金藤清痹顆粒治療急性痛風性關節炎的作用機制研究

衛博文，高晶月#，劉 維*，王愛華，岳青云，顧慶香，卡玉秀，林芳芳，茍小平，王 文

金藤清痹顆粒治療急性痛風性關節炎的作用機制研究

衛博文1, 2，高晶月1, 2#，劉 維1, 2*，王愛華1, 2，岳青云1, 2，顧慶香1, 2，卡玉秀1, 2，林芳芳1, 2，茍小平1, 2，王 文1, 2

1. 天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193 2. 國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300193

應用網絡藥理學分析金藤清痹顆粒治療急性痛風性關節炎（acute gouty arthritis，AGA）的作用機制，并建立AGA大鼠模型進行驗證。在清熱解毒、活血止痛治法指導下，通過TCMSP數據庫搜集金藤清痹顆粒的活性成分及靶點，利用GeneCards、NCBI數據庫等搜集AGA相關靶點，與金藤清痹顆粒作用靶點整合后，構建共有靶點蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡和“金藤清痹顆粒-中藥-活性成分-靶點-AGA”網絡，并進行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。雄性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、秋水仙堿（0.3 mg/kg）組和金藤清痹顆粒低、中、高劑量（1.05、2.10、4.20 g/kg）組，每組6只，踝關節注射單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）晶體建立AGA大鼠模型。采用游標卡尺測量大鼠踝關節直徑，計算踝關節腫脹度；采用全自動生化儀檢測血清尿酸（serum uric acid，SUA）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察踝關節組織病理變化；采用qRT-PCR、ELISA和Western blotting檢測踝關節組織及血清中關鍵靶點和信號通路的表達。共檢索到金藤清痹顆粒110種活性成分、212個作用靶點，272個AGA治療靶點，共有靶點29個，關鍵靶點有白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）及IL-6，涉及TNF信號通路、IL-17信號通路和NOD樣受體信號通路等。大鼠踝關節注射MSU晶體后明顯腫脹（＜0.01），SUA及CRP顯著升高（＜0.05、0.01），滑膜組織增生明顯、結構紊亂，有大量炎癥細胞浸潤，NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、NIMA相關蛋白激酶7（NIMA-related kinases 7，NEK7）、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）、IL-18、IL-1β、IL-6及TNF-α表達水平明顯升高（＜0.01）；秋水仙堿或金藤清痹顆粒治療后，有效緩解踝關節腫脹（＜0.05、0.01），SUA及CRP均顯著降低（＜0.05、0.01），關節滑膜增生、炎癥細胞浸潤均得到改善，同時顯著抑制IL-1β、TNF-α及IL-6等靶點和NOD樣受體信號通路的表達（＜0.05、0.01）。金藤清痹顆粒對AGA大鼠具有明顯的保護作用，其機制可能與抑制NOD樣受體信號通路的異常激活，降低炎癥因子水平，改善關節滑膜增生、炎癥細胞浸潤有關。

網絡藥理學；金藤清痹顆粒；急性痛風性關節炎；NOD樣受體信號通路；炎癥因子；清熱解毒；活血止痛

急性痛風性關節炎（acute gouty arthritis，AGA）是由于機體嘌呤代謝異常和（或）尿酸排泄減少，導致血尿酸升高，單鈉尿酸鹽析出、沉積于關節所致的疾病，具有高發病率和致殘率。近年來，隨著生活水平提高，痛風患病率呈逐年上升趨勢，且發病年齡趨于年輕化[1-2]。2020年美國風濕病學會痛風管理指南[3]推薦秋水仙堿、非甾體抗炎藥和糖皮質激素為治療AGA的藥物。西醫可有效緩解患者癥狀，但目前用于治療AGA的藥物會導致患者出現中樞神經系統及胃腸道不良反應[4]，因此有必要尋找安全有效的治療藥物。中醫藥治療AGA歷史悠久，具有療效顯著、不良反應小等優勢，在長期臨床實踐中積累了豐富經驗。

