基于全新藥物設計方法的木姜子屬酰胺類化合物5-LOX抑制劑篩選研究

夏侯真如, 薛孟祺，汪欣怡，字慧敏，文政琦，李碧桃*，楊靖華*

基于全新藥物設計方法的木姜子屬酰胺類化合物5-LOX抑制劑篩選研究

夏侯真如1, 薛孟祺1，汪欣怡2，字慧敏1，文政琦3，李碧桃3*，楊靖華1*

1. 云南大學教育部自然資源藥物化學重點實驗室，云南省天然產物轉化與應用重點實驗室，云南大學化學科學與工程學院，云南 昆明 650091 2. 昆明醫科大學第一臨床醫學院，云南 昆明 650500 3. 昆明醫科大學第一附屬醫院，云南 昆明 650500

采用基于分子對接及從頭設計的方法從木姜子屬酰胺類化合物中尋找潛在的5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）抑制劑并改造提高其預期活性。通過文獻資料收集了木姜子屬植物中現已分離鑒定的酰胺類化合物10個。應用分子對接技術，通過與5-LOX抑制劑篩選相關的蛋白結晶的對接分析，篩選出木姜子屬植物中最優的酰胺類化合物。再以該化合物為基礎進行分子庫擴充，并通過對該分子庫進行類藥規則和ADMET篩選，選擇其中排名前五的分子進行從頭設計碎片生長，最后再從設計結果中篩選出更優的5-LOX潛在抑制劑。通過分子對接分析篩選出了木姜子屬植物中最優的酰胺化合物-反式-3,4-亞甲基肉桂酰-3-甲氧基酪胺，利用類藥規則和ADMET篩選出9個相對符合藥理毒理性質要求的類似分子，采用從頭設計方法篩選了出打分值較高的候選化合物6個，并初步闡釋了優良5-LOX抑制劑可能的活性殘基結合情況。木姜子屬中酰胺類化合物及其衍生物可能通過抑制5-LOX來發揮抗炎活性作用，相對于傳統篩選和改造，分子對接和從頭設計技術節約了大量的資源，為新型5-LOX抑制劑的研發提供了一定的參考。

木姜子屬；酰胺類化合物; 5-LOX抑制劑；分子對接；從頭設計；-反式-3,4-亞甲基肉桂酰-3-甲氧基酪胺

炎癥是機體必不可少的一種免疫反應，是機體應對外界刺激的一種自動防御機制。一般來說，炎癥的發生對機體是有益，它能夠在各種不利條件下維持組織內的穩態。但另一方面，其是以短暫的組織功能下降為代價，這又可能導致體內平衡的改變。因此炎癥是機體與致炎因子之間損傷與抗損傷的斗爭，炎癥的病變以抗損傷反應為主，但也會對機體造成不同程度的損傷[1]。

研究表明，許多炎癥反應過程實質上主要是由于一系列被稱作炎癥介質的內源性化學因子或生物大分子介導來實現的，它們影響到整個炎癥過程。所謂炎癥介質是指在致炎因子作用下，由局部組織細胞釋放，或來源于血漿，參與并誘導炎癥發生發展的生物活性物質[2]。白細胞三烯（leucotriene，LT），即白三烯（LTA4、LTB4、LTC4、LTD4、LTE4、LTF4等）是一種非常重要的炎癥介質，其中LTC4、LTD4、LTE4因均含有1個半胱氨酸殘基（cysteine），故統稱為cysLTs，被認為是過敏反應的慢反應物，在炎癥級聯反應中具有重要作用地位。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）是白三烯合成中最為重要的酶，其在人體中包含5-LOX、15-LOX等亞型，其中15-LOX主要是通過最終催化形成脂氧素來調節炎癥反應，而5-LOX則是炎癥反應中白三烯形成的主要來源[3]。目前5-LOX作為炎癥反應中的重要靶點，已有針對該靶點的藥物上市。其中已上市的藥物如齊留通和ABT-761等在臨床上對炎癥反應，尤其是哮喘類疾病已顯示出良好的治療效果，但其有一定的肝毒性[4]，且半衰期很短，藥動學性質也較為不利[5]。因此，新型5-LOX抑制劑的研究越來越受到人們的關注。

