超聲輔助β-環糊精包合法提純α-亞麻酸工藝研究

郝文來，郝健

（深圳市誠致生物開發有限公司，廣東 深圳518000）

心血管疾病已經成為危害人類健康的重大疾病之一，甚至青少年的發病率也呈逐年增長趨勢[1-3]。研究發現，α-亞麻酸和γ-亞麻酸在預防和治療心血管疾病方面均有顯著療效，且無不良影響[4-5]；更有研究者發現α-亞麻酸的功效更佳[6]。針對α-亞麻酸，它對人體的健康起到很多重要作用：如提高學習記憶和智商水平；抑制化學致癌物生成，抑制癌細胞生長和代謝；降低膽固醇，使膽固醇在肝臟中減少積累；降低血脂，保護大腦和心臟；緩解緊張帶來的應激反應；α-亞麻酸油具有食用性，且穩定無異味，食用過量無副作用，是優異的保健食品等[7]。集眾多優點于一身的α-亞麻酸廣泛存在于魚類、藻類和植物中，大量存在于亞麻籽油內[8]。眾多研究表明，亞麻籽油中含有超過質量分數80%的α-亞麻酸[9-11]。并且亞麻籽的種植范圍廣泛分布于國內外多個地區，是一種理想的α-亞麻酸提純原料。

雖然α-亞麻酸是一種理想的有益于人體健康的營養成分，但其分子中含有3個雙鍵，很容易被氧化，故對提取和純化工藝的要求較高，所以通常以某種特定的工藝來提高高純度α-亞麻酸的穩定性。常見的加工工藝有乙醇提取法、超臨界CO2萃取法、分子蒸餾法、尿素包合法、超聲波法和β-環糊精包合法等[12-16]。

劉金菊等將亞麻籽油甲酯化，然后利用分子蒸餾法對其中的α-亞麻酸進行分離純化，在優化工藝條件下得到的α-亞麻酸的質量分數超過80%，提取率也將近80%[10]。冷榨和溶劑浸出工藝是常見的亞麻籽油的加工方法，劉末利用優化的超臨界CO2萃取法，得到優化的亞麻籽油提純工藝條件，此亞麻籽油中的α-亞麻酸相對質量分數也超過75%，加工效果遠優于前2種工藝[17]。陳樂清等為了得到純化的α-亞麻酸，以亞麻籽油為原料油，首先經過甲酯化，進一步通過分子蒸餾法達到目的，得到純化的α-亞麻酸的質量分數可達到80.27%，提取率可達到76.20%[11]。林非凡等則從高血脂疾病的預防和治療實驗方面，對α-亞麻酸的醫用效果進行評價，以亞麻籽油為原料油，使用β-環糊精包合法進行提純，再進行小鼠的降血脂實驗，結果表明，上述方法得到的α-亞麻酸預防和治療高脂血癥效果明顯[18]。

研究以亞麻籽油為原料油，通過超聲輔助β-環糊精包合法，進行亞麻籽游離脂肪酸的制備和亞麻籽β-環糊精包合，考察不同條件下α-亞麻酸提純率，并得到優化的參數。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器設備

原料與試劑。α-亞麻酸標準品，甲醇，色譜純；甲醇，石油醚，無水乙醇，氫氧化鉀，鹽酸溶液，無水硫酸鈉，β-環糊精，分析純；亞麻籽油，工業品。

儀器設備。恒溫水浴鍋，SHJ-A6；電熱鼓風干燥箱，DHG-9070A；循環水式真空泵，SHZ-95B；旋轉蒸發儀，R-1005；高效液相色譜儀，HPLC 1200；電子天平，MS204S；錐形瓶、燒杯等玻璃陶瓷儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 亞麻籽游離脂肪酸的制備

