circFAT1對膠質母細胞瘤細胞生物過程的機制研究

張立群　烏日吉木斯　鄭曉明　汪琳　韓玉秀　張薇　閻濤

摘要：目的 探討circFAT1吸附miR-1182調控轉化生長因子（TGF）-β/Smad信號通路對膠質母細胞瘤（GBM）增殖、侵襲、上皮-間充質轉化（EMT）的調控作用及機制。方法 收集50例GBM樣本和5例非瘤腦組織（NBT）樣本，隨機抽取3例GBM和3例NBT樣本進行組織RNA測序。體外培養GBM細胞系U87、U251、T98G、LN229及星形膠質細胞系NHA，通過qRT-PCR檢測組織和細胞系中circFAT1表達。通過RNase R選擇性降解線性轉錄本以明確circFAT1成環特性。將GBM細胞分為sh-對照組和sh-circFAT1組，采用慢病毒進行轉染。轉染后集落形成實驗、Transwell實驗、Western blot實驗分別檢測細胞增殖、侵襲及EMT能力。熒光原位雜交（FISH）檢測circFAT1在GBM細胞內定位，通過雙螢光素酶報告基因和RNA免疫共沉淀（RIP）實驗驗證circFAT1和miR-1182的相互作用。Western blot實驗驗證敲低circFAT1后或抑制miR-1182表達對TGF-β/Smad信號通路的調控作用。結果 circFAT1在GBM組織和細胞中表達增加（P＜0.05）。RNase R可減少線性FAT1表達（P＜0.05），而不影響circFAT1。敲除circFAT1抑制了GBM細胞的增殖、侵襲和EMT（P＜0.05）。雙螢光素酶報告基因和RIP實驗證實circFAT1靶向結合miR-1182。敲低circFAT1后TGFB2、p-SMAD2、p-SMAD3蛋白表達下降，抑制miR-1182表達后GFB2、p-SMAD2、p-SMAD3蛋白表達升高。結論 敲除circFAT1可抑制GBM細胞增殖、侵襲和EMT，其作用機制可能與吸附miR-1182調控TGF-β/Smad信號通路有關。

關鍵詞：膠質母細胞瘤；細胞增殖；轉化生長因子β；微RNAs；circFAT1；上皮間充質轉化

中圖分類號：R739.41文獻標志碼：ADOI：10.11958/20230224

The mechanisms of circFAT1 on the biological process of GBM cells

ZHANG Liqun WURI Jimusi ZHENG Xiaoming WANG Lin HAN Yuxiu ZHANG Wei YAN Tao

1 Tianjin Neurological Institute， Tianjin Medical University General Hospital， Tianjin 300052， China;

2 Department of Obstertrics and Gynecology， Tianjin First Central Hospital

Corresponding Author E-mail： taoyan@tmu.edu.cn

Abstract： Objective To investigate the regulation and mechanism of circFAT1 on proliferation， invasion and epithelial-mesenchymal transition （EMT） of glioblastoma （GBM）. Methods Fifty GBM samples and 5 non-tumor brain tissue （NBT） samples were collected， and 3 GBM and 3 NBT samples were randomly selected for tissue RNA sequencing. The expression levels of circFAT1 in U87， U251， T98G， LN229 GBM cell lines and NHA astrocyte lines were detected by qRT-PCR. The cyclic properties of circFAT1 were determined by selective degradation of linear transcripts by RNase R. GBM cells were divided into the sh-control group and the sh-circFAT1 group. Cell proliferation， invasion and EMT were detected by colony formation assay， transwell assay and Western blot assay after lentivirus transfection. Fluorescence in situ hybridization （FISH） was used to detect the localization of circFAT1 in GBM cells， and the interaction between circFAT1 and miR-1182 was verified by dual-luciferase reporter and RNA immunocoprecipitation （RIP） assay. Finally， Western blot assay was performed to verify the regulatory effect of circFAT1 knockdown or inhibition of miR-1182 expression on TGF-β/Smad signaling pathway. Results The expression of circFAT1 was increased in GBM tissue and cells （P＜0.05）. RNase R reduced linear FAT1 expression without affecting circFAT1 （P＜0.05）. Knockout of circFAT1 inhibited the proliferation， invasion and EMT of GBM cells （P＜0.05）. Dual-luciferase reporter and RIP assay confirmed that circFAT1 targeting on miR-1182. The protein levels of TGFB2， p-SMAD2 and p-SMAD3 were decreased after circFAT1 knockdown， while protein expressions of TGFB2， p-SMAD2 and p-SMAD3 increased after inhibiting the expression of miR-1182 （all P＜0.05）. Conclusion Knockout of circFAT1 can inhibit proliferation， invasion and EMT of GBM cells， and its mechanism may be related to the regulation of TGF-β/Smad signaling pathway by sponge miR-1182.

