基于指紋圖譜結合一測多評法評價不同產地牻牛兒苗質量

孫仁爽，隋艷艷，閆 紅，張立秋，顧地周，陳新連

基于指紋圖譜結合一測多評法評價不同產地牻牛兒苗質量

孫仁爽1，隋艷艷2，閆 紅3，張立秋1，顧地周4，陳新連5*

1. 通化師范學院醫藥學院，吉林 通化 134002 2. 吉林省通化振國藥業有限公司，吉林 通化 134002 3. 吉林玉仁制藥股份有限公司，吉林 通化 134002 4. 通化師范學院生命科學學院，吉林 通化 134002 5. 中山大學藥學院，廣州 廣東 510006

建立牻牛兒苗的指紋圖譜，并同時建立其中4個酚酸類成分含量的一測多評分析（quantitative analysis of multi-components by singlemarker，QAMS）方法，以期對牻牛兒苗藥材進行整體質量控制。以沒食子酸為參照峰確定共有峰，建立牻牛兒苗的高效液相色譜指紋圖譜；以沒食子酸為內標，確定柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸的相對校正因子并計算含量，實現一測多評。同時采用外標法測定4個成分的含量，比較計算值和實測值的差異。建立了牻牛兒苗的HPLC指紋圖譜，10批樣品相似度均在0.891以上；以沒食子酸為內標建立的柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸的相對校正因子分別為0.751、0.214和0.444，重現性良好，10批牻牛兒苗樣品QAMS法計算值與實測值無顯著差異。所建立的指紋圖譜結合QAMS簡便可行，可為牻牛兒苗藥材整體質量控制提供參考和依據。

牻牛兒苗；指紋圖譜；一測多評法；相對校正因子；沒食子酸；柯里拉京；老鸛草素；鞣花酸

牻牛兒苗是牻牛兒苗科牻牛兒苗屬牻牛兒苗Willd.植物的干燥地上部分[1]，用于風濕痹痛、麻木拘攣、筋骨酸痛、泄瀉痢疾。牻牛兒苗的主要化學成分為鞣質和黃酮類，包括老鸛草素、柯里拉京、鞣花酸、沒食子酸、山奈酚和槲皮素苷等[2]。近年來，隨著人們對牻牛兒苗及鞣質藥理活性研究的深入，越來越多的鞣質新活性被發掘出來，鞣質的藥理活性已不止于收斂固澀，而廣泛應用于抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肝病、止血及抗腫瘤等領域[3]。沒食子酸、柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸是牻牛兒苗主要鞣質類成分[4-5]，是牻牛兒苗抗病毒、抗腫瘤等作用的藥效物質基礎，因此本實驗選擇沒食子酸、柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸作為指標成分進行測定。《中國藥典》2020年版對牻牛兒苗藥材定量指標僅有水溶性浸出物“不得少于18.0%”。目前使用常規方法以多成分含量測定來評價牻牛兒苗藥材質量的研究已有報道[6]，但這些方法所需對照品量大，長期以來面臨著對照品難求、價格昂貴、貨源緊缺等問題，難以推廣至牻牛兒苗藥材質量控制的實際應用中。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by singlemarker，QAMS）采用單一對照品同時測定多個成分的含量，是實現中藥多成分質控的一種經濟、簡便的分析方法[7]。而中藥指紋圖譜是中藥整體質量控制的核心技術之一，可以反映不同樣品質量的均一性[8]。為解決對照品的缺乏導致的多組分同時定量的矛盾，本實驗采用高效液相色譜方法，建立了指紋圖譜結合QAMS法的牻牛兒苗質量評價方法，在較全面表征牻牛兒苗化學成分整體輪廓、評價牻牛兒苗藥材整體質量的基礎上，同時對主要成分進行含量測定，為牻牛兒苗多指標質量控制推廣提供參考[9-11]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

戴安U3000高效液相色譜儀（含P680泵、ASI-100自動進樣器、PDA100紫外二級管陣列檢測器和變色龍工作站）、Agilent1260高效液相色譜儀（含四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱和DAD檢測器）、Waters E2695高效液相色譜儀（含alliance 2695型泵、alliance 2695型自動進樣器、2489型紫外檢測器和empower3型工作站）、島津20A高效液相色譜儀（含LC-20AD泵、SPD-20A紫外檢測器、LCsolution色譜工作站、SIL20A自動進樣器、CTO-10A柱溫箱）、大連依利特1100梯度高效液相色譜儀（含恒流泵D1100、紫外-可見檢測器1100、色譜柱恒溫箱、Elitapex色譜數據工作站）和上海伍豐LC-100高效液相色譜儀（P100高壓恒流泵、UV100紫外檢測器、恒溫柱箱和WS100工作站）；KQ3200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公溫司）；CPA225D型十萬分之一電子天平（賽多利斯公司）。

