基于特征圖譜結合化學計量學和一測多評法的薤白質量評價

孟俊華，劉 媛，占慧慧，唐 宏，崔培梧*

基于特征圖譜結合化學計量學和一測多評法的薤白質量評價

孟俊華1, 2, 3，劉 媛1, 2, 3，占慧慧1, 2, 3，唐 宏1, 2, 3，崔培梧1, 2, 3*

1. 湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208 2. 國家中醫藥管理局中藥藥性與藥效三級科研實驗室，湖南 長沙 410208 3. 湖南中醫藥大學菌物藥研究室，湖南 長沙 410208

建立薤白特征圖譜分析方法，并結合化學計量學和一測多評法（quantitative analysis of multi-components with a single-marker，QAMS）開展薤白質量控制研究。采用HPLC方法，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-超純水溶液為流動相梯度洗脫，體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長261 nm，進樣量20 μL，建立薤白特征圖譜，接著采用聚類分析（clustering analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least square method-discriminant analysis，OPLS-DA）對不同批次薤白飲片進行化學模式識別分析，實現數據集的可視化。同時以腺苷為內參物建立QAMS法，建立內參物與胞苷、尿苷、鳥苷的相對校正因子，采用外標法（external standard method，ESM）與QAMS法分別測定12批次薤白樣品中胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷4種核苷類成分的含量，以驗證QAMS法結果的可靠性。建立的HPLC特征圖譜方法較全面地反映了薤白藥材的化學成分，分析方法專屬性強，準確可靠；化學計量學分析結果基本一致；并通過OPLS-DA找出了3種可能的標志性成分；QAMS法與外標法測定結果之間無顯著差異。建立的薤白特征圖譜分析方法、化學計量學方法、多指標成分QAMS法可為薤白和其他植物藥的質量控制與評價提供參考。

薤白；特征圖譜；化學計量學；胞苷；尿苷；鳥苷；腺苷；一測多評；外標法

薤白為百合科（Liliaceae）蔥屬L.植物小根蔥Bge.或薤G. Don.的干燥鱗莖，別名野薤、野蔥、薤白頭[1]，我國除新疆、青海外各省區均產，俄羅斯、朝鮮和日本也有分布[2]。薤白在臨床廣泛用于治療胸痹、心絞痛、哮喘等疾病，皂苷類化合物是其主要藥效成分[3]。國家衛生部于20世紀90年代將薤白列入藥食同源植物名錄[4]，因此薤白也可用于功能性食品的開發，具有廣泛的應用前景。薤白主要含有甾體皂苷、揮發油、苯丙素類化合物、氨基酸、多糖與脂肪酸等多種生物活性成分[5-7]，具有抗腫瘤[8]、調血脂和抗動脈粥樣硬化[9]、抗痙攣[10]、抗氧化[11]等活性。近年來，薤白的化學成分和藥理作用已經得到深入的研究，但其質量控制研究仍需加強，《中國藥典》2020年版也暫無薤白有效成分［含量測定］項標準[1]，而中藥又有多成分多靶點的特點，且其品質易受產地和加工方式影響。因此，單一的成分難以全面評價中藥質量的優劣，通過多指標同步質量控制反映中藥質量已成為當前中藥質量評價領域的共識。

化學計量學是通過統計學或數學方法結合計算機科學將對化學體系的測量值與體系的狀態之間建立聯系[12]。而一測多評法（quantitative analysis of multi-components le-marker，QAMS）是采用一種相對易得、價廉的內參比物質對照品，實現對多個成分的同時測定[13]。特征圖譜結合化學計量學和一測多評法可以根據多變量數值分析把同類與異類中藥材區別開實現數據集的可視化[14]。本研究通過上述方法對薤白藥材進行分類和質量評價，為薤白的鑒定和質量評價提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀；皖儀3100型高效液相色譜儀、EX224ZH型萬分之一電子分析天平（OHAUS公司）；JS-40型超聲波清洗儀（常州鴻澤實驗科技有限公司），Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Welch Ultimate XB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent 5 TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent XDB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Synergi Hydro-RT C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 材料