Key words： glioblastoma; cell proliferation; transforming growth factor beta; microRNAs; circFAT1; epithelial-mesenchymal transition

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是癲癇的誘發因素之一［1］，患者的預后與癲癇的臨床表現有關［2］。研究表明，GBM患者經過手術聯合系統放化療后的中位生存時間也低于15個月［3］。因此，進一步研究GBM發生發展的分子機制，尋找GBM診斷和預后的生物標志物和治療靶點具有重要意義。環狀RNA（circRNA）已被證實與細胞的病理生理過程相關［4］。研究表明，多種circRNAs通過不同的分子機制參與癌癥的發展過程［5］。但環狀RNA脂肪非典型鈣黏蛋白1（circRNA FAT atypical cadherin 1，circFAT1）在腫瘤特別是GBM中的作用及相應機制尚不明確。轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）通路因其在腫瘤早期抑制腫瘤細胞增殖，而在腫瘤晚期通過調節上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、血管生成、免疫逃逸、侵襲和轉移促進腫瘤的發展而備受關注。研究表明，TGF-β信號通路促進細胞增殖與EMT進程，從而促進GBM的發展［6］。本研究旨在觀察敲除circFAT1對GBM細胞增殖、侵襲、EMT以及TGF-β通路的影響，為探求GBM診治靶點提供新的思路與方向。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 膠質瘤細胞及組織樣本

選取2019年6月—2022年1月天津醫科大學總醫院神經外科患者經手術切除的50例GBM和5例非瘤腦組織（NBT）標本，所有組織樣本均經病理證實，凍存于-80 ℃以備后續研究。所有患者均簽署書面知情同意書。本研究方案經天津醫科大學總醫院倫理委員會批準（批件號：2019-SR-479）。本研究所用GBM細胞系U87、U251、T98G、LN229，星形膠質細胞系NHA和工具細胞HEK293T均購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑與儀器

高糖Dulbecco改良Eagles（DMEM）培養基、胎牛血清（FBS）購自美國Sigma公司；TRIzol法RNA提取試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；RNA反轉錄試劑盒、高敏qRT-PCR試劑盒購自中國Vazyme公司；RiboMinus真核細胞試劑盒購自德國Qiagen公司；Agilent DNA 1000測序芯片購自美國Agilent公司；EntransterTM-R4000轉染試劑購自中國英格恩公司；核糖核酸酶R（RNase R）購自美國Epicentre公司；兔抗人鈣黏蛋白E（E-cadherin）、鈣黏蛋白N（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、轉化生長因子β2（transforming growth factor beta 2，TGFB2）、磷酸化SMAD2（p-SMAD2）、磷酸化SMAD3（p-SMAD3）蛋白抗體購自英國Abcam公司，兔抗人GAPDH和小鼠抗人β-actin抗體購自美國cell signaling technology公司。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗購自美國Thermo Fisher公司。雙螢光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司；Transwell小室（含基質膠）購自美國Corning公司。熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）試劑盒、sh-circFAT1、sh-ctrl、miR-1182 inhibitor、miR-NC inhibitor購自中國RiboBio公司。RNA免疫共沉淀（RIP）試劑盒、人源argonaute2（ago2）抗體、小鼠IgG抗體購自美國Millipore公司。野生型circFAT1、突變型circFAT1報告質粒、miR‐1182 mimics、miR‐NC、sh-circFAT1及sh-對照序列均由中國銳博生物構建。NanoDrop 2000分光光度計購自美國Thermo-Fisher公司；7900HT PCR系統購自美國Applied Biosystems公司；Agilent 2100生物分析儀購自美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA測序（RNA-seq）分析