1.2 試藥

色譜甲醇和色譜乙腈（邁瑞達科技公司）；甲醇和磷酸為分析純（天津市大茂化學試劑廠）；娃哈哈純凈水。對照品沒食子酸（110831-201906，質量分數以91.5%計）、柯里拉京(111623-200302，質量分數≥98%）、鞣花酸（111959-201903，質量分數以98.8%計）均購自中國食品藥品檢定研究院；老鸛草素（100503，質量分數≥98%）購自上海融禾醫藥科技有限公司。10批牻牛兒苗藥材（表1）經通化師范學院醫藥學院于俊林教授鑒定為牻牛兒苗Willd.的干燥地上部分。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱沒食子酸、柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸對照品適量，加入甲醇制成含沒食子酸232.34 μg/mL、柯里拉京120.52 μg/mL、老鸛草素50.30 μg/mL、鞣花酸150.26 μg/mL的混合對照品儲備液。

表1 10批牻牛兒苗藥材產地信息

2.2 供試品溶液的制備

取牻牛兒苗藥材粉末1 g，置具塞錐形瓶中，加入70%丙酮溶液18 mL，精密稱定，超聲（頻率100 kHz）提取60 min，濃縮，用甲醇定容至100 mL量瓶中，得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：安捷倫XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.3%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）-甲醇（C），梯度洗脫：0～5 min，95%A；0%～3% B，5%～2% C；5～10 min，95%～91% A；3%～8% B，2%～1% C；10～35 min，91%～89% A；8%～10% B，1% C；35～45 min，89%～86% A；10%～14% B，1%～0 C；45～65 min，86%～85% A；14%～15% B，0% C；65～80 min，85%～70% A；15%～16% B，0～14% C；80～90 min，70%～57% A；16%～17% B，14%～26% C；體積流量0.8 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長278 nm。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續進樣6次，以沒食子酸為參比峰，各共有峰的相對保留時間RSD為0.65%～2.74%和相對峰面積RSD為1.78%～2.69%。

2.4.2 重復性試驗 精密稱取同一批藥材粉末6份，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液進行測定，以沒食子酸為參比峰，各共有峰的相對保留時間RSD為0.87%～2.50%和相對峰面積RSD為0.32%～2.43%。

2.4.3 穩定性試驗取同一供試品溶液，在室溫下放置，分別于0、4、8、12、24 h測定，以沒食子酸為參比峰，各共有峰的相對保留時間RSD為0.57%～3.28%和相對峰面積RSD為0.76%～4.26%。

2.4.4 指紋圖譜建立及相似度評價 將上述10批樣品的AIA數據文件導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統研究版》軟件進行相似度評價[12]，設定S1為參照，多點校正、匹配，得到的10批牻牛兒苗HPLC疊加圖譜見圖1。生成的牻牛兒苗對照指紋圖譜見圖2，可作為牻牛兒苗鑒別的特征圖譜。牻牛兒苗樣品共有峰峰面積見表2，10批牻牛兒苗藥材有9個共有峰，通過對照品確認1號峰為沒食子酸、6號峰為柯里拉京、7號峰為老鸛草素、8號峰為鞣花酸。共有峰的保留時間差異較小，保留時間RSD小于0.33%；峰面積差異較大，RSD為33.88%～158.15%。可能與牻牛兒苗屬于廣分布品種，不同的生長環境影響植物的次生代謝；所采集的樣品生長年限不同；果、莖葉和花等不同藥用部位比例差異較大，藥材的不同部位有效成分含量有著顯著的差異有關。10批樣品與對照圖譜比較，相似度評價結果分別為0.992、0.985、0.986、0.987、0.994、0.991、0.891、0.909、0.973、0.997，可為牻牛兒苗藥材的品質評價提供科學依據。

圖1 10批牻牛兒苗HPLC疊加圖譜

1-沒食子酸 6-柯里拉京 7-老鸛草素 8-鞣花酸

2.5 多成分含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備 按照“2.1”項制備混合對照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備 按照“2.2”項制備供試品溶液。

2.5.3 色譜條件 色譜條件同“2.3”項。混合對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖3。

表2 10批樣品共有峰峰面積

1-沒食子酸 2-柯里拉京 3-老鸛草素 4-鞣花酸

2.5.4 標準曲線的繪制 分別精密吸取混合對照品溶液，按上述色譜條件測定，以進樣量為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），得到各成分的回歸方程及線性范圍。結果表明4個酚酸類成分在線性范圍內線性良好，結果見表3。

2.5.5 精密度試驗 取混合對照品溶液，重復進樣6次，計算各成分峰面積的相對標準偏差，結果沒食子酸的RSD為1.2%，柯里拉京的RSD為1.9%，老鸛草素的RSD為1.0%，鞣花酸的RSD為1.4%，表明儀器的精密度良好。

