金絲桃苷通過抑制HSP90AA1抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲

郭晉祥 魏攀 呂會茹 李姣鋒 王開武 張紅

(洛陽職業技術學院 1內科教研室,河南 洛陽 471000;2生物化學教研室;3藥理學教研室;4河南省人民醫院重癥醫學科;5鄭州大學第一附屬醫院心內科)

乳腺癌發病率和致死率在女性惡性腫瘤中分別居首位和第二位,已成為全球性的治療問題〔1〕。盡管目前臨床上相對早期和部分局部晚期乳腺癌患者經手術和(或)放化療治療后預后良好,然而乳腺癌的復發與轉移依然棘手,同時放化療手段常常導致嚴重的毒副作用,影響患者的治療效果〔2～4〕。此外,乳腺癌發病的年輕化趨勢及患者對治療后生活質量要求的不斷提高,對相關治療藥物的開發提出了更高要求。金絲桃苷是黃酮醇苷類化合物,既往研究發現,金絲桃苷具有抗炎、抗腫瘤等廣泛藥理作用,對包括肺癌在內的多種實體腫瘤具有抑制活性〔5～7〕,但金絲桃苷對乳腺癌的作用鮮有報道。本研究旨在觀察金絲桃苷的網絡藥理學及對乳腺癌生物學特性的影響。

1 材料與方法

1.1細胞及實驗動物 乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞株(武漢普諾賽生命科技有限公司)。Balb/c品系裸鼠16只(北京維通利華實驗動物技術有限公司),SPF級,8～10周齡,體質量25～30 g。

1.2主要試劑 金絲桃苷(純度≥98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),熱休克蛋白(HSP)90α家族A類成員(HSP900AA)1過表達質粒(優寶生物),兔抗人HSP900AA1一抗(武漢菲恩生物科技有限公司),兔抗鼠Ki67一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗(美國CST公司),CCK-8檢測試劑盒(美國Abbkine公司),Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司),Transwell小室(美國Corning公司)。

1.3金絲桃苷治療乳腺癌相關靶點篩選 利用SwissTarget數據庫和TargetNet數據庫預測金絲桃苷的作用靶點,利用GeneCards數據庫查詢乳腺癌相關靶點以篩選金絲桃苷治療乳腺癌作用靶點。

1.4金絲桃苷-乳腺癌靶點蛋白質相互作用(PPI)網絡構建 將獲得的金絲桃苷和乳腺癌的靶點取交集,并使用STRING平臺構建金絲桃苷治療乳腺癌的PPI網絡,并進一步使用Cytoscape3.7.1軟件進行可視化。

1.5基于癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫分析靶點基因與乳腺癌臨床表型的關系 利用Uaclan在線分析篩選出TCGA數據庫中在乳腺癌組織中表達差異及與生存相關的基因。下載TCGA_BRCA數據矩陣和臨床信息,分析HSP900AA1表達及與乳腺癌臨床特征的關系。

1.6細胞培養與轉染 分別取MCF-7、MDA-MB-231細胞接種于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養基中,置于培養箱中常規培養,待匯合率達85%以上傳代培養。采用Lipofectamine 2000將HSP900AA1過表達質粒轉染MCF-7、MDA-MB-231細胞。

1.7裸鼠成瘤實驗 取MCF-7細胞約1×107個重懸于100 μl的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,注射到裸鼠的第四對乳房墊誘導乳腺癌移植瘤;將16只裸鼠隨機分為Control組和Hyperoside組各8只,Hyperoside組經腹腔注射50 mg/kg金絲桃苷,1次/2 d,共14 d;Control組注射等量生理鹽水。每間隔2 d測量移植瘤體積(V),V=0.5×L×W2,L和W分別為測得的瘤體長、寬;治療結束后處死裸鼠,剝離瘤體,并采用免疫組織化學法(IHC)檢測移植瘤組織中Ki67表達。