木姜子屬Lam.植物作為樟科（Lauraceae）常綠喬木或灌木中種類最多的屬之一，在我國南方和西南溫暖地區有廣泛的分布[6]。木姜子屬植物在民間有較為悠久的用藥歷史，在傳統醫學中被用于治療風寒濕痛、跌打損傷、糖尿病等各種疾病，其中抗炎療效在醫書中具有廣泛的記載，如山雞椒作為蓽澄茄使用，具有溫中散寒、消腫止痛的功效；豺皮樟具有對關節炎、腰腿疼痛的良好療效；木姜子則可用于治療風寒濕痛、跌打止痛等[7]。針對木姜子屬植物的化學成分，國內外學者已經展開過一些研究[8]。研究表明，木姜子屬植物中的酰胺類具有良好的抗炎活性，比如Lee等[9]的動物實驗驗證了15個酚酰胺能夠通過抑制脂質過氧化反應，增強抗氧化酶活性，來降低腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和核因子（nuclear factor-kB，NF-kB）從而降低一氧化氮的生成。由于在前期分子對接篩選研究中發現木姜子屬植物中的酰胺類對5-LOX靶點具有良好的抑制活性，因此本研究選用與5-LOX抑制劑篩選相關的3種不同來源的蛋白結晶，對木姜子屬植物中的酰胺類化學成分進行分子對接分析，篩選出其中最優的酰胺類化合物，并以其為骨架進行分子庫擴充。再通過對該分子庫進行類藥規則和ADMET篩選，并以篩選結果前5位的分子進行從頭設計的碎片生長，最后從中篩選出更優的5-LOX潛在抑制劑，并初步闡釋其活性殘基結合情況。

1 材料與方法

1.1 平臺與軟件

本研究所有工作均在Microsoft Windows 10 Professional操作系統中完成，采用ChemOffice Professional 20.0程序（珀金埃爾默公司）中的ChemBioDraw模塊和ChemBio 3D模塊、Molegro公司的Molegro Virtual Docker 6.0（MVD）軟件、Accelrys公司的Discovery Studio 2016（DS）。參數設置除特殊指明外均為默認值。

1.2 分子對接

1.2.1 受體數據庫的組建 從RCSB PDB數據庫（http://www.rcsb.org/）搜索并下載與5-LOX抑制劑篩選相關的3種不同來源的蛋白結晶，分別針對大豆sLOX-3（1JNQ）、哺乳動物15-LOX（1LOX）、智人源5-LOX（3V99）[10]，其結構PDB編號及原配體與主要靶點殘基作用情況見表1。這3種蛋白結晶獲取相對容易，有助于與后期活性驗證進行匹配，其中大豆同工酶（sLOX-1、sLOX-2、sLOX-3）是藥物篩選常見酶，研究發現sLOX-1與智人源LOX酶有較高的氨基酸序列同一性，其有些抑制劑在抑制智人源LOX酶上更為有效[11]，但其PDB數據庫中晶體結構（1YGE）缺少原配體復合，因此選擇相似的sLOX-3晶體結構（1JNQ）作為研究對象，并且Somvanshi等[12]報道了姜黃素等已知抑制劑與sLOX-3結合的解理常數和與智人源5-LOX的較為相似，有助于增加確定抑制劑的可能性；哺乳動物15-LOX的氨基酸序列中與智人源5-LOX具有類似的疏水腔，這在所有的花生四烯酸催化酶中都是保守的，而與5-LOX的特異性區域相比較，有助于確定抑制劑的選擇性；智人源5-LOX的PDB數據庫相關晶體結構較多，這里選用具有配體復合物的3V99，其與穩定純酶結晶（3O8Y）具有足夠的結構相似性，抑制劑留有足夠的空間停靠在活性中心腔中[10]。對這3種蛋白質晶體結構進行刪除水分子和輔因子的處理，經Molegro Virtual Docker 6.0（MVD）軟件進行氨基酸殘基修補，并選擇對應原配體位置為中心，選擇半徑1.2 nm的殘基為活性殘基，并將其定義為結合口袋空腔，最后保存為PDB格式備用。