對照品胞苷（批號T16J7X9000）、尿苷（批號M02HS176753）、鳥苷（批號D25GS172600）購自上海源葉生物科技有限公司，質量分數均為99%；腺苷（批號RP210402，質量分數為99.85%）購自成都麥德生物科技有限公司；乙腈為色譜純，水為怡寶純凈水，其余試劑為分析純。薤白樣品來源見表1，由湖南中醫藥大學藥學院中藥資源中心王智副教授鑒定為薤G. Don.和小根蔥Bge.。

2 方法與結果

2.1 色譜方法

色譜柱為 Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-超純水（B），梯度洗脫：0～17 min，0.5% A；17～18 min，0.5%～5% A；18～30 min，5%～9% A；30～32 min，9% A；32～42 min，9%～11% A；42～45 min，11%～ 0.5% A；45～50 min，0.5% A；體積流量1.0 mL/min；檢測波長261 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。色譜圖如圖1所示。

表1 樣品信息

2-胞嘧啶核苷 5-尿嘧啶核苷 6-鳥嘌呤核苷 8-腺嘌呤核苷

2.2 對照品儲備液的制備

精密稱取對照品適量，加10%甲醇溶解制成含胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷質量濃度分別為5.016、14.884、15.120、14.960 μg/mL的混合對照品溶液用作外標法定量和色譜峰指認。另精密稱取適量對照品加10%甲醇溶解制成含胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷質量濃度分別為10.20、34.20、35.40、35.00 μg/mL的混合對照品溶液STD1，后將STD1用10%甲醇分別稀釋至其0.8、0.6、0.4、0.2、0.1倍的混合對照品溶液STD2、STD3、STD4、STD5、STD6用作方法學線性考察[15]。置于4 ℃冰箱，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取薤白樣品粉末1.0 g（過60目篩），精密稱定，置于100 mL干燥具塞錐形瓶中，加10%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率240 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，用10%甲醇補足減失的質量，濾過，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 分別精密吸取胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷對照品溶液及混合對照品溶液、薤白對供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定。結果表明各成分保留時間基本一致，最大紫外吸收波長高度吻合、各色譜峰分離度均大于1.5，表明方法專屬性良好。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液S1，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，每次20 μL，記錄峰面積，計算RSD值。結果顯示1～9號峰峰面積RSD分別為1.87%、1.11%、1.54%、1.08%、0.49%、0.73%、0.86%、0.43%、1.01%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取同一批號樣品（S1），按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以腺苷峰為參照，記錄各色譜峰相對保留時間與相對峰面積。結果顯示1～9號峰相對保留時間RSD分別為0.35%、0.17%、0.46%、0.68%、0.75%、0.22%、0.31%、0.07%、0.18%，相對峰面積RSD分別為1.07%、1.44%、0.82%、1.15%、1.34%、0.54%、0.63%、0.70%、0.59%，表明方法重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（S1）適量，分別于0、2、4、8、12、18、24 h以“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄各個測定時間點的峰面積，計算RSD值。結果顯示1～9號峰峰面積RSD分別為1.32%、1.49%、1.63%、0.98%、1.01%、0.69%、0.75、0.63%、0.47%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5 特征圖譜的分析及評價

2.5.1 特征圖譜的建立及共有峰歸屬 12批薤白樣品分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，將色譜信息導入中藥色譜指紋圖譜相似度軟件進行Mark峰匹配（版本：2012.130723），共確定9個共有峰，共有峰見圖2。其中共有峰中8號峰（腺苷）分離度較好，響應較高，故以8號峰（腺苷）為參照峰（S峰）。經與對照品色譜峰保留時間相比對和DAD光譜分析，共指認出4個特征峰，分別為1號峰胞苷、5號峰尿苷、6號鳥苷、8號峰腺苷。

