circZNF652靶向調控miR-17-5p對糖氧剝奪誘導的人腦血管內皮細胞損傷的影響

王秋蓮 吳著明 葉鵬飛

(大冶市人民醫院神經內科,湖北 大冶 435100)

缺血性腦卒中是常發生于中老年人群中的一種腦血管疾病,目前臨床常采用溶栓治療等方法,而血管再通是最有效的方法,但血液供應后氧自由基可造成細胞再灌注損傷,進而造成腦組織損傷,同時缺氧條件下腦血管內皮細胞損傷可進一步損害神經功能,因而如何減輕腦血管內皮細胞損傷對改善缺血性腦卒中等腦血管疾病患者的預后具有重要意義〔1～3〕。環狀RNA(circRNA)在腦血管疾病中表達異常,并可參與腦血管內皮細胞損傷過程〔4〕。但circRNA在糖氧剝奪(OGD)誘導的人腦血管內皮細胞損傷中的作用機制尚未闡明。circZNF652在脂多糖誘導的肺炎中表達水平升高,抑制其表達可通過調節miR-181a減輕脂多糖誘導的炎癥損傷〔5〕。生物信息學分析顯示circZNF652與miR-17-5p存在結合位點,研究發現,miR-17-5p在缺氧/復氧誘導的人腦微血管內皮細胞中的表達明顯下調,miR-17-5p過表達可通過靶向磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)而減輕細胞氧化損傷〔6〕。但circZNF652是否通過靶向調控miR-17-5p影響人腦血管內皮細胞(HBVEC)損傷尚不十分清楚。因此,本研究采用OGD誘導的HBVEC建立細胞損傷模型,探討circZNF652/miR-17-5p分子軸對細胞增殖、凋亡及氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 HBVEC購自美國ATCC;Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher;乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;CCK-8試劑、凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶;實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)系列試劑盒購自北京天根生化;si-circZNF652、miR-17-5p mimics、anti-miR-17-5p及其陰性對照物購自廣州銳博生物;兔抗人蛋白水解酶(CHOP)單克隆抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-12多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自英國Abcam。

1.2實驗分組 HBVEC培養在DMEM完全培養液中,于37 ℃培養箱內進行培養,每2～3 d傳代1次。取對數生長期HBVEC接種于6孔板(1×104個/孔),24 h后棄舊培養基,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,更換為無糖DMEM培養基,于95%N2、5%CO2的培養箱內培養6 h,構建細胞OGD損傷模型〔7〕,記為OGD組。在制備OGD損傷模型時同步更換為無血清的培養基處理HBVEC,于37 ℃、5%CO2的培養箱內培養,記為Con組。無血清培養基分別稀釋si-NC、si-circZNF652、miR-NC、miR-17-5p mimics、si-circZNF652與anti-miR-NC(共轉染)、si-circZNF652與anti-miR-17-5p(共轉染)后室溫孵育5 min,同時用無血清培養基稀釋Lipofectamine2000,分別將脂質體稀釋液與基因稀釋液共同加入HBVEC培養24 h后進行OGD處理,分別記為OGD+si-NC組、OGD+si-circZNF652組、OGD+miR-NC組、OGD+miR-17-5p組、OGD+si-circZNF652+anti-miR-NC組、OGD+si-circZNF652+anti-miR-17-5p組。

1.3qRT-PCR檢測細胞中circZNF652與miR-17-5p表達水平 用RNA提取試劑盒提取HBVEC總RNA,按照試劑盒說明書加入細胞裂解液裂解細胞后提取RNA,檢測RNA濃度后將RNA反轉錄為cDNA,然后通過PCR儀檢測目的基因表達情況,2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.4檢測氧化應激指標LDH、SOD、MDA水平 采集細胞上清液,根據LDH試劑盒說明書檢測LDH水平。取各組HBVEC,棄培養基,PBS洗滌,用細胞裂解液裂解細胞,檢測細胞MDA水平與SOD活性,操作步驟按照試劑盒說明書。