金藤清痹顆粒為“四妙勇安湯”加減化裁而來，由金銀花、青風藤、鹿銜草、山慈菇、蜈蚣等11味中藥組成，有清熱解毒、活血止痛之功，具有抗炎、止痛、解熱和免疫調節作用[5-6]。臨床上金藤清痹顆粒也常用于AGA的治療，但相關研究鮮有報道。本研究以劉維教授的“毒痹論”為指導思想[7-8]，以金藤清痹顆粒作為清熱解毒、活血止痛治法的載體，將網絡藥理學[9]與動物實驗相結合，通過踝關節注射單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）晶體建立AGA大鼠模型，評價金藤清痹顆粒治療AGA的療效，并探索其相關作用機制，以期為臨床治療提供理論依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠36只，6周齡，體質量（200±10）g，購自北京斯貝福實驗動物有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010。大鼠飼養于天津市南開醫院清潔級動物房，12 h光照循環，普通飼料喂養，自由進食飲水。所有操作及動物處理均嚴格遵守相關動物保護及使用規定，倫理批準號NKYY-DWLL-2023-043。

1.2 藥品與試劑

金藤清痹顆粒（國藥準字Z20123065，批號28180061）由魯南厚普制藥有限公司提供；MSU（批號BCCF5862）、聚山梨酯80（批號096K00781）購自美國Sigma公司；秋水仙堿片（國藥準字H20113208，批號20220302）購自廣東彼迪藥業有限公司；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號分別為2023032947R、2023032990R、2023032994R、2023032980R）購自江蘇酶免實業有限公司；HRP標記的羊抗鼠IgG二抗（批號20000671）、HRP標記的羊抗兔IgG二抗（批號20000679）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）抗體（批號00121900）、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）抗體（批號00122309）、β-actin抗體（批號10025459）購自美國Proteintech公司；NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）抗體（批號5123）購自美國SAB公司；凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）抗體（批號10w2797）、NIMA相關蛋白激酶7（NIMA-related kinases 7，NEK7）抗體（批號59y9138）購自美國Affinity公司；RNA提取試劑盒（批號M3211080）購自上海翌圣生物科技有限公司；反轉錄試劑盒（批號0202122021）、熒光定量預混液（批號0202010531）北京蘭博利德生物科技有限公司；引物序列由上海生工設計合成。

1.3 儀器

ASP300S型自動脫水機、HistocoreArcadia H包埋機、RM2265型超薄全自動半薄輪式切片機（德國Leica公司）；BX43型正置光學顯微鏡、AU480型全自動生化儀（日本Olympus公司）；Grinder-96型研磨儀（杭州佑寧儀器有限公司）；54178型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；Colibri超微量分光光度計（德國Berthold Technologies公司）；ABI7500型qRT-PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Synergy II全波段酶標儀（美國Bio-Tek公司）；1645050型MINI電泳儀、1703810型垂直電泳系統、1658004型濕法電轉印系統（美國Bio-Rad公司）。

1.4 數據庫與軟件

TCMSP數據庫（http://tcmspw.com/）；Uniprot數據庫（http://www.uniprot.org/）；GeneCards數據庫（http://www.genecards.org/）；NCBI數據庫（https:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）；OMIM數據庫（https:// omim.org/）；String數據庫（https://string-db.org/）；微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）；上海生工（https://www.sangon.com/）；Cytoscape v3.7.2軟件；Rv4.2.1軟件；SPSS 20.0軟件。

2 方法

2.1 網絡藥理學分析

2.1.1 金藤清痹顆粒成分及靶點搜集 分別以金藤清痹顆粒的中藥“金銀花”“青風藤”“鹿銜草”“山慈菇”“蜈蚣”“白花蛇舌草”“白芍”“當歸”“甘草”“生地黃”“玄參”為關鍵詞，在TCMSP數據庫中以口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18為條件檢索、篩選活性成分及其靶點，并用Uniprot數據庫對靶點名稱進行校正。

2.1.2 AGA靶點采集、篩選以“acute gouty arthritis”和“gouty arthritis”為關鍵詞，在GeneCards、NCBI和OMIM數據庫中搜索疾病靶點。

2.1.3 共有靶點的篩選及網絡構建 篩選金藤清痹顆粒與AGA的共有靶點，上傳至String數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI網絡，導入Cytoscape軟件呈現，并應用R軟件繪制度值直方圖。利用DAVID數據庫對共有靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，結果提交至微生信可視化，并應用Cytoscape構建“金藤清痹顆粒-中藥-活性成分-靶點-AGA”網絡。

