單細胞轉錄組測序分析實訓平臺架構研究

林長松，邵嬌芳，武劍，汪強虎

（南京醫科大學，江蘇南京 211166）

近些年，隨著單細胞轉錄組測序技術的日趨成熟，每天都會產生海量的單細胞測序數據，如何有效分析并應用這些數據是細胞測序的重點。將單細胞測序數據分析融入本科生課程是生物信息學教學中一個關鍵問題，理論和實驗教學中涉及大量先進的軟件和分析方法，教師在教學中發現，本科生在實驗平臺中進行多次訓練可以掌握該知識點，因此，教學團隊需要構建性能優越的實訓化平臺，以滿足實驗課教學需求。

1 單細胞實驗教學中存在的問題

生物信息學專業具有較強的實踐性，單細胞轉錄組測序技術的興起對教學提出了更高的要求。但該課程的教學尚處于初步探索階段，未形成一個完整的課程建設體系，仍面臨著許多問題和挑戰[1]。

1.1 配置生物信息分析環境難度大

單細胞轉錄組測序分析作為一門新興學科，其一大特點是會產生海量的數據。不僅從下機數據到后續分析的處理過程復雜，而且配置分析環境也具有較大難度[2]：一是軟件數量多，僅R 包就多達幾百個；二是軟件版本不同，不同版本的軟件數據分析結果不盡相同。本科生需要花費大量時間用于配置環境，給教學帶來巨大挑戰。在實際教學中，為了解決實驗分析環境統一化的問題，教學團隊基于docker 技術構建了包含R 包和Python 軟件的標準化實訓平臺環境，極大地提高了課堂教學效率。

1.2 課程自主學習難度大

單細胞轉錄組數據分析知識點復雜，要求學生具備系統的知識體系，而真正掌握該技術需要大量的練習。對于傳統教學模式，學生在有限的學時內難以將知識點融會貫通，甚至會消磨學習興趣，配置分析環境的復雜性更是加大了學習難度。實驗課涉及的典型實例，學生在運行時無法理解深層含義，不能達到觸類旁通的效果，在分析新的數據時依然感到困難。

1.3 代碼糾錯能力差

由于涉及大量的分析軟件，而每個軟件的參數又多而雜，學生難以在眾多參數中抓住主要的參數，準確理解軟件的各項功能，因此，容易出現無法解決軟件系統報錯的現象。這就需要引入視頻類教學，學生可以通過多次回放視頻來理解、記憶如何使用軟件，更高效地解決實際運行軟件報錯的問題。

2 實訓化平臺的重要性

作為一種輕量級的虛擬化技術[3]，docker 在生物信息學分析中被廣泛使用，并且目前生物信息公司多使用docker 技術完成流程化分析過程[4]。由于其具有可移植、不依賴操作系統的優勢，因此教學團隊使用docker 建立了一個容器[5]，在此基礎上搭建了標準化的生物信息分析實訓平臺，立足高校實訓場景和教學需求，集教學、實訓、案例分析、討論評價于一體。該實訓平臺在實踐過程中不斷完善，對于教學和科研具有重要意義。

2.1 實訓化平臺提供了穩定的生物信息分析環境

教學團隊采用docker 技術建立實訓平臺，在學習過程中為學生提供了跨平臺分析的便利，從而提高了教學效率，也極大方便了科研實踐。在實驗方面，平臺不僅包含本科生學習用到的大部分軟件，而且提供了相關的分析代碼和配置文件等。此外，實訓化平臺穩定性較強，考慮了不同軟件的兼容性和版本問題[6]，使得學生在學習過程中專注于數據分析，不受分析環境問題的困擾。而對于學有余力的同學，可以進一步掌握docker 技術，從底層掌握容器構建過程，強化計算機底層知識，提高科研技能，這是傳統教學模式所無法做到的[7]。

2.2 實訓化平臺提高了學生自主學習能力

實訓化平臺基于容器化技術及影音技術的基礎構建而成[8]，具有專業化和規范化的特點，整合了豐富的學習資源，學生可以依靠視頻講解進行多次訓練，并且通過閱讀糾錯文檔，實現自己修改錯誤，極大地提高了學生的自主學習興趣。學生能夠在不依賴教師的情況下進行自我探索、自我提高。

對于視頻講解：為了滿足當下學生的學習需求，將視頻講解運用到數據分析的教學中，對關鍵代碼的講解和結果的解讀有助于加深學生對知識的理解。圖文并茂化的生物信息教學，提高了互動性和代碼學習的趣味性，同時為學生提供了自主性的學習平臺，使學生能夠發揮主觀能動性，促進教學優化，提升數據分析的實踐質量[7]。