表3 4個酚酸類成分的標準曲線

2.5.6 穩定性試驗 取樣品溶液分別于0、4、8、12、24 h測定，樣品中沒食子酸、柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸不同時間峰面積的RSD分別為1.3%、1.7%、1.4%、1.9%。表明牻牛兒苗樣品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5.7 重復性試驗 取牻牛兒苗藥材，粉碎，取6份分別精密稱定，制備樣品溶液，測定，計算各樣品溶液中沒食子酸、柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸的含量。結果沒食子酸、柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸分別為2.05、1.24、0.42和1.45 mg/g，RSD分別為2.7%、2.3%、2.5%和2.8%，表明方法的重復性較好。

2.5.8 加樣回收率試驗 取牻牛兒苗粉末約1 g，精密稱定6份，按藥材中的量和對照品量1∶1左右加入相應的對照品溶液[13]，制備樣品溶液，計算平均回收率，沒食子酸、柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸的平均回收率分別為101.3%、99.5%、103.1%、99.8%，RSD分別為2.3%、1.9%、2.5%、1.7%，表明方法的準確性較高。

2.6 一測多評方法建立

2.6.1 相對校正因子（）計算 在一定的線性范圍，成分的量（質量或濃度）與檢測器響應成正比。在多指標（s，a，b，…，，…）質量評價時，以藥材中某一典型有效成分作內參物（s），建立內參物與其它待測成分（a，b，…，，…）間的（sa、sb、sc，…），按下式計算：

si＝s/f＝s×C/s×A

s為內參物對照品s峰面積，s為內參物對照品s濃度，A為某待測成分對照品峰面積；C為某待測成分對照品濃度[15]

取混合對照品溶液進樣，記錄各成分的峰面積，以沒食子酸為內參物，計算其他組分與內參物的。結果表明，以沒食子酸為內參物，其他成分的的RSD均小于3%，結果見表4。柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸對沒食子酸的分別為0.751、0.214和0.444。

2.6.2的耐用性考察

（1）不同儀器考察：精密吸取混合對照品溶液5 μL，進樣分析。計算柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸對沒食子酸的相對校正因子。分別考察了戴安U3000、Agilent1260、Waters E2695、島津20A、依利特1100梯度和伍豐LC-100等6臺高效液相色譜儀，結果見表5，不同相對校正因子的RSD均在3%以下。

表4 牻牛兒苗中4個酚酸成分相對校正因子

表5 6臺儀器得到的相對校正因子

（2）不同實驗室考察：考察了QAMS法在不同實驗室的結果，不同實驗室測得相對校正因子見表6。相對校正因子的RSD在2.74%以下，說明不同實驗室測定結果差異較小。

2.6.3 柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸色譜峰的定位 單獨用沒食子酸做對照品進行含量測定，柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸的色譜峰準確定位非常關鍵。以柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸對沒食子酸的保留時間差和相對保留值作為考察指標，并驗證了二者在不同品牌儀器中的重復性。不同儀器目標成分間保留時間差結果見表7，不同儀器保留時間差的RSD值在0.89%～2.25%。不同儀器目標成分的相對保留

表6 不同實驗室得到的校正因子

表7 不同儀器目標成分間保留時間差

值結果見表8，RSD值在1.23%～2.14%，柯里拉京、老鸛草素、鞣花酸和沒食子酸的DAD紫外光譜圖見圖4，4個成分在220 nm和270 nm左右均有2個吸收峰，其中220 nm左右為最大吸收波長，但是2個峰的形狀和峰高的比值不同，可用于4個成分的指認。因此，采用柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸對沒食子酸的保留時間差或相對保留值結合二極管陣列檢測器的紫外光譜圖，可準確指認牻牛兒苗中的目標色譜峰。

2.6.4 QAMS法與外標法結果比較 為驗證QAMS法的準確性，本實驗采用外標法進行比較。收集10批不同產地牻牛兒苗，分別采用QAMS法和外標法測定其沒食子酸、柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸的含量，2種方法所得的各批次藥材的含量和相對誤差情況見表9。10批牻牛兒苗藥材中柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸的含量分別為0.258%～1.378%、0.284%～1.589%和0.299%～1.852%。不同產地和采收期4個成分的含量均呈現一定的動態變化，但規律不一致。其中柯里拉京在黑龍江大慶的產地含量最低，大連瓦房店的產地含量最高。老鸛草素在吉林松原市產地含量最低，吉林白城產地含量最高。鞣花酸在河北沽原縣的產地含量最低，遼寧錦州黑山縣的產地含量最高[15]。兩法所得到的含量值之間用Pearson相關系數進行比較，結果柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸計算值與實測值的簡單相關系數均為1，說明兩法得到的含量的相似性極高；兩種方法得到的柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸含量的相對誤差為 0.11%、0.29%和0.23%，說明QAMS法可準確測定牻牛兒苗中沒食子酸、柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸的含量。