2.5.2 相似度評價 以薤白12批樣品9個共有峰峰面積為變量，導入Origin Pro 2021軟件進行樣品相關性分析，并繪制相關系數圖。圖3中，紅色表示正相關，藍色表示負相關，圈的朝向代表正負相關性，圈越大越圓相關系數絕對值越小，值代表樣品相關性顯著程度，從根據9個共有峰峰面積數據繪制的相關系數圖來看樣品S1～S12全部呈現正相關，整體相似度在0.80～1.00，有一定的波動情況，樣品S3、S11、S12的相似度相對較低，表明不同產地不同批次的薤白樣品質量存在著差異。2.5.3 主成分分析（principal component analysis，PCA） PCA分析是通過降維的思想在損失很少信息的前提下將多個互相關聯的變量轉化成少數幾個互不相關的綜合指標的統計學方法,可以用較少的變量去解釋原始多變量中的大多數變異[16]。利用12批次薤白樣品的9個共有峰峰面積為變量，結果導入SPSS 26.0軟件，計算主成分特征值、方差貢獻率及因子載荷矩陣。結果如表2、3所示。第1主成分的特征根為4.321，能夠解釋的總變異為58.552%，第2主成分的特征根為1.816，能夠解釋的總變異為16.130%，第3主成分的特征根為1.740，能夠解釋12.844%的變異，因此提取主成分3個，累積貢獻率可達87.526%，可代表薤白樣品87.526%的信息。以絕對值為依據，第1主成分的信息主要來自于胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷、9號、7號、1號峰峰面積、第2主成分的信息主要來自于4號峰峰面積、第3主成分的信息主要來自于3號峰峰面積。將12批次薤白樣品的9個共有峰峰面積為變量導入SIMCA 14.1軟件建模，得到PCA得分圖（圖5），PCA得分圖表明以第1主成分為依據，t[1]軸將12批樣品分成2部分，表明12批次薤白樣品質量存在著較大差異。

圖2 薤白HPLC特征圖譜共有峰

表2 PCA特征值及方差貢獻率

表3 PCA因子載荷矩陣

2.5.4 正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）分析 因為PCA為一種無監督的模型驗證方法，并不能夠對所有樣本加以區分以使得每個樣本對模型都有相同的貢獻。所以，當樣本組間差異大而組內差異較小時，PCA分析難以區分和發現組內差異。因此有必要采用一種有監督模式的OPLS-DA分析[17]。

為進一步尋找導致薤白質量差異的標志成分，本研究將12批薤白中9個共有峰的相對峰面積導入SIMCA 14.1軟件，以獲得OPLS-DA分析模型，見圖5。結果顯示，在模型中解釋能力參數2、2分別為0.940和0.965，預測能力參數2（cum）為0.903，表明該模型預測能力較好，12批薤白共有峰峰面積均落在95%置信區間內，將樣品根據PCA分析結果分為2類。對所建立的OPLS-DA模型進行200次置換檢測，結果顯示2＝(0.0，0.512)，2＝(0.0，?2.22)，由于2擬合直線軸截距為?2.22，為負數，且最右側點2和2均高于左側，所以模型未出現過擬合的情況[18]，表明所構建的OPLS-DA模型可以作為判別12批次薤白質量成分的差異。由變量貢獻值圖（圖5）可見，VIP值大于1的有5號峰（尿苷）、6號峰（鳥苷）、8號峰（腺苷），VIP值分別為1.80361、1.305 27、1.201 45。因此，此3種成分可能是薤白的主要差異成分，可作為薤白質量標準［含量測定］項的參考組分[19]。

圖4 PCA得分圖

圖5 OPLS-DA得分圖(A)、置信檢測圖(B) 和變量貢獻值圖(C)

2.5.5 聚類分析 將9個薤白HPLC特征圖譜共有峰峰面積作為變量導入Origin Pro 2021軟件進行聚類分析時，行標簽為樣本編號，列標簽為9個共有峰名稱，對行數據進行標準化使得行數據具有可比性，采用平均聚類方法、曼哈頓距離類型，得到圖7，由藍至黃至紅的顏色及顏色深淺變化則表示薤白9個特征共有峰的峰面積差異程度。聚類分析將12批樣品分為2大類，S3、S11、S12被分為一大類，其余樣品則被分為另一大類。由此可知，不同薤白樣品的特征成分含量可能存在顯著差異，也不可僅僅依靠薤白產地、個頭大小等對其質量進行評價，基于特征圖譜結合化學計量學和QAMS法的薤白分析方法可為薤白的品質評價提供快速、準確的分析策略。