采用TRIzol試劑從隨機抽取的3例GBM組織和3例NBT組織中提取總RNA［7］，采用NanoDrop 2000分光光度計對RNA進行質控及定量檢測。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性及是否存在gDNA污染。在構建RNA-seq文庫之前，先用RiboMinus真核細胞試劑盒去除核糖體RNA。測序文庫由Agilent 2100生物分析儀通過使用Agilent DNA 1000芯片進行測定。

1.2.2 細胞培養

所有細胞均在含10% FBS的DMEM培養基中培養，細胞培養環境為37 ℃、5%CO2。

1.2.3 RNA提取及qRT-PCR檢測

使用TRIzol試劑從細胞或組織中提取總RNA［7］。根據試劑盒說明書反轉錄為cDNA。根據高敏qRT-PCR試劑盒說明書配制反應體系。然后在7900HT系統上進行qRT-PCR反應，反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共計40個循環。每個樣本設置3個復孔，并通過2-ΔΔCt法計算基因相對表達量，β-actin作為內參對照。引物序列見表1。選取circFAT1表達水平最高的細胞系用作后續研究。

1.2.4 GBM細胞中circFAT1表達穩定性鑒定

將GBM細胞按是否經過RNase R處理分為對照組和RNase R組，按1.2.3方法提取細胞總RNA。各組分別取2 ?g總RNA，RNaseR組加入6 U的RNase R，37 ℃消化20 min，對照組加入等量PBS。消化后的RNA根據試劑盒說明書進行純化，按1.2.3方法通過qRT-PCR檢測circFAT1及線性FAT1（linerFAT1）表達。引物序列見表1。

1.2.5 sh-circFAT1及miR‐1182抑制劑（inhibitor）轉染

細胞轉染方案同本課題組前期研究方案［7］。將GBM細胞分為sh-對照組、sh-circFAT1-1組、sh-circFAT1-2組及sh-circFAT1-3組。將細胞鋪于6孔板中，待細胞貼壁后將50 pmol shRNA溶于Opti-MEM培養基（200 ?L）中，與EntransterTM-R4000轉染試劑充分混合后轉染48 h。通過qRT-PCR驗證轉染效率，選取效率最高的shRNA進行后續實驗。miR‐1182 inhibitor轉染：將細胞鋪于6孔板中，待融合度達60%～70%、細胞貼壁后將質粒（根據需要3～5 ?g）溶于Opti-MEM培養基（200 ?L）中，與EntransterTM-R4000轉染試劑充分混合后轉染48 h。

1.2.6 集落形成實驗檢測細胞增殖

將GBM細胞分為sh-對照組及sh-circFAT1組。轉染目的RNA 48 h后，將2組細胞分別接種于含10% FBS的DMEM培養基中培養11 d。所得細胞集落用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結晶紫染色30 min。普通攝像機拍照后使用Image J軟件計數集落數目。

1.2.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲

細胞分組同1.2.6。使用由聚碳酸酯濾器（8 μm孔徑；0.33 cm2）組成的直徑為6.5 mm的Transwell小室進行實驗。轉染目的RNA 48 h后，將GBM細胞（3×104個）轉移至含有無血清培養基的上層小室中，下層小室加入含10%FBS的DMEM培養基。37 ℃孵育48 h后，去除上層未侵襲的細胞，剩余細胞用4%多聚甲醛固定20 min。用0.1%結晶紫染色，用Nikon ECLIPSE E800熒光倒置顯微鏡觀察。