制備1 mol/L 的KOH-乙醇溶液，然后按照體積比1:5混合亞麻籽油與KOH-乙醇溶液，在80 ℃的恒溫水浴鍋中回流45 min，在冷卻至室溫的混合液中加入一定量的去離子水進行溶解，之后加入石油醚對其中不能皂化的部分萃取除去。將分層后的下層溶液用質量分數20%鹽酸溶液進行酸化，調整溶液pH至2～3；再次加入石油醚，充分攪拌混合，將完全混合的溶液移至分液漏斗，充分靜置待其分層。分層后，將上層的有機相溶液從分液漏斗的口倒出，對下層的溶劑繼續使用石油醚連續萃取至少3 次，將多次的有機相合并待用。用質量分數5%的NaCl水溶液對有機相洗至中性，再加入無水硫酸鈉脫除有機相中所含有的水分，通過55 ℃條件下旋蒸濾液，回收其中的石油醚，最終得到亞麻籽油的混合脂肪酸。

1.2.2 亞麻籽β-環糊精包合方法

稱取適量的β-環糊精制成飽和溶液。稱取適量的亞麻籽油和無水乙醇，按照質量比2:1 進行混合，迅速加入β-環糊精溶液，然后放置于攪拌裝置上攪拌操作10 min，使其混合均勻，隨后在一定溫度下進行超聲。超聲時間根據實驗目的設置，然后每隔10 min取下攪拌20 s。最后，超聲結束放置于冰箱中（-15 ℃）冷凍24 h進行脫包合。

冷凍結束后，融化后的溶液連接真空泵及抽濾設備，將混合液抽濾處理，分離出其中的β-環糊精結晶包合物，得到剩余濾液；將一定量的石油醚加入到剩余濾液中，并用質量分數10%的鹽酸調節濾液的pH至2～3，加入一定的去離子水，保證萃取充分；分層取出有機相，多次重復萃取過程，將得到的有機相合并。將合并的有機相用質量分數5%的NaCl多次清洗直至中性，用一定量的無水硫酸鈉脫除去有機相殘留的水分，在50 ℃條件下旋蒸回收有機相中的石油醚，最終獲得較高含量的α-亞麻酸。

1.2.3 單因素實驗

參照1.2.2 節中的實驗方法，采用無水乙醇進行預處理，分別對β-環糊精溶液與脂肪酸的料液比、超聲溫度、超聲時間變量因素進行實驗研究，分析其單因素對α-亞麻酸提純率的影響。

1.3 分析方法

1.3.1 儀器條件

色譜柱及其參數：C18色譜柱填料，250 mm×2.6 mm，填充顆粒直徑5 μm。流動相參數：甲醇與質量分數1%乙酸溶液體積比為90:10，體積流量1 mL/min。色譜柱溫度30 ℃，檢測波長205 nm，進樣量20 μL。

索福達M100蒸發光散射檢測儀參數：載氣體積流量2 L/min，漂移管溫度75 ℃。

1.3.2α-亞麻酸標準曲線繪制

精確稱取10 mgα-亞麻酸與10 mL 的容量瓶中，并用甲醇溶液定容質容量瓶刻度線，此時標準溶液α-亞麻酸的質量濃度為1 g/L。分別用移液槍移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0 mL標準α-亞麻酸溶液于10 mL的容量瓶中，然后用甲醇溶液定容至容量瓶刻度線，此時標準溶液α-亞麻酸溶液的質量濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3 g/L。

將標準溶液進行液相色譜測定，用α-亞麻酸的質量濃度（ρ）和α-亞麻酸色譜圖峰面積（A）進行作圖，通過Origin 9.1進行擬合，如圖1所示。

圖1 α-亞麻酸的質量濃度和峰面積的線性擬合Fig 1 Linear fitting of mass concentration and peak area of α-linolenic acid