1.8CCK-8檢測細胞增殖 將MCF-7、MDA-MB-231細胞以約3 000個/孔密度接種至96孔板,放入培養箱中常規培養24 h后,MCF-7、MDA-MB-231細胞培養液中分別加入不同濃度金絲桃苷(75和100 μmol/L)處理,分別于繼續培養24、48、72、96和120 h后,用細胞培養基1∶100稀釋CCK-8試劑,加入100 μl的稀釋液培養1 h后測定450 nm處各孔吸光度。

1.9Transwell實驗檢測細胞侵襲 將MCF-7、MDA-MB-231細胞以無血清培養基調節密度為1×105個/ml。于Transwell小室上室加入200 μl細胞懸液,下室加入600 μl含有不同濃度金絲桃苷(75和100 μmol/L)的10% FBS的培養基,培養48 h后使用結晶紫染色小室下層細胞并計數。

1.10劃痕實驗檢測細胞遷移 將MCF-7、MDA-MB-231細胞接種至6孔板,5×105個/孔,待細胞鋪滿孔后利用200 μl移液槍頭劃一平直線,PBS清洗后顯微鏡觀察劃痕區域寬度并拍照。然后將MCF-7、MDA-MB-231細胞置于含有不同濃度金絲桃苷(75和100 μmol/L)的2% FBS的培養基中培養24 h,再次觀察劃痕寬度變化并拍照,Image Pro測量劃痕寬度。

1.11Western印跡檢測蛋白表達 收集處理后的MCF-7、MDA-MB-231細胞,PBS沖洗后冰上裂解提取總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白樣品后,取40 μg蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,以β-actin為內參,加入HSP90AA1一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次后加二抗室溫下孵育2 h,電化學發光(ECL)法顯色,ImageJ分析蛋白條帶灰度值。

1.12統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析,兩兩比較使用SNK-q法。

2 結 果

2.1基于網絡藥理學預測金絲桃苷治療乳腺癌靶點 共獲得金絲桃苷-乳腺癌交集靶點24個,利用這24個生物靶點使用STRING工具繪制金絲桃苷治療乳腺癌的最佳PPI網絡(圖1)。

圖1 金絲桃苷-乳腺癌交集靶點的PPI網絡

利用Ualcan在線工具分析這24個基因在乳腺癌中表達水平。結果表明,有ESR2、HSP90AA1、TOP1、PTPN1、DNMT1、CDC25B、FLT3、ESR1、MIF、TERT、CA 9共11個基因在乳腺癌中表達上調。對這11個基因進一步進行K-M曲線分析,結果表明熱休克蛋白(HSP)90AA1 ESR1表達水平與乳腺癌生存狀態相關。下載TCGA_BRCA表達矩陣和臨床信息,乳腺癌組織中HSP90AA1 mRNA表達(31 320±550)較癌旁組織(23 410±432)明顯上升(P<0.05),HSP90AA1表達與乳腺癌患者生存相關(P<0.05,圖2),且隨著T分期〔Ⅰ～Ⅱ期(28 210±764) vs Ⅲ～Ⅳ期(32 430±690)〕和臨床分期〔T1(30 620±560) vs T2～4(33 530±1 472)〕進展,HSP90AA1表達水平依次升高(P<0.05)。此外,HSP90AA1表達與乳腺癌預后〔預后良好(28 492±1 204) vs 預后不良(35 174±1 682)〕密切相關(P<0.05)。本研究選擇HSP90AA1進行研究。

圖2 HSP90AA1高表達和低表達患者Kaplan-Meier生存曲線

2.2金絲桃苷對乳腺癌細胞體外增殖、遷移和侵襲的影響 CCK-8實驗中,乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞活力隨著金絲桃苷濃度升高而逐漸下降,IC50值分別為75.66、98.67 μmol/L。見圖3。與Control組比較,金絲桃苷明顯抑制MCF-7、MDA-MB-231細胞的體外增殖、明顯增加劃痕寬度,明顯減少侵襲細胞數(P<0.05)。見表1、圖4、表2。

表1 金絲桃苷對乳腺癌細胞體外增殖的影響

表2 兩組乳腺癌細胞劃痕寬度、侵襲細胞數比較

圖3 CCK-8檢測乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞對金絲桃苷治療的敏感性

圖4 金絲桃苷對乳腺癌細胞體外遷移和侵襲的影響(結晶紫染色,×200)