1.2.8 Western blot檢測EMT能力

細胞分組同1.2.6。用免疫沉淀緩沖液裂解細胞，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。使用10%濃度的SDS-PAGE進行蛋白電泳分離蛋白。220 mA恒流轉膜90 min。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中封閉1 h；一抗稀釋后（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin稀釋比例為1∶1 000，GAPDH稀釋比例為1∶2 000），4 ℃與PVDF膜共同孵育過夜，二抗稀釋后（1∶2 000），與PVDF膜在37 ℃搖床孵育1 h。ECL化學發光液均勻涂抹于PVDF膜，BIO-RAD化學發光凝膠成像儀拍照。

1.2.9 FISH檢測circFAT1在細胞中的分布

通過FISH檢測試劑盒（RiboBio）檢測［7］。使用0.5%Triton X-100對經甲醛固定的細胞行透性處理，并與特異性探針在37 ℃下雜交過夜。用4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）標記細胞核。熒光圖像由蔡司LSM 700共聚焦顯微鏡拍攝得到。

1.2.10 RIP

RIP實驗方案同本課題組先前研究方案［7］。制備GBM細胞裂解物，用含磁珠的RIP緩沖液孵育，磁珠與人源ago2抗體結合，按1.2.3方法通過qRT-PCR檢測免疫沉淀RNA表達。裂解物組（Input）作為陽性對照，IgG抗體組作為陰性對照，抗ago2（anti-Ago2）抗體組檢測circFAT1富集水平。

1.2.11 雙螢光素酶報告基因檢測

螢光素酶測定方案同同本課題組先前研究方案［7］。從DIANA數據庫（http：//diana.imis.athena-innovation.gr/）預測circFAT1與miR-1182的結合位點，并將野生型（WT）或突變型（MUT）circFAT1報告質粒、miR‐1182 mimics或miR‐NC和海腎螢光素酶質粒共轉染至U87細胞。使用雙螢光素酶報告基因試劑盒檢測所有熒光素酶活性。螢火蟲螢光素酶活性通過海腎螢光素酶活性進行均一化。

1.2.12 Western blot檢測TGF-β信號通路蛋白表達

將GBM細胞分為A組（轉染sh-對照序列+miR-NC inhibitor）、B組（轉染sh-circFAT1+miR-NC inhibitor）、C組（轉染sh-對照序列+miR-1182 inhibitor）、D組（轉染sh-circFAT1+miR-1182 inhibitor）。按1.2.7方法檢測TGMB2、p-SMAD2、p-SMAD3、β-actin蛋白表達水平，以β-actin為內參蛋白，計算TGMB2、p-SMAD2、p-SMAD3相對表達量。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 7軟件進行數據分析。計量數據用均數±標準差（x±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circFAT1在GBM組織和細胞中的表達情況

組織間circRNA測序顯示，在GBM中共有29個表達上調的circRNA（|log2| fold change≥1且P＜0.05），其中包含has_circ_0001461（即circFAT1［8］），見圖1。NHA、U87、LN229、T98G、U251細胞系中circFAT1表達水平分別為1.00±0.02、3.99±0.25、2.01±0.05、1.89±0.18和2.83±0.11，差異有統計學意義（F=31.514，P＜0.01）。U87細胞系中circFAT1表達水平最高，用作后續研究。GBM組織中circFAT1表達水平高于NBT組織（4.17±1.10 vs. 1.24±0.41，t=12.091，P＜0.01）。

2.2 circFAT1的環狀結構及表達穩定性鑒定

circFAT1是通過FAT1基因第2外顯子與兩側內含子中的Alu元件的反向剪接而產生，見圖2。linerFAT1在對照組和RNase R組中相對表達量分別為1.02±0.01和0.26±0.01，差異有統計學意義（t=7.963，P＜0.01），而circFAT1的表達量分別為0.95±0.00和1.03±0.01，差異無統計學意義（t=1.061，P＞0.05）。