對于糾錯文檔：實訓化平臺倡導學生自主閱讀糾錯文檔，減少依賴性，真正理解軟件的運行原理，而不僅僅是模仿代碼，從而提高學生自主解決問題的能力，會解決錯誤也是生物信息學人才必備的技能之一。

對于數據來源：實訓化平臺提供的數據集多來自公共數據集，案例分析具有真實的生物學意義，因此有助于激發學生自主學習和探索的興趣，鼓勵學生從科學問題出發，將生物信息學運用到實際當中[9]。

此外，實訓平臺提供個性化的課前預習實踐，教學視頻為學生的課前自主學習提供了幫助，減輕了課后壓力。由于單細胞轉錄組數據分析需要大量的練習時間，所以課前學習有助于學生系統掌握知識體系，同時保證了教學效果。

生物信息學作為交叉學科，要求學生具有較強的自主學習能力，而實訓化平臺滿足了專業未來的發展趨勢，立足生物大數據的背景，目標是培養學生自主學習的能力和創新能力。

2.3 實訓化平臺促進了教學深入實踐和探索

目前，國內高校開設單細胞轉錄組測序課程比較少[10]，而且涉及的實驗教學內容相對較少，因此可供參考的內容不多，亟需一個標準化教學平臺。生物信息學教學團隊將容器化技術融入課程教學，根據一線教師的建議及學生的反饋及時完善實訓平臺，取得了良好的教學效果：不僅實現了學生分析數據能力、自學能力、探索能力和團隊合作精神的綜合培養，而且進一步加強了實驗課教學對理論課的補充與深化作用[11]。

實訓化平臺以促進教學、規范課程建設、學生實訓為目標，提供了完整的單細胞轉錄組數據分析學習體系，并且充分考慮到了學生選擇模塊的靈活性和組學分析的個性化特點[12-14]。學生除了按照已有的示例數據和代碼進行實驗外，還可以基于已有的軟件模塊，自行設計實驗方案，嘗試自主寫代碼、復現文獻的實驗流程，在具體的案例分析中，使用生物信息學方法嘗試解決科學問題。在這個過程中，教師引導學生在實驗中發現問題并解決問題，采用文獻匯報的方式進行討論，教師對學生的實驗提出建議，形成一個完整的教學模式。實訓化平臺能夠有效幫助教師了解學生的技能掌握情況，提高教學質量，幫助學生掌握單細胞轉錄組分析的知識體系。

3 模塊化結構是實訓化平臺的基礎

生物信息學相關實訓化平臺的構建需要穩定的軟件環境，而模塊化結構則是實訓化平臺的基礎。在教學中采用的策略是基于生物信息學分析流程構建實訓化平臺的模塊化結構，從而引導學生系統掌握單細胞轉錄組數據分析流程，同時為其他生物信息學分析方法的教學如轉錄組數據分析方法提供借鑒。目前，教學上使用的單細胞轉錄組數據分析平臺分為以下的模塊化結構（見圖1）：

圖1 單細胞轉錄組數據分析平臺架構

3.1 單細胞轉錄組數據的基礎分析

（1）數據讀入整合。

在實訓化平臺的相關模塊環境中利用Cellranger對單細胞測序數據進行比對，然后根據需要讀取的數據格式，基于Seurat 包分別采取Read10X、Read10X_h5、read.table的方法讀取比對后的數據。讀入數據后，對數據采取以下3 種方法整合：Seurat 整合流程（CCA+ MNN）、Seurat（reciprocal PCA）、Harmony 軟件整合操作。

（2）缺失值填充。

由于實際的單細胞測序數據不可避免地會遇到含有缺失值，即表達矩陣較為稀疏的情況，教學中常常會使用scImupute 或VIPER 方法來對數據進行降噪處理，實現缺失值填充的目的。

（3）差異分析。

分別使用FindNeighbors()和FindClusters()函數對整合后的數據做降維聚類分群。接著，對分群單細胞數據通常采用FindAllMarkers()函數做單細胞表達水平的差異分析，從而可以確定每個單細胞亞群特異性高表達的基因。