1.2.2 配體數據庫的組建 通過文獻檢索收集，已知目前從木姜子屬植物中分離得到的酰胺類化合物共有10個[8]（圖1），將其二維結構繪入ChemBioDraw軟件中，并通過ChemBio 3D將其轉化為三維結構，并采用MMFF94算法對其能量進行最低優化，其中最大迭代次數設置為5000次，最大RMS梯度設置為0.5，保存為mol2格式作為分子對接的配體分子集。

表1 原配體與主要靶點殘基作用情況

圖1 木姜子屬植物中分離獲得的酰胺類化合物

1.2.3 對接方法可行性驗證 Molegro Virtual Docker 6.0（MVD）在半柔性對接精度方面高于市面上的絕大多數軟件，在于其能夠通過不同打分函數和搜索算法的組合來獲取針對受體蛋白的對接方法[13]。因此，將含有原配體的蛋白晶體復合結構中的原配體抽離，然后利用ChemBio 3D中的MMFF94算法對其進行能量最低優化，再按照設定參數對接回原結合口袋，基于不同打分函數和搜索算法的組合，反復進行嘗試，從而獲取重現性較好的對接方法。

1.2.4 分子對接參數設置 將上述組建完成的受體和配體分別導入Molegro Virtual Docker 6.0（MVD）中，并設置配體始終保持柔性，搜索算法運行次數100次，其余參數保持不變。靶點蛋白1JNQ結合空腔坐標位置為X：20.36、Y：3.30、Z：19.87；靶點蛋白3V99結合空腔坐標位置為X：18.38、Y：?78.70、Z：?33.89；靶點蛋白1LOX結合空腔坐標位置為：X：?27.12、Y：151.87、Z：56.97。

1.2.5 結果處理 對接完成后，分別以靶點蛋白中原有配體為參照，對接結果依據Rerank Score（R-Score）評價。在對接時，為了保證打分結果的可靠性，設置得到每個分子對接結果的前3位，并取其平均值作為最終得分。R-Score數值為負值，表征分子與蛋白能夠結合，數值越小，表征親和性越大[14-15]。根據R-Score結果，篩選出每個靶點蛋白得分排名靠前的化合物。通過對比分析，獲取對3種來源的靶點蛋白均有很好的打分數值的化合物。再以此化合物為基本骨架，通過Zinc 15數據庫（http://zinc.docking.org/）進行分子庫擴充，獲取類似化合物分子庫。

1.3 類藥規則及ADMET篩選

將以分子對接獲取的化合物為基本骨架得到的類似化合物分子庫，轉化為3D結構導入Discovery Studio 2016（DS），調用Filter by Lipinski and Veber Rules模塊，勾選Lipinski Rule of Five 和Veber Rule兩種規則對該分子庫進行篩選。再根據篩選結果，調用ADMET descriptors模塊，勾選aqueous solubility、blood brain barrier penetration、CYP2D6 binding、hepatotoxicity、intestinal absorption、plasma protein binding等6個篩選方向，最終獲取相對符合藥理毒理性質要求的化合物[16-17]。

1.4 從頭設計

1.4.1 對接準備 為了減少軟件間的系統性誤差，因此從頭設計的對接篩選工作將由DS 2016進行實現。以通過類藥規則和ADMET篩選的化合物作為配體，智人源（Homo sapiens）5-LOX靶點蛋白3V99作為受體，導入DS 2016，并用Prepare Ligands和Clean Protein模塊分別對配體和受體進行處理，然后用Define Receptor模塊將蛋白分子3V99定義為受體蛋白，并利用Form Current Selection模塊設置原配體所在位置為活性空腔中心，半徑為1.2 nm，最后調用CDOCKER模塊對接模塊，設置Pose Cluster Radius為0.2 nm，以保證與MVD軟件對接參數的一致性，且使對接構象盡可能具有多樣性，其余參數保持默認[18]，最終對接結果僅保留非離子型構象。