表8 不同儀器目標成分的相對保留值

圖4 4個成分的DAD紫外光譜圖

3 討論

本實驗選用70%丙酮為溶劑對牻牛兒苗中的總鞣質進行提取，通過干酪素法對總鞣質含量進行測定，確定牻牛兒苗總鞣質的最佳提取工藝[16]。鞣質的經典含量測定方法有很多種，最常用的有皮粉法、高錳酸鉀法、干酪素法、絡合滴定法、比色法和分光光度法。皮粉法適用的范圍非常廣，但是耗用樣品多，測定時間長，而且沒有選擇性，其測定結果往往偏高。同皮粉法一樣，高錳酸鉀法選擇性小，易受樣品中還原性物質干擾，誤差較大。干酪素法測定鞣質含量的優點在于干酪素能有選擇性地結合有生理活性的鞣質，因此測出來的是有療效的鞣質，而無療效的鞣質，如鞣酐則不被測定。

表9 QAMS法和外標法測定4種成分的含量與相對誤差

本實驗通過高效液相色譜儀的二極管陣列檢測器得到的三維圖譜比較發現，以278 nm檢測波長能夠較好地檢測出牻牛兒苗藥用植物的主要有效成分，故選擇278 nm作為測定波長。

本實驗采用HPLC法建立了牻牛兒苗的指紋圖譜，采用QAMS的質量控制方法，一次分析中可同時測定4個成分的含量。10批牻牛兒苗藥材共標定了9個共有峰，所有樣品的相似度均高于0.891，所建立的指紋圖譜可用于牻牛兒苗藥材的整體質量評價。本實驗通過對照品確認了4個共有峰，并同時建立了QAMS的含量測定方法。以沒食子酸為內標，柯里拉京、老鸛草素和鞣花酸在278 nm下的校正因子分別為0.751、0.214和0.444。以QAMS法和外標法計算得到的含量結果之間無明顯差異，表明所建立的QAMS方法準確，可用于牻牛兒苗藥材的多成分含量測定。QAMS法結合指紋圖譜技術，既發揮QAMS法簡便、易行、經濟的優點，又體現指紋圖譜整體、全面的優勢。指紋圖譜與含量測定采用同一方法，簡化了分析過程，降低分析成本。所建立的方法同時達到定性、定量2個目的，可作為牻牛兒苗藥材的質量評價方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Application of fingerprint combined with quantitative analysis of multi-components with a single-marker in quality evaluation of

SUN Ren-shuang1, SUI Yan-yan2, YAN Hong3, ZHANG Li-qiu1, GU Di-zhou4, CHEN Xin-lian5

1. Medical College ,Tonghua Normal Univetsity,Tonghua 134002, China 2. Jilin Tonghua Zhenguo Pharmaceutical Co.,Ltd, Tonghua 134002, China 3. Jilin Yuren Pharmaceutical Co., Ltd, Tonghua 134002, China 4. College of Life Sciences,Tonghua Normal Univetsity, Tonghua 134002, China 5. School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat?sen University, Guangzhou 510006, China

To establish the fingerprint ofWilldand a single standard for determination of multiple components method was used to determine the content of four main components simultaneously, in order to control the overall quality ofUsing gallic acid as the reference peak, the common peaks were determined to establish HPLC fingerprint ofGallic acid was selected as internal reference and the relative correction factors (RCF) of four components were calculated and the contents were calculated by QAMS. Meanwhile, the contents of four components inwere determined by external standard method. The accuracy and feasibility of QAMS was evaluated by comparing the results between the measured values by external standard method and calculated values by QAMS.The HPLC fingerprint ofwas established and the similarity of fingerprints of 10 batches of test samples were above 0.891. The RCF of corilagin,geraniin and ellagic acid were 0.751, 0.214 and 0.444 and showed good reproducibility. The contents of four components showed no significant difference in the 10 batches ofdetermined by external standard method and QAMS.The established fingerprint combined with QAMS method are simple and feasible, which can provide some reference and basis for the overall quality control of

Willd.; fingerprint; QAMS; relative correction factor; gallic acid; corilagin;geraniin; ellagic acid

R286.2

A

0253 - 2670(2023)21 - 7186 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.027

2023-05-16

國家自然科學基金項目（81973431）；通化師范學院應用研究項目—中藥質量評價研究（01054）

孫仁爽，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向為中藥藥效物質基礎和質量控制研究。

通信作者：陳新連，女，博士，研究方向為中藥資源及分子生藥學。E-mail: 804590217@qq.com

[責任編輯 時圣明]