豬源多殺性巴氏桿菌莢膜血清PCR分型鑒定

喬曉光

（河南省長垣市農業農村局，河南新鄉 453400）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida,Pm）是巴氏桿菌科巴氏桿菌屬成員，革蘭氏染色陰性，球桿菌或短桿狀菌，需氧或兼性厭氧，無鞭毛、無芽胞、無運動性，能夠引起多種畜禽出血性敗血癥或傳染性肺炎[1]。多殺性巴氏桿菌的血清型較多，根據其莢膜抗原差異，多殺性巴氏桿菌可分為A、B、D、E、F 等5 種血清型[2]。不同血清型對宿主有不同的易感性，如多殺性巴氏桿菌血清型A 和D 型通常與豬的肺炎和胸膜炎有關，血清型B 和E 型菌株與牛出血性敗血病有關[3,4]，此外多殺性巴氏桿菌血清型不同，其交叉免疫保護力較差，因此，對病原鑒定時有必要鑒定其血清型。

本研究對河南省長垣市部分養豬場發病豬采集鼻咽拭子進行多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定，并進行PCR 莢膜血清型檢測和分離株對抗菌藥物耐藥性的檢測，以期為豬多殺性巴氏桿菌病防治和疫苗研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集

采集長垣市部分養豬場疑似豬肺疫、豬萎縮性鼻炎病豬的鼻拭子127 份，裝入含有TSB 液體的培養基收集管中，送實驗室4℃保存備用。

1.2 試驗材料和試驗動物

胰酶大豆瓊脂培養基（TSA，含有5%犢牛血清和5%脫纖維綿羊血）、酶大豆肉湯培養基（TSB）均購自天津一方科技有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京） 有限公司；2×Taq PCR Master Mix 由Solarbio 公司生產；抗生素藥敏紙片，細菌生化反應鑒定試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。5 周齡SPF 級小鼠55 只，購自河南科技學院動物醫學實驗室。

1.3 細菌的分離培養

將127 份病料分別接種于含有5%犢牛血清和5%脫纖維綿羊血TSA 培養基中，37℃純化培養24 h，然后挑取單個菌落制作涂片，對菌落分別進行革蘭氏染色和瑞氏染色，油鏡觀察細菌染色和形態特性。

1.4 生化鑒定試驗

挑取純化的分離菌落，按照細菌生化鑒定說明書分別接種于蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、硝酸鹽、枸櫞酸鹽、麥芽糖、V-P、M-R、硫化氫、蛋白胨水、甘露醇、H2S 等細菌生化鑒定管中，37℃培養24 h，觀察反應結果。

1.5 分離菌株16S rRNA 鑒定

取純化的分離菌株，接種于含有5%犢牛血清的TSB 培養基中，搖床震蕩，37℃培養24 h，按照細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取分離菌株的基因組DNA。參考朱飛舟等[5]合成細菌16S rRNA 通用引物，引物序列為：27F：5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，由中美泰和生物技術（北京）有限公司合成。預期擴增目的片段1 450 bp。PCR 反應體系20 μL：分離菌株DNA 模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 12 μL，ddH2O 補足至20 μL。PCR 反應程序：94℃5 min，94℃30 s，53℃30 s，72℃60 s，共35 個循環，72℃延伸10 min。PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲取的目的片段，經回收后送中美泰和生物技術（北京）有限公司進行分離菌株16S rRNA 測序，測序結果與NCBI 數據庫收錄的多殺性巴氏桿菌基因組序列進行BLAST 同源性比對分析，以鑒別分離菌株種類。

1.6 莢膜血清型PCR 鑒定

參照李紅婕等[6]設計的莢膜血清型特異性引物capA、capB、capD、capE、capF 序列，分別合成引物，由中美泰和生物技術（北京）有限公司合成。除所有鑒定引物退火溫度均為55℃外，其他PCR 反應體系和反應程序與上述1.5 內容相同。引物生物信息見表1。

表1 多殺性巴氏桿菌莢膜血清型鑒定引物生物信息

1.7 對小鼠的致病性試驗

用無菌生理鹽水稀釋純培養菌落，分光光度計測定菌液濃度，使其終濃度為1×108CFU/mL。將5 周齡SPF 昆明小鼠分成1 個對照組和10 個試驗組，每組5只。試驗組腹腔注射菌液0.2 mL/只，對照組注射等體積的生理鹽水。觀察小鼠精神狀態，記錄死亡時間和數量。采集死亡小鼠肝臟、肺臟、脾臟等組織器官，分離培養和革蘭氏染色、瑞氏染色。

2 結果與分析

2.1 細菌染色鏡檢與分離鑒定

本研究共有10 株分離菌在含有綿羊血和犢牛血清的TSA 培養基上形成稍微隆起、表面光滑濕潤、呈露珠狀的灰白色圓形菌落（圖1A）；鏡檢觀察到分離菌革蘭染色為陰性，菌體呈兩極濃染的短桿狀、圓形或卵圓形（圖1B）。瑞氏染色鏡檢可見藍色兩極濃染、大小不一的短球桿菌（圖1C）。