由圖1可得擬合方程為：A/(μV·s)=1.563ρ/(g·L-1)+2 687，R2=1.000。

1.3.3α-亞麻酸含量測定

使用梅特勒托利多分析天平稱量待測樣品0.1000 g，加入到100 mL錐形瓶中，加入30 mL濃度0.5 mol/L 的堿性甲醇溶液，充分搖勻，將錐形瓶密封；在60 ℃水浴鍋添加下對混合液充分震蕩40 min，保證其充分的混合。將錐形瓶取出，靜置冷卻至室溫，滴加一定量的鹽酸溶液調節至中性，將溶液整體轉移至250 mL 容量瓶中，用色譜純甲醇定容備用。移液管精確移取1.00 mL上述溶液至10 mL 容量瓶，再用色譜純度甲醇定容。用10 mL注射器吸取一定量的溶液，通過過濾膜后將液體打入進樣瓶。

在上述制定的色譜設備和參數條件下，對樣品進行液相色譜測定和分析。

2 結果與討論

2.1 原料預處理

為了更好的形成包合物，α-亞麻酸需要借助乙醇等有機溶劑才能完全溶解。在超聲溫度40 ℃、超聲時間75 min、料液比（β-環糊精與亞麻籽油的體積比）14∶1條件下，考察原料預處理對提取的α-亞麻酸純度的影響，結果如表1所示。

表1 原料預處理方式對α-亞麻酸純度的影響Tab 1 Effect of raw material pretreatment onthe purity of α-linolenic acid

由表1可知，當加入無水乙醇作為溶劑后，α-亞麻酸的純度明顯提高。

2.2 料液比的影響

使用無水乙醇作為溶劑，在超聲溫度25 ℃、超聲時間60 min條件下，考察β-環糊精用量對α-亞麻酸純度的影響，結果如圖2所示。

圖2 料液比對α-亞麻酸提取率的影響Fig 2 Effcet of solid-liquid ratio on extraction rate of α-linolenic acid

由圖2可知，隨著料液比的增加，α-亞麻酸的提純率先增加后減小，料液比為14∶1 時，α-亞麻酸的純度最大，為質量分數75.9%。當β-環糊精用量過量后會導致脫包后的雜質與α-亞麻酸混合，從而降低α-亞麻酸的純度。

2.3 超聲時間的影響

使用無水乙醇作為溶劑，超聲時間60 min、料液比為14∶1 條件下，考察不同超聲時間對α-亞麻酸提純率的影響，結果如圖3所示。

圖3 超聲時間對α-亞麻酸純度的影響Fig 3 Effect of ultrasonic time on the purity ofα-linolenic acid

由圖3可知，隨著超聲時間的增加，α-亞麻酸的純度先增加后減小。超聲時間為75 min時，α-亞麻酸的純度最大，質量分數為74.3%。超聲能增加分子運動，隨著超聲時間增加，β-環糊精的包和效果增加，但超聲時間進一步增加會導致β-環糊精包和腔破裂，從而降低α-亞麻酸的純度。

2.4 超聲溫度的影響

使用無水乙醇作為溶劑，超聲時間75 min、料液比為14:1條件下，考察不同超聲溫對α-亞麻酸純度的影響，結果如圖4所示。

圖4 不同超聲溫度對α-亞麻酸純度的影響Fig 4 Effect of different ultrasonic temperature on the purity of α-linolenic acid

由圖4可知，隨著超聲溫度增加，α-亞麻酸的純度先增加后減小。超聲溫度40 ℃時，α-亞麻酸的純度最大，質量分數為78.2%。在一定程度上，溫度升高增加了分子運動，促進了包合過程；但溫度過高時，會導致β-環糊精包和腔破裂，從而降低α-亞麻酸的純度。

3 結 論

以亞麻籽油為原料油，β-環糊精作為包合劑，研究了原料預處理、料液比、超聲溫度、超聲時間對α-亞麻酸純度的影響。結果表明，采用無水乙醇作為溶劑可以提高α-亞麻酸的純度，當料液比、超聲溫度、超聲時間分別為14∶1、40 ℃、75 min時，α-亞麻酸的純度最大，質量分數可達78%。