2.2 動物實驗驗證

2.2.1 分組、造模及給藥 36只大鼠隨機分成空白組、模型組、秋水仙堿（0.3 mg/kg）組和金藤清痹顆粒低、中、高劑量（1.05、2.10、4.20 g/kg）組，每組6只。稱取400 mg MSU，加入2 mL聚山梨酯80，以生理鹽水補足至20 mL，超聲溶解后加熱攪拌，配成質量濃度為20 mg/mL的MSU晶體混懸液。除空白組外，其余各組參照Coderre等[10]方法制備AGA模型，大鼠麻醉后，用碘伏消毒大鼠右后肢踝關節，彎曲踝關節成直角，針頭從踝關節外側與脛骨呈45°插入踝關節腔內，每只注射MSU晶體混懸液0.2 mL（空白組注射等量無菌生理鹽水），用棉簽按壓幾秒避免藥液漏出，以踝關節囊的對側隆起作為成功注射的標準。造模前2 d開始，各給藥組ig相應藥物，模型組和空白組ig等體積蒸餾水，3次/d，連續給藥5 d。末次給藥2 h后，ip 10%水合氯醛麻醉，經腹主動脈采血，靜置1 h后3000 r/min離心15 min，分離血清，于?20 ℃凍存。取血后處死大鼠，剝離右側后足踝關節進行后續分析。

2.2.2 踝關節腫脹度測量 于造模前及造模后6、24、48 h，用游標卡尺測量大鼠右踝關節同一部位關節直徑，計算踝關節腫脹度。

踝關節腫脹度＝(造模后關節直徑－造模前關節直徑)/造模前關節直徑

2.2.3 血清生化指標檢測 采用全自動生化儀檢測大鼠血清尿酸（serum uric acid，SUA）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）水平。

2.2.4 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察踝關節病理 大鼠踝關節在4%多聚甲醛中固定48 h后，經脫鈣、梯度乙醇脫水后，石蠟包埋切片，常規脫蠟復水，蘇木素10 min、分化液2 s、伊紅1 min進行染色，脫水封片后在光學顯微鏡下觀察切片并采集圖像進行分析。

2.2.5 qRT-PCR檢測踝關節、、、、、、、、mRNA表達 按照試劑盒說明書提取踝關節中總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.2.6 ELISA檢測血清IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α水平 按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α水平。

2.2.7 Western blotting檢測踝關節NLRP3、ASC、Caspase-1、NEK7、GSDMD蛋白表達 取大鼠踝關節滑膜組織，加入RIPA強效裂解液，研磨儀60 Hz研磨3 min，轉至冰上裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min離心20 min后，取上清液，加入上樣緩沖液混勻，100 ℃金屬浴10 min使蛋白變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育1 h后顯影曝光，采用Image J軟件分析條帶灰度，檢測NLRP3、ASC、Caspase-1、NEK7、GSDMD蛋白表達情況。

3 結果

3.1 網絡藥理學分析

3.1.1 PPI網絡構建 經TCMSP數據庫及相關文獻檢索，納入金藤清痹顆粒110個活性成分及212個相關靶點；經Genecard、OMIM和NCBI數據庫檢索，共獲得AGA相關靶點271個，兩者共有靶點29個，PPI網絡（圖1）中關鍵節點包括IL-1β、TNF、IL-6。

3.1.2 共有靶點富集分析 通過構建“金藤清痹顆粒-中藥-活性成分-靶點-AGA”網絡，直觀地呈現了金藤清痹顆粒治療AGA的11味中藥、110種活性成分、29個共同靶點間的關聯模式（圖2）。

GO分析顯示，金藤清痹顆粒可能干預的生物過程涉及炎癥反應、細胞凋亡等，與之有關的細胞組分涉及分泌、細胞外基質等，相對應的分子功能有氧化還原酶、細胞因子等（圖3-A）。經KEGG富集分析，前20個關鍵信號通路涉及代謝、凋亡、炎癥等相關信號通路，包括TNF信號通路、IL-17信號通路和NOD樣受體信號通路等（圖3-B）。

3.2 動物實驗驗證

3.2.1 金藤清痹顆粒對AGA大鼠踝關節腫脹度的影響 如表2所示，大鼠踝關節注射MSU晶體后逐漸發生腫脹，6 h達到高峰。與空白組比較，大鼠造模后6、24、48 h踝關節腫脹度均顯著增加（＜0.01），提示大鼠AGA模型成功。與模型組比較，秋水仙堿組各時間點踝關節腫脹度顯著降低（＜0.01）；金藤清痹顆粒中、高劑量組各時間點踝關節直徑顯著降低（＜0.05、0.01），金藤清痹顆粒低高劑量組造模后48 h踝關節腫脹度顯著降低（＜0.05）。

圖1 共有靶點PPI網絡 (A) 及top 20高靶標陣列(B)