2.3 敲除circFAT1基因抑制GBM細胞的增殖、侵襲和EMT能力

sh-對照組、sh-circFAT1-1組、sh-circFAT1-2組及sh-circFAT1-3組circFAT1相對表達量分別1.00±0.01、0.15±0.00、0.34±0.02、0.65±0.01，差異有統計學意義（n=3，F=48.082，P＜0.05）。其中sh-circFAT1-1序列敲除效率最高，用于后續實驗。與sh-對照組相比，sh-circFAT1組U87細胞集落數量和侵襲率下降，E-cadherin表達增高，N-cadherin和Vimentin表達降低，見圖3、表2。

2.4 雙螢光素酶報告基因驗證circFAT1下游靶點

circFAT1在GBM細胞中定位于細胞質。RIP實驗顯示，與陰性對照相比，anti-Ago2可顯著富集circFAT1，差異有統計學意義（F=549.152，P＜0.01）。雙螢光素酶報告基因顯示，與miR-NC組相比，miR-1182 mimic組可降低含circFAT1-WT報告載體細胞的螢光素酶活性（t=6.726，P＜0.01），對含circFAT1-MUT報告載體細胞的螢光素酶活性無明顯影響（t=0.555，P＞0.05）。見圖4。

2.5 circFAT1對TGF-β/Smad信號通路的影響

與A組比較，B組TGFB2、p-SMAD2、p-SMAD3表達量下降，而C組中相應蛋白表達升高；與C組比較，D組TGFB2、p-SMAD2、p-SMAD3表達量下降；與B組比較，D組TGFB2、p-SMAD2、p-SMAD3表達量升高（均P＜0.05），見圖5、表3。

3 討論

膠質瘤是中樞神經系統的原發性腫瘤，成人的發病率最高，占顱內腫瘤的50%［9］，其中GBM約占膠質瘤的46.6%［10］，其發病率呈逐年上升趨勢。目前，GBM患者的平均生存時間僅為15個月左右，即使在接受標準化膠質瘤治療方案（即手術切除加術后放化療）后效果亦不顯著［11］。因此，有必要進一步研究GBM發生發展的潛在機制，改進現有治療方案，以改善患者預后。

circRNA是通過前體mRNA的反向剪接而形成［12］，其核心形成機制包括單外顯子環化、多外顯子環化及協同環化［13］。circRNA的形成機制主要包括套索驅動環化、RNA結合蛋白驅動環化和反向剪接［14］。盡管circRNA的表達量遠不如其線性轉錄本，但由于其存在共價閉環結構且缺乏游離末端，使其可免受RNase R的降解作用，進而具有高度穩定性及保守性［15］。因此，circRNA可用于識別不同的腫瘤類型［16］。circRNA表達具有組織特異性和發育階段特異性，在癌癥的發生和發展中起著重要作用［17-18］。環狀RNA瘙癢E3泛素蛋白連接酶（circRNA itchy E3 ubiquitin protein ligase，circITCH）在食管癌中的表達明顯低于癌旁組織。此外，環狀RNA-7（circRNA 7，ciRS-7）在神經母細胞瘤和膠質瘤中廣泛表達［19］。circRNAs在腫瘤中的差異表達提示它們可能在腫瘤進展中起調節作用，可作為診斷和預后評估的潛在生物標志物［20］。本研究對GBM和NBT樣本進行circRNAs測序分析，發現circFAT1在GBM組織中異常高表達。本研究還發現，在RNase R處理下，circFAT1具有較高的表達穩定性，敲除circFAT1可抑制GBM細胞的增殖和侵襲。這些結果表明，circFAT1在GBM的侵襲性生長過程中起重要作用。