圖6 12批次薤白樣品聚類分析熱圖

2.6 多指標成分的含量測定

為了對薤白更好地進行質量評價，在特征圖譜的基礎上，建立了QAMS方法測定胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷4個成分含量。

2.6.1 供試品溶液的制備 同“2.1”項。

2.6.2 對照品溶液的制備 同“2.2”項。

2.6.3 色譜條件 同“2.3”項。

2.6.4 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6，20 μL，注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項色譜條件，測定對照品的色譜峰面積。以各對照品濃度（）對相應峰面積（）進行回歸處理，得4個薤白核苷成分的回歸方程及線性范圍。結果表明4個薤白核苷成分的線性關系良好，如表4所示。

表4 4個核苷成分的線性回歸方程

2.6.5 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液S1，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，每次20 μL，記錄峰面積，計算RSD值。結果顯示胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷峰的峰面積RSD分別為1.11%、0.79%、0.73%、0.43%，表明儀器精密度良好。

2.6.6 重復性試驗 精密稱取同一批號樣品（S1），按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以腺苷峰為參照，記錄各色譜峰相對保留時間與相對峰面積。結果顯示胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷峰相對保留時間RSD分別為0.17%、0.75%、0.22%、0.18%，相對峰面積RSD分別為1.44%、1.34%、0.54%、0.70%，表明方法重復性良好。

2.6.7 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（S1）適量，分別于0、2、4、8、12、18、24 h以“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄各個測定時間點的峰面積，計算RSD值。結果顯示胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷號峰峰面積RSD分別為1.49%、1.01%、0.69%、0.63%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.6.8 加樣回收率試驗 精密稱取適量已測定含量樣品（S1），按“2.3”項方法將稱樣量減半平行制備6份供試品溶液，并以1︰1的比例加入定量對照品，以“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷的平均加樣回收率分別為97.88%、103.4%、99.22%、97.63%，RSD分別為1.60%、0.74%、2.27%、2.01%。

2.6.9 相對校正因子（）的測定 在建立的梯度洗脫HPLC色譜條件“2.1”下，取混合對照品溶液分別進樣5、10、15、20、25、30、35 μL[20]，記錄各成分的峰面積，以腺苷為內參物，計算待測成分與內參物的[21]。

＝(A/C)/(A/C)

A為待測成分峰面積，C為待測成分量濃度，s為內參物峰面積，s為內參物濃度

結果表明，腺苷作為內參物時其他成分的的RSD均小于3%，見表5。

2.6.10 不同色譜柱對的影響 取“2.2”項混合對照品溶液，進樣量為20 μL，采用皖儀3100高效液相色譜儀，分別考察Agilent 5 TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent XDB C18、Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Synergi Hydro-RT C18共4根色譜柱對各核苷的影響，結果胞苷、尿苷、鳥苷的RSD依次為0.70%、0.57%、0.77%，表明色譜柱的更換對各成分無顯著性影響，見表6。

表5 3個待測成分的f值

表6 不同色譜柱對f的影響

2.6.11 不同體積流量對的影響 實驗采用皖儀3100高效液相色譜儀系統，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，考察不同體積流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）對4個核苷值的影響，各成分之間值重復性良好，其RSD均小于3%，表明不同體積流量對各成分值無顯著性影響，見表7。

表7 不同體積流量對f值的影響

2.6.12 不同柱溫對的影響 實驗采用皖儀3100高效液相色譜儀系統，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，分別在不同柱溫（25、30、35 ℃）條件下測定核苷的值，結果顯示各成分之間的RSD均小于3%，表明柱溫對各成分的值無顯著性影響，見表8。