1.5CCK-8實驗檢測細胞增殖 各組HBVEC以2×103個/孔接種于96孔板,培養24 h后,每孔分別加入10 μl CCK-8溶液于37 ℃條件下孵育2 h,檢測波長450 nm處OD值并計算細胞存活率。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡情況 HBVEC以1×104個/孔接種于6孔板中,繼續培養24 h后,用胰蛋白酶消化后收集細胞,按照凋亡檢測試劑盒說明書操作,分別加入200 μl結合緩沖液重懸細胞,再分別加入5 μl膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和碘化丙啶(PI),室溫避光孵育20 min,快速使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7雙熒光素酶報告基因檢測circZNF652與miR-17-5p的靶向關系 攜帶circZNF652與miR-17-5p結合位點序列克隆至pMIR-REPORT熒光素酶報告質粒中,即合成野生型載體WT-circZNF652,用Quickchange XL位點定向誘變試劑盒構建突變體報告基因(MUT-circZNF652),HBVEC接種于96孔板(2×103個/孔),分別將miR-17-5p mimics、miR-NC質粒與WT-circZNF652或MUT-circZNF652共轉染,48 h后收集細胞并檢測細胞熒光素酶活性。

1.8Western印跡檢測CHOP、Caspase-12蛋白表達 預冷RIPA裂解液用于提取各組HBVEC蛋白100 ℃條件下煮沸變性,10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行電泳分離蛋白,并進行轉膜、封閉,在4 ℃條件下與CHOP(1∶1 000)、Caspase-12(1∶1 000)及內參GAPDH(1∶1 000)一抗共同孵育過夜,然后在室溫條件下與二抗(1∶2 000)共同孵育1 h,用ImageJ軟件分析蛋白條帶。

1.9統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1OGD誘導的HBVEC中circZNF652與miR-17-5p表達量比較 OGD組circZNF652水平(2.59±0.40)明顯高于Con組(1.00±0.05;t=11.833,P<0.001),miR-17-5p水平(0.32±0.06)明顯低于Con組(1.00±0.07;t=22.127,P<0.001)。

2.2干擾circZNF652對OGD誘導的HBVEC氧化應激、增殖及凋亡的影響 OGD組細胞LDH、MDA水平、凋亡率、CHOP、Caspase-12蛋白水平均明顯高于Con組,SOD活性和存活率明顯低于Con組;OGD+si-circZNF652組miR-17-5p水平、SOD活性、存活率明顯高于OGD+si-NC組,LDH和MDA水平、凋亡率、CHOP、Caspase-12蛋白水平明顯低于OGD+si-NC組(均P<0.05),見表1、圖1、圖2。

圖1 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

1～8：Con組、OGD組、OGD+si-NC組、OGD+si-circZNF652組、OGD+miR-NC組、OGD+miR-17-5p組、OGD+si-circZNF652+anti-miR-NC組、OGD+si-circZNF652+anti-miR-17-5p組圖2 Western印跡檢測各組CHOP、Caspase-12蛋白表達

表1 干擾circZNF652對OGD誘導的HBVEC氧化應激、增殖及凋亡的影響

2.3miR-17-5p過表達對OGD誘導的HBVEC氧化應激、增殖及凋亡的影響 與OGD+miR-NC組比較,OGD+miR-17-5p組LDH、MDA、凋亡率及CHOP、Caspase-12蛋白水平明顯降低,SOD活性和細胞存活率明顯升高(均P<0.05),見圖1、圖2、表2。

表2 miR-17-5p過表達對OGD誘導的HBVEC氧化應激、增殖及凋亡的影響

2.4抑制miR-17-5p表達可部分逆轉干擾circZNF652對OGD誘導的HBVEC氧化應激、增殖及凋亡的作用 與OGD+si-circZNF652+anti-miR-NC組比較,OGD+si-circZNF652+anti-miR-17-5p組miR-17-5p表達水平、SOD活性、細胞存活率明顯降低,LDH、MDA水平、凋亡率及CHOP、Caspase-12蛋白水平明顯升高(均P<0.05),見圖1、圖2、表3。