1.4.2 碎片生長 對接完成后，以原有配體為參考，對接結果依據-CDOCKER ENERGE進行評價，-CDOCKER ENERGE數值越大則對接結果越好，以每個配體打分最高的構象的數值作為依據。選取對接結果排名前5的化合物分別進行分子碎片生長，調用De Novo Evolution模塊，選取默認碎片庫進行碎片生長，共獲取50個新化合物，每組10個[19-20]。

1.4.3 結果篩選 將碎片生長所得的50個新化合物作為配體，智人源（Homo sapiens）5-LOX靶點蛋白3V99作為受體，在DS 2016中使用CDOCKER模塊進行分子對接篩選，Pose Cluster Radius設置為0.2 nm。對接完成后，同樣以原有配體為參考，對接結果依據-CDOCKER ENERGE進行評價。

2 結果

2.1 分子對接

2.1.1 對接方法可行性驗證結果選取的3個靶點均為含有原配體的蛋白晶體結構，分別將原配體抽離，再對接回原有的結合口袋，計算對接后構象與原配體結構的均方根偏差值（RMSD值），數值小于0.2 nm，說明該對接方法針對于此受體蛋白和參數設定可用[21]。為了減少系統性誤差，本次均使用打分函數MolDock Score[GRID]和搜索算法GPU Screening（CUDA）的組合對接方法。

2.1.2 對接結果木姜子屬植物中分離得到的酰胺類化合物針對與5-LOX抑制劑篩選相關的3種不同來源的蛋白結晶1JNQ、1LOX、3V99的篩選結果見表2。通過對比3種不同來源蛋白結晶的篩選結果可發現化合物6的打分結果均在前3位以上，且優于原配體和上市藥物齊留通。以化合物6為例，展示其與3種蛋白結晶的2D相互作用圖，并通過與原配體和齊留通的2D作用圖（圖2）進行對比，結果表明主要的結合殘基和作用力類似，可以發現3者的結合模式較為相似。

表2 對接得分結果

圖2 化合物6和齊留通以及原配體與3種蛋白受體相互作用2D圖

2.2 類藥規則及ADMET篩選

以化合物6為基本骨架得到的231個編號為Z001～Z231的類似化合物組成的分子庫，導入DS 2016進行類藥規則和ADMET篩選。化合物全數符合藥理性質要求，后經過ADMET篩選，篩選表格依據見表3，僅展示相對最優的篩選結果，整體結果ADMET plot見圖3，僅顯示血腦屏障通透性（blood brain barrier penetration，BBB）模型和人體腸道吸收性（human intestinal absorption，HIA）模型95%和99%的置信區間，圖中每個點代表1個預測分子，位于99%置信區間以外的分子被認為是不可靠的，最終得到9個相對符合毒理性質要求的化合物，篩選結果見圖4。

表3 ADMET篩選結果*

*人體腸道吸收性：0～3吸收性依次遞減；水溶性（25 ℃）：0～6溶解性依次增大，4為最好情況；血腦屏障通透性：0～5通透性依次降低； TURE or FALSE-是或否

*human intestinal absorption: the absorptivity decreased from 0 to 3; water solubility (25℃): the solubility increases from 0 to 6, with 4 being the best case; Blood-brain barrier permeability: permeability decreased from 0 to 5; TURE or FALSE- yes or no