圖1 A：分離菌在TSA 培養基上的菌落特性；B：革蘭氏染色鏡檢（10×100）；C：瑞氏染色鏡檢（10×100）

2.2 細菌生化鑒定結果

分離菌在接種于細菌生化鑒定管培養后，生化試驗結果顯示上述10 株分離菌均發酵果糖、蔗糖、麥芽糖，硝酸鹽、甘露醇、過氧化氫和蛋白胨水試驗結果為陽性；M-R、V-P 試驗結果為陰性；基本符合多殺性巴氏桿菌的生化特征。對10 株分離菌命名分別編號為CY01～CY10。

2.3 分離菌的16S rRNA 鑒定

利用PCR 擴增分離菌16S rRNA 基因獲得1 條長度為1 450 bp 的特異性條帶（圖2），符合預期目的基因片段大小。測序結果與NCBI 數據庫的豬多殺性巴氏桿菌參考菌株序列進行BLAST 同源性比對，結果顯示分離菌的16S rRNA 基因序列與豬多殺性巴氏桿菌的序列相似性均為100%。結合分離菌培養特性和生化試驗結果，表明這10 株分離菌為豬多殺性巴氏桿菌，其檢出率為7.87%（10/127）。

圖2 分離菌株莢膜血清PCR 分型鑒定電泳結果

2.4 分離菌莢膜血清PCR 分型鑒定

利用多殺性巴氏桿菌莢膜血清特異性基因引物進行PCR 鑒定（圖3），結果顯示有3 株分離菌株提取的基因片段中，擴增的目的條帶長度約為648 bp，符合capD，占30.00%；1 株分離菌目的條帶約為760 bp，符合capB，占10.00%；6 株分離菌長度約為1 050 bp，符合capA，占60.00%。

圖3 10 株分離菌株莢膜血清型PCR 分型電泳結果

2.5 小鼠致病性試驗結果

試驗組小鼠于注射菌株后3 h 開始精神不振，呆立顫抖，8 h 后陸續出現死亡，36 h 內死亡34 只。剖檢可見小鼠肝臟、肺臟等器官出血腫脹。無菌采集死亡小鼠肝臟、肺臟病料接種于TSA 培養基上，培養出的菌落形態特性以及革蘭氏染色和瑞氏染色鏡檢結果均與上述分離菌一致。

3 討論

豬多殺性巴氏桿菌廣泛存在于養豬環境和豬體正常菌群內，是一種條件致病菌，通常在豬體免疫下降或外界環境應激作用下發病，并且與其他病原體混合協同感染豬體，增加診斷和防治的難度。目前多殺性巴氏桿菌的檢測技術主要是分離鑒定、PCR、ELISA、限制性酶切分析和DNA 雜交等，其中應用較普遍、靈敏快速的是PCR 檢測，而PCR 檢測擴增用引物大多根據多殺性巴氏桿菌16S rDNA 確定[7,8]，16S rDNA 基因序列越來越多地用于細菌的鑒定和分類，PCR 技術是在DNA 聚合酶和核苷酸底物作用下，以母鏈DNA 為模板，經過預變性、變性、退火、延伸等反應程序，體外擴增復制出與母鏈模板DNA 互補的子鏈DNA[9]。

多殺性巴氏桿菌莢膜決定其致病力，不同莢膜血清型致病力存在差異，且它們之間交叉免疫保護力較弱，因此，莢膜血清分型鑒定對提高診治效率和有效性具有重要意義。彭忠等[10]報道，當前在我國豬群中流行的多殺性巴氏桿菌主要為A 型和D 型菌株。張哲瑋等[11]對來自廣西、湖北、內蒙古3 個地區規模化豬場中有呼吸道癥狀豬的口鼻拭子及組織病料進行病原菌分離鑒定。結果顯示，分離得到6 株豬多殺性巴氏桿菌，其中血清A型1 株、血清D 型5 株。林星宇等[12]從四川、重慶、云南等地8 個規模化養殖場的125 份病死豬肺炎樣品中，分離出11 株多殺性巴氏桿菌，其中有7 株為A 血清型（63.6%）、3 株為D 血清型（27.3%）。本研究結果顯示，從河南長垣市豬群采集的127 份病料中，分離鑒定出10株多殺性巴氏桿菌，檢出率為7.87%，優勢莢膜血清流行株為A 型（60.00%）和D 型（30.00%），與上述學者報道結果相一致，且符合我國動物源多殺性巴氏桿菌血清型多為莢膜A 型的流行情況[13-15]。本次動物致病力試驗小鼠死亡率較高，為68.00%（34/50），表明多殺性巴氏桿菌致病性較強。本研究雖然采樣數量偏少，但也可以說明多殺性巴氏桿菌病在該地有一定的流行性，應引起重視。

4 小結

本研究對河南省長垣市部分豬場多殺性巴氏桿菌進行分離培養、生化鑒定、PCR 分子鑒定和莢膜血清分型，結果發現，從127 份鼻拭子樣品中檢測出10 株多殺性巴氏桿菌，檢出率為7.87%，血清A 和D 型為當地主要優勢血清型，動物試驗證明分離菌株致病菌毒力較強。應加強監測，開展綜合防治。