表8 不同柱溫對f值的影響

2.6.13 不同儀器對的影響 實驗分別采用皖儀3100，Agilent 1200高效液相色譜儀系統，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，考察不同儀器對薤白核苷值的影響，結果各成分值的RSD均小于5%，見表9。

2.6.14 待測成分色譜峰定位 色譜峰的準確定位是保證QAMS法應用的前題[22-23]，為了僅在采用腺苷為對照品時，能夠確認胞苷、尿苷、鳥苷色譜峰的位置，從而通過獲得的值同時計算另外3個成分的含量，達到QAMS的目的，故取“2.2”項混合對照品溶液，考察了采用不同儀器（儀器1：皖儀3100，儀器2：Agilent 1200）、不同色譜柱（柱1：Agilent Eclipse Plus C18、柱2：Agilent 5 TC-C18（2）、柱3：Welch Ultimate XB-C18）和不同操作人員（A、B、C）時另外3個薤白核苷成分與腺苷之間的保留時間差和相對保留時間[22, 24]。考察結果表明，另外3個薤白核苷成分和內參物腺苷之間的保留時間差值和相對保留時間值波動較小，其RSD均小于5%（表10、11），因此保留時間差值法和相對保留時間法都可用于色譜峰定位。

表9 不同儀器對f值的影響

表10 保留時間差值

表11 相對保留時間

2.6.15 QAMS法與外標法測定結果比較 12批次薤白樣品，采用所建立的HPLC方法，首先通過外標法（ESM）分別計算出薤白樣品中胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷的含量，然后以腺苷為內參物，并通過測得的，根據QAMS的公式定量計算[22]。

W=(W×A)/(×A)

W為待測成分量，A為待測成分峰面積，s為內參物量，A為內參物峰面積，為待測成分與參照物分別計算出其余3個成分的含量

將ESM實測值與QAMS計算值進行配對檢驗[25]，結果值均＞0.05，表明2種方法測定結果之間無顯著差異，提示建立的QAMS法有較好的準確性和可行性，見表12。

表12 ESM和QAMS測定12批薤白樣品中4個核苷的含量

3 討論

3.1 提取條件和色譜條件的優化

本研究對不同提取溶劑（10%甲醇、25%甲醇、10%乙醇和純水），不同料液比（1∶50、2∶50、3∶50），不同提取方式時間（加熱回流、超聲），不同提取時間（20、30、40 min），不同流動相水相組成（純水、0.1%甲酸、0.1%磷酸）進行考察。最終選定以10%甲醇作為提取溶劑，料液比1∶50，超聲30 min鐘作為樣品的提取方法。考查了Agilent 5 TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Welch Ultimate XB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（250mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱的分離效果。結果表明，以Agilent Eclipse Plus C18色譜柱分離效果最好。并分別考察了流動相為甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%磷酸水時供試品溶液HPLC色譜圖中6個共有峰成分的分離狀況，發現流動相水相為0.1%甲酸水時或者0.1%磷酸水時，譜圖基線浮動大，峰形較差，因此選擇甲醇-純水為流動相。

3.2 QAMS法用于薤白多組分含量測定質量控制的合理性

根據QAMS法的指導原則，內標物應選擇藥材中的有效成分或指標成分，且應與待測成分為同類成分或母核相同，光譜特性基本一致[15]，因腺苷為薤白治療心絞痛、心肌梗塞主要有效成分[26]。且性質相對較穩定，峰形對稱度、分離度均良好，因此本研究所建立的QAMS法選擇以腺苷作為內參物，結合OPLS-DA分析篩選出的變量VIP值貢獻大于1的有尿苷、鳥苷、腺苷，因此，分別以此4類核苷作為薤白多組分含量測定的質控成分，建立了內參物腺苷與待測成分胞苷、尿苷、鳥苷的，構建了能夠適用于同時測量薤白多組分的QAMS法，同時以ESM法驗證QAMS法的準確性。結果表明QAMS法和ESM法測定薤白中胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷4種核苷成分準確度并無明顯差異，因此可用QAMS法代替外標法對薤白中4核苷類成分進行含量測定，既降低了實驗中對照品、儀器的投入成本，同時保證了檢測的靈敏度和準確性，可更加快速準確地對薤白質量做出評價。但是從測量值結果來看，各批次薤白藥材4種核苷類成分含量存在一定的批間差異，同時也表明了對于擁有多組分多靶點共同作用的中藥質量評價應建立多指標檢測的重要性。