圖3 ADMET篩選圖

2.3 從頭設計

在 DS 2016中，將相對符合藥理毒理性質要求的9個化合物作為配體，智人源（Homo sapiens）5-LOX靶點蛋白3V99作為受體，進行CDOCKER模塊的分子對接篩選，見表4，并選取-CDOCKER ENERGE數值排名前5編號為Z167、Z184、Z180、Z125、Z004的化合物作為分子骨架，調用De Novo Evolution模塊進行碎片生長，獲取5組化合物共50個。再以這50個化合物為分子庫，進行分子對接篩選，獲取潛在的活性分子，見表5。從表5中可以看出-CDOCKER ENERGE數值最高的為Z167-6，考慮實際價值，篩選結果僅展示排名前6的分子（除離子型），其中數值高于原配體的分子共有1個，而高于齊留通的分子共有2個（圖5）。考慮到排名較高的分子均來自與Z167和Z180的碎片生長，因此展示2組分子中排名前3的分子Z167-6、Z167-4、Z180-5及排名靠后（負值除外）的分子Z167-7、Z180-3、Z180-1與受體蛋白3V99的相互作用2D圖，并與齊留通和原配體的2D作用圖進行分析比較見圖6。

3 分析與結論

3.1 分子對接

從3種不同來源蛋白結晶的分子對接篩選結果中發現，木姜子屬中酰胺類化合物6的Rerank Score打分結果均在前3位以上，且優于原配體和上市藥物齊留通的打分值。并且從2D相互作用圖中可以發現，在1JNQ中，化合物6與蛋白中的活性殘基His518可以形成氫鍵，與Gln716、Leu716、Leu773等可以形成較強的空間相互作用，其結合模式與齊留通和原配體均類似；在1LOX中，活性殘基Leu362、Leu367、Ile350、Leu597和Ile400組成的疏水腔在所有花生四烯酸催化酶和其類似物中是保守的[10]，而化合物6與蛋白中的活性殘基Glu357可以形成氫鍵，與Leu597、Ile400具有強空間相互作用，Leu362具有較弱空間相互作用，這相較于齊留通和原配體與相應殘基的作用情況要強；在3V99中，活性殘基Tyr181、Ala603、Ala606、His600、Thr364和Phe177被認為是5-LOX的特異性區域，化合物6與蛋白中的活性殘基Ala606、Gln609可以形成氫鍵，與Phe177具有空間相互作用，相較于齊留通和原配體的作用情況要強。木姜子屬植物中酰胺化合物6具有與齊留通和原配體相似的活性殘基作用模式，除此之外其與文獻報道的分子對接相關活性殘基作用方式類似[10]，并且對于3種蛋白的對接打分數值皆排名靠前。因此推測其可能表現有相關的LOX酶抑制活性作用，特別是對智人源5-LOX有較大的抑制可能性，因此以化合物6為基礎擴展分子庫獲取了具有相似結構的231個化合物，其中9個化合物通過了類藥規則和ADMET規則篩選，相對符合藥理毒理性質要求。

圖4 類藥規則及ADMET篩選結果

表4 9個化合物分子對接篩選結果

表5 從頭設計篩選結果

圖5 打分值排名前6的分子(除離子型)

圖6 3V99相互作用2D圖

3.2 從頭設計

在對5-LOX的從頭設計研究中，選取了上述9個相對符合藥理毒理性質要求的化合物中-CDOCKER ENERGE數值排名前5的化合物Z167、Z184、Z180、Z125、Z004作為分子骨架，其打分數值均在陽性對照齊留通附近，其中Z167、Z184的打分數值高于齊留通。經過從頭設計碎片生長后，Z167分子衍生物整體打分數值有較大幅度的提升，其余分子衍生物整體打分數值多有下降。因此對整體分數較高的2組衍生物分子2D相互作用情況進行分析，選擇其中排名前3的分子和排名靠后的分子（負值除外）展示。結果顯示打分數值較優的衍生物分子或與蛋白結晶3V99的活性殘基Ala672有Pi-Anion的靜電相互作用，或與His372有Carbon Hydrogen Bond的氫鍵作用、或與His367有Pi-Alkyl疏水作用，這與齊留通和原配體的作用模式類似，而Ala410、Lys409等形成的疏水作用、Gln363形成的氫鍵作用可能起到穩定作用，從而提高了打分數值。打分數值較低的衍生物分子也部分顯示了以上作用情況，進一步證實了優良5-LOX抑制劑的結合位點活性殘基可能與上述有關。綜上所述，可以推測優良5-LOX抑制劑的開發關鍵點在于與上述活性殘基的結合，其真實藥理藥效作用及活性情況正待驗證中。

