫[14]。目前市場上注射用血促性素的產品有很多種，不同廠家生產的血促性素的效果也有所不同。本試驗選取了市場上常見的6 種注射用血促性素產品進行活性成分含量檢測和分析，并依據前人報道[15-18]，測定它們對大鼠發情、卵巢增重和卵泡發育的影響，以評價不同注射用血促性素產品的效果，篩選出高效的血促性素產品，為今后養殖場主的選擇用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、HE 染色試劑均購自中國索萊寶公司；PMSG ELISA試劑盒購自德國DRG 公司；考馬斯亮藍染液購自中國碧云天生物科技有限公司。注射用血促性素產品均為粉劑針，1 000 單位，批號分別是A 組（B2205271）、B組（B220703）、C 組（20210101）、D 組（20220728）、E 組（210504）和F 組（20221027）。

1.2 試驗動物

84 只6 周齡雌性SD 大鼠（202±5）g 購自廣西醫科大學試驗動物中心。雌性SD 大鼠適應性飼喂1 周后，隨機分為對照組和6 組試驗組，即對照組（生理鹽水）、A 組 （B2205271）、B 組 （B220703）、C 組（20210101）、D 組（20220728）、E 組（210504）和F組（20221027），每組12 只，試驗組分別單次皮下注射0.1 mL 對應的血促性素10 IU，對照組相同時間皮下注射0.1 mL 生理鹽水，隨后進行試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 血促性素蛋白濃度的測定

本試驗依據BCA 蛋白定量試劑盒說明書進行。將標準品和血促性素分別用PBS 梯度稀釋，記為待檢樣品，將BCA 試劑和Cu 試劑按50∶1 的比例配制成BCA 工作液，將待檢樣品和工作液依次加入96 孔板，37℃孵育后，在562 nm 處測定各孔吸光值，繪制標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度。

1.3.2 血促性素PMSG 含量測定

將蛋白上樣緩沖液與PBS 溶解后的血促性素按照1∶4 的比例配制為待檢樣品，取20 μL 待檢樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳，待Marker 到達膠塊底部，電泳完成。將SDS-PAGE 凝膠放入考馬斯亮藍染液進行染色，過夜脫色后，拍照分析，初步判斷PMSG 含量。

根據PMSG ELISA 試劑盒說明書，將樣品用蒸餾水溶解后用零標準品按1∶100 的比例稀釋，加入微孔中，室溫下孵育1 h。隨后依次進行酶聯物、底物液和終止液的孵育，終止反應后在450±10 nm 處讀取OD 值，繪制標準曲線，計算樣品中的PMSG 含量。

1.3.3 血促性素的生物活性檢測

（1）誘導發情。注射血促性素后每天2 次制作大鼠陰道涂片，每組6 只，連續2 周，對涂片進行HE 染色，在顯微鏡下觀察細胞形態及含量，記錄并分析各組大鼠發情情況。

（2）卵巢增重和卵泡發育。注射血促性素后第72 h對大鼠進行剖檢，每組6 只，摘除卵巢，稱重，計算卵巢指數，卵巢指數＝卵巢重量÷體重。將卵巢用福爾馬林固定，自動脫水機脫水、透明和浸蠟，石蠟包埋后，制成4 μm 連續切片。HE 染色后，隨機觀察不連續的3張切片，選取5 個不相鄰的視野，記錄單側卵巢中的成熟卵泡數、生長卵泡數（即初級卵泡和次級卵泡的數目），計算成熟卵泡率。成熟卵泡率＝成熟卵泡數÷（成熟卵泡數+生長卵泡數）。

1.4 數據分析

試驗相關數據用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析，數據結果以“平均值±標準差（Mean±SD）”表示，P＜0.05 表示數據具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 血促性素的濃度檢測

根據BCA 蛋白定量試劑盒檢測結果繪制標準曲線（圖1A），在0～0.5 mg/mL 范圍內，得到線性回歸方程y=0.7918x+0.0816，R2為0.9962，大于0.98，表明BCA 法的線性相關性符合標準。

圖1 BCA 法檢測不同血促性素的蛋白濃度

根據線性回歸方程計算得出不同血促性素的蛋白濃度，繪制柱狀圖（圖1B）。蛋白濃度由高到低依次為F組、C 組、E 組、A 組、B 組、D 組，其中A 組和B 組沒有顯著差異（P＞0.05），B 組和D 組沒有顯著差異（P＞0.05），其他組間均存在顯著差異（P＜0.05）。

2.2 不同廠家血促性素的活性成分含量檢測

血促性素的主要成分為PMSG，分子量為53 KDa。SDS-PAGE 凝膠電泳結果顯示，C 組、E 組和F 組的血促性素均呈現出明顯的蛋白泳道（圖2A）。在43 KDa范圍處，C 組、E 組、F 組的血促性素均有蛋白條帶，其中F 組的血促性素的蛋白含量最高。上述結果提示F組中PMSG 的含量最高。

圖2 SDS-PAGE 凝膠電泳和PMSG ELISA 試劑盒測定不同廠家血促性素的含量

根據PMSG ELISA 試劑盒檢測結果，以每個標準品的平均OD 值為Y 軸，其濃度為X 軸做標準曲線（半對數，見圖2B），在0～800 IU/mL 范圍內，得到線性回歸方程y＝0.2376ln(x)-0.6403，R2=0.9981，大于0.98，表明ELISA 的線性相關性符合標準。

根據線性回歸方程計算得出不同廠家的血促性素的PMSG 含量，繪制柱狀圖（圖2C）。由圖可知，PMSG的含量從高到低依次為F 組、D 組、B 組、E 組、C 組、A 組，各組之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 血促性素生物活性檢測