目前，circRNA的主要作用機制包括以下3點：（1）circRNA作為miRNA“分子海綿”發揮作用。（2）circRNA與蛋白質結合相互作用。（3）circRNA可直接進行翻譯，得到相應蛋白進而發揮作用。circRNA的亞細胞定位決定其自身的生物學功能［21］。本研究發現，circFAT1主要在細胞質中表達。circRNA已被證明可通過定向結合任意miRNA發揮作用，從而形成復雜的調控網絡［22-23］。通過生物信息學分析發現，miR-1182可能是circFAT1的潛在靶點。miR-1182過表達可以抑制卵巢癌的轉移和增殖以及非小細胞肺癌的進展，表明其可能作為多種腫瘤結局的預測指標，并可作為潛在的診斷和治療靶點［24］。本研究結果表明，circFAT1可作為miR-1182的分子海綿吸附miR-1182，進而參與miR-1182在GBM中的功能調控。進一步的通路研究表明，敲除circFAT1可下調TGF-β通路相關蛋白TGFB2、p-SMAD2、p-SMAD3的表達，抑制該通路活化，而TGF-β信號通路的活化已被證實在多種惡性腫瘤中起著重要的促進作用［25］。

綜上所述，敲低circFAT1可抑制TGF-β信號通路激活，延緩GBM細胞的增殖和EMT過程。因此，circFAT1可能是GBM的潛在生物標志物和治療靶點。但circFAT1/miR-1182軸在GBM中的下游基因尚未被闡明，并且circFAT1的功能仍需進一步的體內研究進行驗證。

參考文獻

［1］ HUBERFELD G，VECHT C J. Seizures and gliomas-towards a single therapeutic approach［J］. Nat Rev Neurol，2016，12（4）：204-216. doi：10.1038/nrneurol.2016.26.

［2］ HATCHER A，YU K，MEYER J，et al. Pathogenesis of peritumoral hyperexcitability in an immunocompetent CRISPR-based glioblastoma model［J］. J Clin Invest，2020，130（5）：2286-2300. doi：10.1172/jci133316.

［3］ FURNARI F B，FENTON T，BACHOO R M，et al. Malignant astrocytic glioma：genetics，biology，and paths to treatment［J］. Genes Dev，2007，21（21）：2683-2710. doi：10.1101/gad.1596707.

［4］ SPIZZO R，ALMEIDA M I，COLOMBATTI A，et al. Long non-coding RNAs and cancer：a new frontier of translational research？［J］. Oncogene，2012，31（43）：4577-4587. doi：10.1038/onc.2011.621.

［5］ CHEN L，SHAN G. CircRNA in cancer：fundamental mechanism and clinical potential［J］. Cancer Lett，2021，505：49-57. doi：10.1016/j.canlet.2021.02.004.

［6］ ZHANG G，FENG W，WU J. Down-regulation of SEPT9 inhibits glioma progression through suppressing TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition （EMT）［J］. Biomed Pharmacother，2020，125：109768. doi：10.1016/j.biopha.2019.109768.

［7］ ZHANG L，WANG H，XU M，et al. Long noncoding RNA HAS2-AS1 promotes tumor progression in glioblastoma via functioning as a competing endogenous RNA［J］. J Cell Biochem，2020，121（1）：661-671. doi：10.1002/jcb.29313.

［8］ FANG J，HONG H，XUE X，et al. A novel circular RNA，circFAT1（e2），inhibits gastric cancer progression by targeting miR-548g in the cytoplasm and interacting with YBX1 in the nucleus［J］. Cancer Lett，2019，442：222-232. doi：10.1016/j.canlet.2018.10.040.

［9］ YANG Y，GAO X，ZHANG M，et al. Novel role of FBXW7 circular RNA in repressing glioma tumorigenesis［J］. J Natl Cancer Inst，2018，110（3）：304-315. doi：10.1093/jnci/djx166.

［10］ LIU J，ZHAO K，HUANG N，et al. Circular RNAs and human glioma［J］. Cancer Biol Med，2019，16（1）：11-23. doi：10.20892/j.issn.2095-3941.2018.0425.