現代藥物研究中，分子對接方法和從頭設計方法作為基于受體的藥物設計方法是計算機輔助藥物設計中應用廣泛且精度較高的方法。它們通過化學計量學方法模擬藥物分子與蛋白受體之間的作用關系，快速大量篩選得到潛在藥物分子，并根據結合口袋情況針對性進行分子碎片生長，從而得到更為精準結合力更高的潛在藥物分子[22-23]。本研究通過分子對接分析篩選出木姜子屬植物中酰胺類化合物里最可能擁有5-LOX潛在抑制活性的分子，通過類藥規則和ADMET規則篩選出9個類似骨架的相對符合藥理毒理性質要求的分子，最終通過從頭設計碎片生長預測了結合力更高更具活性潛力的衍生物分子，并推測了5-LOX抑制劑的關鍵結合活性殘基情況，從而為研發5-LOX抑制劑類藥物提供了一定的參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Vitual screening of 5-LOX inhibitors of amide compounds from Litsea plants based on novel drug design method

XIA HOU Zhen-ru1, XUE Meng-qi1, WANG Xin-yi2, ZI Hui-min1, WEN Zheng-qi3, LI Bi-tao3, YANG Jing-hua1

1. Key Laboratory of Medicinal Chemistry for Natural Resource, Ministry of Education; Yunnan Provincial Key Laboratory of Natural Product Transformation and Application; School of Chemical Science and Technology, Yunnan University, Kunming 650091, China 2. No. 1 School of Clinical Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, China 3. First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650500, China

To find potential 5-lipoxygenase (5-LOX) inhibitors and improve the expected activity of amide compounds fromplants based on molecular docking and de novo design.A total of ten amide compounds isolated and identified fromplants were collected in the literature. The molecular docking technique was used to screen the optimal amide compound inplants by docking analysis of protein crystals associated with 5-LOX inhibitor screening. Then expanding the molecular library based on the compound, selecting the top five molecules to perform de novo design fragment growth by performing drug-like rule and ADMET screening on the molecular library, and finally screening out a more optimal 5-LOX potential inhibitor from the design result.The optimal amide compound--3,4-methylenecinnamyl-3-methoxytyramine inplants was screened out by molecular docking analysis. A total of nine similar molecules relatively meeting the requirements for pharmacological and toxicological properties were screened out by the drug-like rule and ADMET. A total of six candidate compounds with high scoring values were screened out by the de novo design method, and the possible active residue binding of excellent 5-LOX inhibitors was preliminarily explained.Amides and their derivatives in theplants may exert anti-inflammatory activity by inhibiting 5-LOX. Compared with traditional screening and modification, molecular docking and de novo design technology save a lot of resources. This study provides a certain reference for the research and development of new 5-LOX inhibitors.

Lam.; amide compounds; 5-LOX inhibitor; molecular docking; de novo design;--3,4-methylenecinnamyl-3-methoxytyramine

R284

A

0253 - 2670(2023)21 - 6961 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.005

2023-03-09

國家自然科學基金資助項目（82160661）；國家自然科學基金資助項目（81960629）；國家自然科學基金資助項目（21662040）；云南省創新團隊（202005AE160005）；云南省應用基礎研究項目（2017FD122）

夏侯真如（1995—），男，安徽人，在讀碩士，研究方向為天然藥物化學。Tel: 18325790633 E-mail: 546552125@qq.com

通信作者：李碧桃（1971—），女，云南人，主任醫師，主要從事兒童體格生長發育、兒童營養、兒童神經心理發育、兒童早期發展研究工作。E-mail: 1827023387@qq.com

楊靖華（1971—），女，云南人，博士，教授，主要從事天然藥物化學研究工作。E-mail: yangjh@ynu.edu.cn

[責任編輯 王文倩]