2.3.1 誘導發情

大鼠一個發情周期為4～5 d，根據陰道涂片中3 種細胞不同比例區分為發情前期（圖3A）、發情期（圖3B）、發情后期（圖3C）和間情期（圖3D）。結果表明，注射藥物后第72 h，對照組的SD 大鼠發情率為33.33%，A 組、B 組、C 組、D 組、E 組和F 組的SD大鼠的發情率均為100%（圖4）。表明不同血促性素均能達到同期發情效果。

圖3 大鼠發情周期各階段陰道細胞變化圖（100×）

圖4 不同廠家血促性素對SD 大鼠同情發情的影響

14 d 的陰道涂片統計結果顯示（圖5），與對照組相比，A 組、B 組、C 組、D 組、E 組和F 組的SD 大鼠均表現出發情前期和發情后期時長顯著性減少（P＜0.05），發情期時長顯著增多（P＜0.05），其中，D 組發情前期時長最短；E 組發情期時長最短（P＜0.05），發情后期時長最長（P＜0.05）。與對照組的間情期時長相比，E 組顯著增多（P＜0.05），A 組和F 組顯著減少（P＜0.05）。上述結果提示不同血促性素均能延長SD 大鼠發情期的時間，其中，E 組的延長效果不佳。

圖5 不同血促性素對SD 大鼠發情周期的影響

2.3.2 卵巢增重及卵泡發育

SD 大鼠卵巢增重試驗結果（圖6）顯示，F 組大鼠的卵巢指數顯著高于對照組、A 組、B 組、C 組和E 組（P＜0.05），與D 組無顯著差異（P＞0.05）。除F 組外，其他各組均無顯著性差異，表明F 組具有較好地促進卵巢增重的效果。

圖6 不同廠家血促性素對SD 大鼠卵巢增重的影響

根據SD 大鼠各級卵泡的形態學特點（表2），對各組卵巢切片（圖7）中的成熟卵泡和生長卵泡進行計數，結果顯示，注射血促性素后大鼠卵巢中成熟卵泡增多。與對照組相比，C 組、D 組和F 組的成熟卵泡率顯著升高（P＜0.05）。其中，C 組和F 組的成熟卵泡率還顯著高于A 組和B 組（P＜0.05）。但是，其他各組的成熟卵泡率無顯著性差異（圖8）。結果表明，C 組和F組產品均可以促進SD 大鼠卵泡成熟。

表2 大鼠各級卵泡的形態學特征

圖7 不同血促性素對SD 大鼠的卵泡發育的影響（40×）

圖8 不同血促性素對SD 大鼠的成熟卵泡率的影響

3 討論

注射用血促性素是母畜繁育中廣泛使用的激素產品，主要用于調控母畜同期發情和超數排卵。我國獸藥典標準中規定，注射用血促性素效價應為標示量的67%～148%。由試驗結果可知，市場上商品化注射用血促性素的效價具有一定差異。馬增曉等[19]研究表明，PMSG 的劑量會影響動物的發情、排卵和受胎率。為了篩選出高效的血促性素，對6 種常見注射用血促性素進行了活性成分含量檢測和生物活性分析。

血促性素的活性成分含量是決定其生物活性的前提。蛋白濃度檢測結果發現，C 組、E 組、F 組的血促性素均具有較高的蛋白濃度，其中F 組濃度最高。SDS-PAGE 凝膠電泳和ELISA 檢測結果顯示，F 組的血促性素中PMSG 含量最高，D 組、B 組、E 組、C 組、A 組的PMSG 含量依次降低。表明F 組的血促性素含有最多的活性成分，PMSG 含量最高，其應用效果最好。生物活性試驗結果顯示，6 種血促性素均能100%誘導SD 大鼠同期發情，這與高建明等[20]報道的PMSG 劑量對動物同期發情效果無顯著影響結果一致。發情期是動物排卵的主要時期[21]，PMSG 可以在大鼠發情周期的任何階段誘導超數排卵[22]。陰道涂片結果顯示，6 種血促性素均能顯著促進大鼠發情期時間的增長，但E 組效果較差，表明6 種血促性素均能誘導大鼠超數排卵，但排卵效果有差異。此外，卵巢增重和HE 染色結果表明，僅有F 組的大鼠卵巢指數顯著增加，卵泡成熟率最高，表明F 組的血促性素促進卵泡發育的效果最好，可以誘導大鼠超數排卵。曾昭成等[23]指出不同效價的PMSG 對動物發情率和排卵率影響不顯著，但高效價的PMSG 可以顯著提高動物的排卵數，提升動物受胎率，這與本研究結果類似。生殖激素是調控動物卵巢發育及其排卵過程的主要內分泌因子[24]，PMSG 作為生殖激素的一種，在血液中半衰期較長，可達2～5 d，外源注射后體內殘留的激素會影響母畜的發情效果。低效價的PMSG 雖然誘導動物發情，但對卵巢影響較小，無法改善動物卵泡發育和排卵情況[25]。此外，低效價PMSG 比高效價PMSG 更易引發大鼠子宮和卵巢水腫，影響動物卵子發育，導致動物后期受胎率大幅降低，降低母畜繁殖性能，影響家畜養殖效益。

4 結論

通過對6 家廠家的注射用血促性素進行活性成分含量檢測和生物學活性分析，發現F 組產品效果最好。低效價的血促性素只具備誘導大鼠發情的效果，不能誘導其排卵，容易導致動物配種失敗。而高效價的血促性素兼備誘導發情、促進卵巢發育和促進卵泡成熟的效果，有利于動物配種成功和超數排卵，提升動物受胎率和產仔率。因此，使用高效價的血促性素能使養殖場的效益更大化。