綜上所述，本研究建立了準確可靠的可鑒別和分析薤白的HPLC方法；并從所建立的特征圖譜上指認了9個共有峰，采用SPSS、SIMCA、Origin軟件對12批不同產地薤白飲片樣品進行相似度分析、PCA、OPLS-DA分析。建立了內參物腺苷與待測成分胞苷、尿苷、腺苷的，通過對12批市售不同產地薤白飲片中4個核苷成分含量的測定，以傳統ESM法測定結果驗證QAMS測定結果的準確性，為薤白藥材的全面質量評價提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation ofbased on fingerprint HPLC spectrum combined with chemometrics and quantitative analysis of multi-components with a single-marker

MENG Jun-hua1,2,3, LIU Yuan1,2,3, ZHAN Hui-hui1,2,3, TANG Hong1,2,3, CUI Pei-wu1,2,3

1. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Tertiary Research Laboratory of Medicinal Properties and Efficacy of Traditional Chinese Medicines, National Administration of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China 3. Mycomedicine Research Lab, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To establish an analytical method used for quality control of Xiebai (AMB) employing HPLC characteristics spectrum combined with stoichiometry and quantitative analysis of multi-components with a single-marker methodHPLC was performed on Agilent 1200 HPLC system equipped with DAD detector and Agilent Eclipse Plus C18column (250 mm × 4.6mm, 5μm), using methanol-ultrapure water solution as mobile phase employing gradient elution procedure with the flow rate of 1.0 mL/min, column temperature of 30 ℃, detection wavelength of 261 nm, and injection volume of 20 μL. Cluster analysis, principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis were used to identify chemical patterns of different batchesof AMB at a visualization analysis level. The QAMS method was also adopted to evaluate the main components contents including adenosine, cytidine, uridine, and guanosine inAMB samples with adenosine as the internal reference, and the relative correction factors of the internal reference and cytidine, uridine and guanosine were established subsequently. Finally, to confirm validity of QAMS method, the comparison of the contents data analyzed by QAMS method and external standard method (ESM) was also carried out.The established HPLC characteristics spectrum method can fully reflect the chemical composition of AMB. The analysis method showed specific, accurate and reliable characteristics and the relative correction factors have good repeatability. Moreover, the results of chemometric analysis were in accord with data calculated from methods mentioned above. In addition, three possible characteristic components were identified by OPLS-DA and there was no significant difference found between QAMS and ESM, which can provide a reference for quality evaluation of AMB.The established HPLC fingerprint spectrum method, stoichiometry method and multi-index components analytical method with QAMS can provide a reference for quality control and evaluation of AMB and other botanic drugs.

; HPLC fingerprint spectrum; chemometrics; adenosine; cytidine; uridine; guanosine; quantitative analysis of multi-components with a single marker; external standard method

R286.2

A

0253 - 2670(2023)21 - 7176 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.026

2023-03-02

國家自然科學基金資助項目（81973211/C0033375）；湖南省中醫藥科研計劃項目［D2022139（A2022005-17）］；湖南省大學生創新創業訓練計劃項目（湘教通［2022］174號-2918）；湖南中醫藥大學研究生創新課題（校行研字［2022］20號-2022CX87）；湖南中醫藥大學“十四五”重點學科-生物工程學科（校行發規字[2023]2號）

孟俊華，男，碩士研究生，研究方向為中藥質量與藥效分析。

通信作者：崔培梧，男，副教授，碩士生導師，研究方向為中藥質量及藥效分析。E-mail: cuipeiwu@126.com

[責任編輯 時圣明]