紅色菱形代表中藥，藍色箭頭代表活性成分，墨綠色圓形代表靶點

3.2.2 金藤清痹顆粒對AGA大鼠血清SUA、CRP水平的影響 如圖4所示，與空白組比較，模型組大鼠血清SUA及CRP水平均明顯升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組SUA及CRP水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖3 共有靶點GO功能(A) 及KEGG通路(B) 富集分析

表2 金藤清痹顆粒對AGA大鼠踝關節腫脹度的影響(, n = 6)

與空白組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，圖6同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as fig. 6

3.2.3 金藤清痹顆粒對AGA大鼠踝關節滑膜組織病理變化的影響 如圖5所示，空白組大鼠踝關節組織結構清晰，滑膜細胞排列正常，無細胞增生、炎性細胞浸潤及血管充血。與空白組比較，模型組滑膜組織增生明顯、結構紊亂，大量炎性細胞浸潤，血管充血。與模型組比較，秋水仙堿組滑膜增生及炎癥浸潤程度明顯降低，血管充血明顯緩解；金藤清痹顆粒各劑量組可顯著降低AGA大鼠關節滑膜增生及炎癥浸潤程度，改善血管充血。以上結果提示，金藤清痹顆粒與秋水仙堿均具有改善AGA大鼠踝關節滑膜增生及炎癥浸潤等組織病理的作用。

3.2.4 金藤清痹顆粒對AGA大鼠踝關節滑膜組織、、、、、、、和mRNA表達的影響 如表3所示，與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織中、、、、、、、和mRNA表達水平均顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組和金藤清痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織中、、、、、、、和mRNA表達水平均顯著下降（＜0.05、0.01），金藤清痹顆粒中劑量組、、、和mRNA表達水平均顯著下降（＜0.05、0.01），金藤清痹顆粒低劑量組、、、、、、和mRNA表達水平均顯著下降（＜0.05、0.01）。

圖5 金藤清痹顆粒對AGA大鼠踝關節滑膜組織病理變化的影響(HE, ×100)

表3 金藤清痹顆粒對AGA大鼠踝關節滑膜組織NLRP3、NEK7、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達的影響(, n = 6)

3.2.5 金藤清痹顆粒對AGA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-6水平的影響 如表4所示，與空白組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-6水平均明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-6水平均顯著降低（＜0.01）。

3.2.6 金藤清痹顆粒對AGA大鼠踝關節滑膜組織NLRP3、NEK7、ASC、Caspase-1和GSDMD蛋白表達的影響 如圖6所示，與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織中NLRP3、NEK7、ASC、Caspase-1和GSDMD蛋白表達水平均顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組NLRP3、NEK7、ASC和GSDMD蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01），金藤清痹顆粒高劑量組NLRP3、NEK7、ASC、Caspase-1和GSDMD蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），金藤清痹顆粒中劑量組NEK7、ASC、Caspase-1和GSDMD蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01），金藤清痹顆粒低劑量組ASC、Caspase-1和GSDMD蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01）。

表4 金藤清痹顆粒對AGA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-6水平的影響(, n = 6)

圖6 金藤清痹顆粒對AGA大鼠踝關節滑膜組織NLRP3、NEK7、ASC、Caspase-1和GSDMD蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

AGA是尿酸鈉晶體沉積于關節腔中，募集巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞，引起大量炎性因子和趨化因子釋放，而誘發的炎癥性疾病[11]。AGA以急慢性關節炎、痛風石等為臨床特征，嚴重者可致關節畸形、腎尿酸結石、痛風性腎病及腎功能不全等病變[12]。因此，本病的治療原則和目標在于緩解急性期癥狀，維持SUA水平持續達標，減少痛風發作，減少合并癥的發生[13]。

中醫學將AGA歸屬“痹證”“歷節”“痛風”等范疇，朱丹溪最早提出“痛風”病名，《格致余論·痛風論》記載：“痛風者，大率因血受熱，已自沸騰，其后或涉冷水，或立濕地，或扇風取涼，或臥當風，寒涼外搏，熱血得寒，汗濁凝澀所以作痛，夜則痛甚，行于陰也”。在劉維教授“毒痹論”思想指導下，本研究認為AGA的病機為稟賦不足，脾腎虧虛，濕濁內停，濕濁郁久化熱，與濁毒搏結，流注經絡關節，而濕濁內停，日久阻滯氣血運氣，導致瘀血內生而發病。金藤清痹顆粒中金銀花、青風藤清熱解毒，通痹止痛，為君藥；鹿銜草、山慈菇和白花蛇舌草清熱解毒、補血活血，強筋健骨，緩急止痛，為臣藥；金銀花配伍玄參、當歸、甘草為四妙勇安湯，既能清熱解毒活血又可養陰扶正，配白芍，滋陰涼血，瀉火解毒，為佐藥；蜈蚣既可以解毒通絡止痛，又可引藥入經，直達病所，為使藥，全方共奏清熱解毒、活血止痛的功效，具有抗炎、止痛、解熱和免疫調節作用[14]。