表3 抑制miR-17-5p表達可部分逆轉干擾circZNF652對OGD誘導的HBVEC氧化應激、增殖及凋亡的作用

2.5circZNF652靶向調控miR-17-5p circZNF652與miR-17-5p存在結合位點,見圖3。轉染野生型載體WT-circZNF652細胞共轉染miR-17-5p mimics后熒光素酶活性(0.29±0.04)較共轉染miR-NC(1.01±0.04)明顯降低(t=38.184;P<0.001),而轉染突變型載體MUT-circZNF652細胞熒光素酶活性(1.01±0.04)較共轉染miR-NC(1.00±0.03)無明顯差異(t=0.600,P=0.557)。

圖3 circZNF652靶向結合miR-17-5p

3 討 論

circRNA具有普遍性、穩定性與特異性等特點,其基因序列上富含多個miRNA結合位點,可通過吸附miRNA而調節靶mRNA轉錄后水平,進而調控細胞生長及發育等生物學過程,目前circRNA在腦血管疾病中表達異常,并可能參與其發生及發展過程,如circ_2858在腦膜炎中上調,并可通過調控miR-93-5p而增加血管內皮生長因子(VEGF)A進而破壞血腦屏障〔8,9〕。沉默circRNA細胞周期依賴激酶抑制劑2B基因的反義非編碼基因(ANRIL)通過充當miR-622的海綿分子而減輕氧葡萄糖剝奪/復氧誘導的人腦微血管內皮細胞損傷〔10〕。

有報道指出,circZNF652在腎癌、肝癌等腫瘤細胞中上調,并促進細胞惡性生物學行為〔11,12〕。本研究結果提示,circZNF652高表達量可能促進腦血管內皮細胞損傷。本研究與季兆潔等〔13〕結果相似,提示成功建立HBVEC損傷模型。本研究結果提示,干擾circZNF652表達可抑制氧化應激反應而減輕OGD誘導的HBVEC氧化損傷。當大腦損傷時會誘發氧化應激反應進而促使神經細胞凋亡,內質網是蛋白質合成與分泌的重要場所,當細胞出現氧化應激反應時可造成內質網生理功能紊亂而引發內質網應激,進而激活細胞凋亡途徑最終促使細胞凋亡,CHOP是內質網應激的標志性蛋白,其表達水平升高可激活細胞凋亡途徑,同時研究表明,內質網應激誘導的細胞凋亡途徑與Caspase-12蛋白有關〔14,15〕。本研究結果提示,干擾circZNF652表達可通過抑制氧化應激、內質網應激而抑制細胞凋亡,并可促進細胞增殖進而保護OGD誘導的HBVEC損傷。本研究還提示,circZNF652可能通過調控miR-17-5p而損傷HBVEC。研究表明,LncRNA通過調節miR-17-5p/Toll樣受體(TLR)4促進脂多糖誘導的巨噬細胞炎性損傷〔16〕。抑制LncRNA肺癌轉移相關轉錄本(MALAT)1通過靶向miR-17-5p/叉頭盒蛋白(FOX)A1軸可減輕脂多糖誘導的肺上皮細胞損傷〔17〕。miR-17-5p過表達通過靶向E2F1而抑制細胞凋亡從而減輕高糖誘導的內皮細胞損傷〔18〕。表明miR-17-5p高表達可能對細胞損傷發揮保護作用。本研究結果提示,circZNF652可靶向調控miR-17-5p而造成OGD誘導的HBVEC損傷。

綜上,OGD誘導的HBVEC中circZNF652表達水平升高,miR-17-5p表達水平降低,干擾circZNF652表達可促進miR-17-5p表達,二者之間存在靶向調控關系,干擾circZNF652表達可通過上調miR-17-5p促進細胞增殖,并抑制氧化應激、內質網應激、凋亡進而減輕OGD誘導的HBVEC損傷,但其具體作用機制仍需進一步探討。