（4）細胞亞群識別。

基于細胞異質性、細胞共性、單細胞數據庫，可以對單細胞亞群做識別鑒定分析。目前，使用較為廣泛的單細胞亞群的鑒定方法主要分為以下四類：基于差異分析確定的單細胞亞群特異性高表達基因，利用Marker 基因數據庫識別細胞亞群；利用SingleR 或scMCA 或scHCL 等相關R 包來比較樣本數據的單細胞基因表達與已知細胞類型的bulk RNA，基于相似性指數的高低確定細胞類型；訓練給定的數據集，基于訓練的模型半監督地預測目標數據的細胞亞群，通常利用cellassign、axibet 等R 包；利用clusterprofiler、SCSA 等R 包，基于差異基因對marker 基因做富集分析，細胞類型的判斷標準是富集程度。

（5）CNV 推斷。

對于單細胞基因組拷貝數分析，教學中通常以inferCNV 和CopyKAT 為主要的教學方向。inferCNV主要是用于分析腫瘤樣本單細胞轉錄組數據，分析體細胞水平上拷貝數大規模的變化，而CopyKAT 則是計算每個細胞的基因組拷貝數分析并確定其中的亞克隆結構。

3.2 單細胞轉錄組的高級分析

（1）細胞通訊。

對于單細胞轉錄組數據不同細胞亞群之間的相互作用關系，常使用CellPhoneDB、iTALK、CellChat、Garnett、Nichenet 等方法確定配體與受體細胞，從而實現預測配體調控的靶基因與相應受體的目的。

（2）擬時分析。

為獲得細胞過渡狀態的軌跡，使用monocle2、monocle3、velocyto 或scVelo 做擬時分析，即細胞軌跡分析，基于細胞的基因表達情況識別核心基因，實現對不同分化狀態的細胞排序，從而確定細胞的發育軌跡。

（3）富集分析。

單細胞轉錄組的富集分析分別可以利用GSEA 對差異分析后的樣本或GSVA 對表達矩陣計算特定基因集的變異分數。

（4）轉錄因子分析。

單細胞轉錄組數據可以使用SCENIC 軟件研究轉錄因子并確定轉錄因子的調控單元及其調控的相關活性分數。

（5）TCGA 聯合分析。

對于單細胞轉錄組數據分析得到的marker 基因或基因標簽等數據，往往會利用公共數據庫的bulk RNA 數據進行驗證，如結合TCGA 或GEO 數據庫對樣本數據做生存分析驗證。

4 模塊的組成

單細胞轉錄組數據的實訓化平臺的每個模塊都包括教學視頻、示例代碼、示例數據、結果解釋、錯誤糾正。

（1）教學視頻。

教學視頻由授課教師按照單細胞轉錄組數據的分析流程分模塊錄制，教師在視頻中展示如何進入容器的鏡像環境、在環境中運行示例代碼、運行結果與教學中的常見錯誤。這種教學方式便于學生課前預習與課后復習，極大地提高了教學效率。

（2）示例代碼。

示例代碼包含了常見的單細胞轉錄組數據的分析代碼、針對特異性數據的特殊代碼以及不同方式的結果呈現代碼。

（3）示例數據。

教學中的示例數據覆蓋范圍較廣，包括肺腺癌、宮頸癌、牙周炎等單細胞轉錄組數據，給予學生一定的自由度以個人科研興趣為導向進行系統的單細胞轉錄組數據分析流程的學習，有較好的激勵作用。

（4）結果解釋。

實訓化平臺覆蓋了對所有示例數據運行結果的解讀，從單細胞轉錄數據本身的相關生物學意義的解釋擴展到相關領域的前沿技術或文章的最新進展與研究思路的指導，拓寬了學生的研究思路，拓展了學生科研思維，為后續進一步的學習與深造奠定了良好的基礎。

（5）錯誤糾正。

在錯誤糾正版塊包含了以往教學中常見的錯誤示范文檔與運行代碼報錯的指導意見，提高了學生的學習效率，有較高的用戶友好性。

5 實訓化平臺在教學中取得的效果

基于docker 容器及多媒體技術構建的單細胞轉錄組測序數據分析的實訓化平臺以相關模塊結構化為特點，使得學生在可移植的安全封裝的穩定生物信息分析環境的基礎上，實現示例數據的復現。此外，包括示例數據、結果解釋、錯誤反饋等用戶友好型模塊，以數據覆蓋范圍廣、聯系科研前沿理論與技術、錯誤反饋及時為特色，拓展了學生的科研思路，提升了教學效率，促進了單細胞轉錄組數據相關教學的實踐與探索。該實訓化平臺對其他生物信息學分析流程及相關學科的教學有良好的示范作用，有一定的借鑒意義。