本研究通過網絡藥理學方法構建“金藤清痹顆粒-中藥-活性成分-靶點-AGA”網絡，預測金藤清痹顆粒治療AGA的目標靶點及其潛在機制，結果顯示靶點呈現多機制多通路的多層次趨勢，主要靶點包括IL-1β、TNF及IL-6，涉及TNF信號通路、IL-17信號通路和NOD樣受體信號通路等。為了進一步驗證網絡藥理學結果，闡明金藤清痹顆粒治療AGA的機制，本研究采用踝關節注射MSU晶體誘導大鼠AGA，經金藤清痹顆粒ig治療后，踝關節腫脹度有效緩解，SUA及CRP均顯著降低，踝關節滑膜增生、炎性細胞浸潤得到改善，同時顯著抑制IL-1β、TNF-α及IL-6等靶點和NOD樣受體信號通路的表達。

NOD樣受體信號通路在痛風的發病中具有重要的作用，NLRP3炎性小體由先天免疫傳感器NLRP3、ASC和Caspase-l組成[15]，活化的NLRP3與ASC聚合形成ASC斑點，導致Caspase-l的活化，促進IL-1β前體和IL-18前體的切割，產生成熟的IL-1β和IL-18[16-17]，并分泌到細胞外引發炎癥反應，因此在先天免疫和炎癥中起著核心作用。研究顯示，MSU可激活NLRP3，促使ASC完成NLRP3炎性小體的裝配，從而激活Caspase-l，促使IL-1β和IL-18的成熟與分泌。而在NLRP3、ASC、Caspase-1缺乏的細胞中，MSU的刺激不能產生成熟的IL-1β[18]。Caspase-l是胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的成員之一，含有胱天氨酸募集結構域以及p20、p10 2個發揮活性的區域[19]，ASC一端可與NLRP3聚合，一端可與Caspase-1聚合，是炎性小體重要的接頭分子[20-21]。活性Caspase-1執行了GSDMD氨基末端的切割，這是焦亡必經的過程[22]。Gasdermins蛋白家族是一類具有打孔效應的蛋白，可使細胞膜穿孔導致細胞焦亡，其中GSDMD可被Caspase切割為具有成孔作用的GSDMD-N和自抑制的GSDMD-C，因此GSDMD也被稱為細胞焦亡的“執行者”[23-24]。當模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別病原體/損傷相關分子模式（pathogen-or damage-associated molecular patterns，PAMPs/DAMPs）細胞內K+外流[25]，線粒體損傷、活性氧釋放增加[26-27]，溶酶體破裂、組織蛋白酶漏出[28-29]，均可導致NLRP3活化。NEK7是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，作用于K+外流的下游，在ROS的誘導下與NLRP3結合，調節NLRP3的寡聚和激活，其缺乏導致NLRP3無法與ASC聚合，ASC斑點無法形成，抑制Caspase-1的切割和IL-1β的釋放，提示NEK7在NLRP3上游的炎癥體激活中起著特異性的作用[30-32]。TNF-α是一種高度多效性的細胞因子，具有細胞增殖、代謝激活、炎癥反應和細胞死亡等多種生物學功能[33]。而IL-6對感染和組織損傷反應迅速，通過刺激急性期反應、造血作用和免疫反應來增強機體防御和維持內環境穩定[34]。研究表明，MSU誘導的痛風大鼠滑膜組織和血清中TNF-α和IL-6水平均明顯升高，與AGA炎癥反應的發病機制顯著相關，而IL-1β可以促進其產生[35-36]。因此，調節免疫炎癥反應是緩解AGA患者臨床癥狀的主要方法。

綜上，本研究采用網絡藥理學結合動物實驗的方法，探究清熱解毒、活血止痛治法載體金藤清痹顆粒對大鼠AGA的保護作用及機制，結果表明，金藤清痹顆粒能夠降低SUA及CRP，有效緩解踝關節腫脹，其機制可能與抑制NOD樣受體信號通路的異常激活，降低炎癥因子水平，改善踝關節滑膜增生、炎性細胞浸潤有關。本研究豐富了清熱解毒、活血止痛法治療AGA的研究，為臨床應用金藤清痹顆粒提供依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Jinteng Qingbi Granules in treatment of acute gouty arthritis