［11］ SONG X，ZHANG N，HAN P，et al. Circular RNA profile in gliomas revealed by identification tool UROBORUS［J］. Nucleic Acids Res，2016，44（9）：e87. doi：10.1093/nar/gkw075.

［12］ HE Q，ZHAO L，LIU Y，et al. circ-SHKBP1 regulates the angiogenesis of U87 glioma-exposed endothelial cells through miR-544a/FOXP1 and miR-379/FOXP2 pathways［J］. Mol Ther Nucleic Acids，2018，10：331-348. doi：10.1016/j.omtn.2017.12.014.

［13］ ZHU L P，HE Y J，HOU J C，et al. The role of circRNAs in cancers［J］. Biosci Rep，2017，37（5）：BSR20170750. doi：10.1042/bsr20170750.

［14］ SHANG Q，YANG Z，JIA R，et al. The novel roles of circRNAs in human cancer［J］. Mol Cancer，2019，18（1）：6. doi：10.1186/s12943-018-0934-6.

［15］ MA S，KONG S，WANG F，et al. CircRNAs：biogenesis，functions，and role in drug-resistant Tumours［J］. Mol Cancer，2020，19（1）：119. doi：10.1186/s12943-020-01231-4.

［16］ SALZMAN J，CHEN R，OLSEN M，et al. Cell-type specific features of circular RNA expression［J］. PLoS Genet，2013，9（9）：e1003777. doi：10.1371/journal.pgen.1003777.

［17］ ASHWAL-FLUSS R，MEYER M，PAMUDURTI N R，et al. circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing［J］. Mol Cell，2014，56（1）：55-66. doi：10.1016/j.molcel.2014.08.019.

［18］ HANAN M，SOREQ H，KADENER S. CircRNAs in the brain［J］. RNA Biol，2017，14（8）：1028-1034. doi：10.1080/15476286.2016.1255398.

［19］ YANG Y，LI J M，WANG X，et al. Analyzing the interactions of mRNAs，miRNAs，lncRNAs and circRNAs to predict competing endogenous RNA networks in glioblastoma［J］. J Neurooncol，2018，137（3）：493-502. doi：10.1007/s11060-018-2757-0.

［20］ LI F，ZHANG L，LI W，et al. Circular RNA ITCH has inhibitory effect on ESCC by suppressing the Wnt/β-catenin pathway［J］. Oncotarget，2015，6（8）：6001-6013. doi：10.18632/oncotarget.3469.

［21］ ZHANG H，ZHU L，BAI M，et al. Exosomal circRNA derived from gastric tumor promotes white adipose browning by targeting the miR-133/PRDM16 pathway［J］. Int J Cancer，2019，144（10）：2501-2515. doi：10.1002/ijc.31977.

［22］ ZHOU C，MOLINIE B，DANESHVAR K，et al. Genome-wide maps of m6A circRNAs identify widespread and cell-type-specific methylation patterns that are distinct from mRNAs［J］. Cell Rep，2017，20（9）：2262-2276. doi：10.1016/j.celrep.2017.08.027.

［23］ LEI M，ZHENG G，NING Q，et al. Translation and functional roles of circular RNAs in human cancer［J］. Mol Cancer，2020，19（1）：30. doi：10.1186/s12943-020-1135-7.

［24］ HOU X S，HAN C Q，ZHANG W. MiR-1182 inhibited metastasis and proliferation of ovarian cancer by targeting hTERT［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2018，22（6）：1622-1628. doi：10.26355/eurrev_201803_14569.

［25］ ROD?N L，GONZ?LEZ-JUNC? A，INDA M M，et al. Active CREB1 promotes a malignant TGFβ2 autocrine loop in glioblastoma［J］. Cancer Discov，2014，4（10）：1230-1241. doi：10.1158/2159-8290.CD-14-0275.

（2023-02-22收稿 2023-05-16修回）

（本文編輯 魏杰）