2.3金絲桃苷對乳腺癌細胞裸鼠移植瘤生長的影響 與Control組比較,金絲桃苷組腫瘤體積、腫瘤重量明顯下降,移植瘤組織中Ki67蛋白表達顯著下調(P<0.01,P<0.001)。見圖5、表3。

表3 兩組移植瘤體積、重量及瘤組織中Ki67蛋白比較

圖5 金絲桃苷對乳腺癌細胞裸鼠移植瘤生長的影響(IHC,×400)

2.4金絲桃苷抑制HSP90AA1的表達 金絲桃苷在體外呈濃度、時間依賴性抑制乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞HSP90AA1蛋白表達(P<0.05),見表4、5,圖6。

表4 不同濃度金絲桃苷對HSP90AA1表達的影響

表5 不同金絲桃苷處理時間對HSP90AA1表達的影響

圖6 Western印跡檢測不同濃度、處理時間金絲桃苷對HSP90AA1表達的影響

2.5金絲桃苷抑制HSP90AA1對乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響 與Control組比較,MCF-7和MDA-MB-231細胞轉染HSP90AA1過表達質粒后,HSP90AA1蛋白表達顯著上調,并促進其細胞活力、劃痕寬度明顯增大,侵襲細胞數明顯減少(P<0.05);金絲桃苷處理顯著抑制乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞的活力、增大劃痕寬度、減少侵襲細胞數(P<0.05),而恢復HSP90AA1表達能夠逆轉金絲桃苷的上述抑癌功能(P<0.05),見表6、圖7、圖8。

表6 各組乳腺癌HSP90AA1蛋白表達、細胞活力、劃痕寬度及侵襲細胞數比較

圖7 各組細胞遷移、侵襲(結晶紫染色,×200)

1～4：Control組、金絲桃苷組、HSP90AA1組、金絲桃苷+HSP90AA1組圖8 Western印跡檢測4組HSP90AA1蛋白表達

3 討 論

以往研究已經證實金絲桃苷對多種腫瘤細胞具有抗腫瘤活性〔6,7〕,然而由于腫瘤的異質性,金絲桃苷對乳腺癌細胞的作用尚不清楚。HSP90AA1屬于HSP90家族成員。HSP90AA1經歷了一個與其ATP酶活性相關的功能循環,這個周期可能引起特定蛋白的構象變化,從而引起其激活。此外,HSP90AA1可以與多種共同伴侶相互作用,調節其底物識別、ATP酶周期和伴侶功能〔8,9〕。在眾多惡性生長和侵襲性腫瘤樣本中檢測到高水平的HSP90AA1表達〔10〕。近年來利用蛋白組學等方法獲得在腫瘤與正常組織中的差異表達分子或基因,有助于指導相關靶向藥物的研發。有研究者應用生物信息學分析發現,HSP90AA1 mRNA在乳腺癌組織中表達上調,且其高表達與較短的總生存期和無進展生存期密切相關〔11〕。本研究結果與賈真等〔11〕研究結果相一致。

腫瘤細胞的增殖能力異常使得腫瘤能在體內能非正常生長〔12〕。之前的報道〔13〕顯示,金絲桃苷能抑制肺癌細胞的增殖與遷移。在本研究體外細胞實驗中,金絲桃苷呈劑量依賴性抑制了MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞的增殖速率。研究〔14,15〕表明,Ki67是反映細胞增殖能力的重要標志,本研究提示金絲桃苷可能通過內源性途徑抑制乳腺癌細胞增殖。本研究進一步證實金絲桃苷具有明顯的抗腫瘤活性。本研究結果表明,HSP90AA1是金絲桃苷抗乳腺癌的重要功能靶點。

綜上,HSP90AA1在乳腺癌表達上調,并與乳腺癌分期晚和不良預后密切相關;此外,金絲桃苷能抑制乳腺癌的增殖、遷移和侵襲,其機制與抑制HSP90AA1表達有關。