WEI Bo-wen1, 2, GAO Jing-yue1, 2, LIU Wei1, 2, WANG Ai-hua1, 2, YUE Qing-yun1, 2, GU Qing-xiang1, 2, KA Yu-xiu1, 2, LIN Fang-fang1, 2, GOU Xiao-ping1, 2, WANG Wen1, 2

1. First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China 2. National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Tianjin 300193, China

To study the mechanism of Jinteng Qingbi Granules (金藤清痹顆粒) in treating acute gouty arthritis (AGA) by network pharmacology and establish AGA rat model for verification.The active components and targets of Jinteng Qingbi Granules were collected by TCMSP database, and AGA-related targets were collected by GeneCards and NCBI database under the guidance of clearing heat and detoxification, promoting blood circulation and relieving pain. After integrating with the targets of Jinteng Qingbi Granules, protein-protein interaction (PPI) and “Jinteng Qingbi Granules-traditional Chinese medicine-active component-target-AGA” network was constructed, gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis were carried out. Male SD rats were randomly divided into blank group, model group, colchicine (0.3 mg/kg) group and Jinteng Qingbi Granules low-, medium- and high-dose (1.05, 2.10, 4.20 g/kg) groups, with six rats in each group. The AGA rat model was established by ankle injection of monosodium urate (MSU) crystals. The diameter of ankle joint in rats was measured by vernier caliper, and the swelling degree of ankle joint was calculated. Serum uric acid (SUA) and C-reactive protein (CRP) levels were detected by automatic biochemical analyzer. HE staining was used to observe the pathological changes of ankle joint. qRT-PCR, ELISA and Western blotting were used to detect the expressions of key targets and signal pathways in ankle joint tissue and serum.A total of 110 active ingredients, 212 targets and 272 AGA therapeutic targets were retrieved, with a total of 29 common targets. The key targets were interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor (TNF) and IL-6, involving TNF signaling pathway, IL-17 signaling pathway and NOD-like receptor signaling pathway. After injecting MSU crystal into the ankle joint of rats, the swelling was obvious (< 0.01), SUA and CRP were significantly increased (< 0.05, 0.01), synovial tissue proliferated obviously, the structure was disordered, and a large number of inflammatory cells infiltrated. NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 (NLRP3), NIMA-related kinases 7 (NEK7), apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC), cystein-aspartate protease-1 (Caspase-1), gasdermin D (GSDMD), IL-18, IL-1β, IL-6 and TNF-α expression levels were significantly increased (< 0.01). After treatment with colchicine or Jinteng Qingbi Granules, ankle swelling was effectively relieved (< 0.05, 0.01), SUA and CRP were significantly decreased (< 0.05, 0.01), synovial hyperplasia and inflammatory cell infiltration of joints were improved, and the expressions of IL-1β, TNF-α and IL-6 and NOD-like receptor signaling pathway were significantly inhibited (< 0.05, 0.01).Jinteng Qingbi Granules has significant protective effects on AGA rats, and the mechanism may be related to the inhibition of abnormal activation of NOD-like receptor signaling pathway, reducing inflammatory factor levels, and improvement of synovial hyperplasia and inflammatory cell infiltration in joints.

network pharmacology; Jinteng Qingbi Granules; acute gouty arthritis; NOD-like receptor signaling pathway; inflammatory factor; clearing heat and detoxification; promoting blood circulation and relieving pain

R285.5

A

0253 - 2670(2023)21 - 7086 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.017

2023-07-01

國家自然科學基金資助項目（82074377）；中醫藥傳承與創新“百千萬”人才工程（岐黃工程）岐黃學者（20210602-1）；國家中醫藥管理局名老中醫傳承工作室（975022）；金藤清痹顆粒二次開發項目（20220626-1）

衛博文，男，博士研究生，研究方向為風濕免疫類疾病發病機制及中藥防治研究。E-mail: 278713948@qq.com

通信作者：劉 維，女，主任醫師，教授，博士生導師，研究方向為風濕免疫類疾病發病機制及中藥防治研究。E-mail: fengshiliuwei@163.com

高晶月，女，主治醫師，博士，研究方向為中西醫結合診療風濕病。E-mail: gaojingyue0603@163.com

[責任編輯 李亞楠]