血管性癡呆銅死亡關(guān)鍵差異基因的生物信息學(xué)分析及防治中藥篩選

卓桂鋒，陳 煒，朱健敏，匡龍嬌，廖乃彬，張金枝，蘇明陽(yáng)，吳 林, 3*

·數(shù)據(jù)挖掘與循證醫(yī)學(xué)·

血管性癡呆銅死亡關(guān)鍵差異基因的生物信息學(xué)分析及防治中藥篩選

卓桂鋒1, 2，陳 煒2，朱健敏1，匡龍嬌1，廖乃彬2，張金枝2，蘇明陽(yáng)2，吳 林1, 3*

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 南寧 530022 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530022 3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530022

通過機(jī)器學(xué)習(xí)等生物信息學(xué)方法篩選參與血管性癡呆（vascular dementia，VaD）發(fā)病機(jī)制的銅死亡關(guān)鍵差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），并預(yù)測(cè)和分析具有防治作用的中藥。基于GSE33000數(shù)據(jù)集篩選銅死亡DEGs并分析其相關(guān)性；對(duì)數(shù)據(jù)集樣本進(jìn)行聚類分型，應(yīng)用基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）分型后通路富集情況；應(yīng)用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析與VaD關(guān)系密切的基因并取交集獲得重要基因；構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)列線圖模型篩選重要基因的風(fēng)險(xiǎn)因子；基于風(fēng)險(xiǎn)因子構(gòu)建多種機(jī)器學(xué)習(xí)方法的預(yù)測(cè)模型并將其與銅死亡DEGs進(jìn)行相關(guān)性分析得到關(guān)鍵基因，并進(jìn)行防治中藥的篩選。共獲得銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶β（ATPase copper transporting beta，）、硫辛酸合成酶（lipoic acid synthetase，）等9個(gè)銅死亡DEGs，其相互之間表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同或拮抗效應(yīng)。根據(jù)銅死亡DEGs可將VaD患者分為2種亞型且DEGs在亞型間表達(dá)有所差異。分型后GSVA通路富集結(jié)果涉及刺猬信號(hào)通路等；綠松石模塊（37個(gè)差異基因）與VaD分型高度相關(guān)，其與數(shù)據(jù)集DEGs交集得到5個(gè)重要基因，其中可能是VaD的風(fēng)險(xiǎn)因子。廣義線性模型（generalized linear models，GLM）機(jī)器學(xué)習(xí)模型的預(yù)測(cè)性能最高。脂酰基轉(zhuǎn)移酶2（lipoyltransferase 2，）、二氫脂酰胺-乙酰基轉(zhuǎn)移酶（dihydrolipoamide-acetyltransferase，）、二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoamide dehydrogenase，）、丙酮酸脫氫酶E1亞基β（pyruvate dehydrogenase E1 subunit beta，）與金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子1（metal regulatory transcription factor 1，）與風(fēng)險(xiǎn)因子相關(guān)性較強(qiáng)，可作為銅死亡關(guān)鍵DEGs，其中、的表達(dá)與VaD患者年齡負(fù)相關(guān)（＜0.01）。根據(jù)銅死亡DEGs篩選出海蛤殼、魚鰾膠等29味中藥，其四氣五味多屬寒、溫、平，苦、甘，歸胃、腎、心、肝經(jīng)，多為清熱補(bǔ)虛藥。、等9個(gè)銅死亡DEGs相互調(diào)控作用及其相關(guān)的刺猬信號(hào)通路可能是VaD銅死亡相關(guān)發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，其中、、、與是銅死亡關(guān)鍵基因。GLM機(jī)器學(xué)習(xí)模型可以較準(zhǔn)確診斷VaD。、等銅死亡DEGs可能有助于闡釋VaD火熱內(nèi)盛伴有氣虛或腎精虧虛證型的實(shí)質(zhì)機(jī)制，海蛤殼、魚鰾膠等中藥可能為防治VaD潛在分子藥物的來源。

血管性癡呆；銅死亡；清熱補(bǔ)虛藥；證候?qū)嵸|(zhì)；機(jī)器學(xué)習(xí)；廣義線性模型；海蛤殼；魚鰾膠

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為特征，通常被認(rèn)為是老年人中僅次于阿爾茨海默病的第2大常見的癡呆癥類型[1]。VaD可導(dǎo)致生活質(zhì)量持續(xù)和不可逆轉(zhuǎn)的惡化，給家庭和社會(huì)帶來了巨大的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而，由于VaD的臨床異質(zhì)性和病理類型的復(fù)雜性，其發(fā)病機(jī)制仍未闡明，亦缺乏安全有效的防治手段。

銅離子作為酶的輔助因子，其穩(wěn)態(tài)的維持主要依賴于線粒體的調(diào)節(jié)。銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)已被證明與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[2]。銅死亡是最近發(fā)現(xiàn)的一種新的不同于其他氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡形式。以銅參與的脂酰化線粒體酶過度累積和鐵-硫簇蛋白消耗為特征的線粒體應(yīng)激是引起銅死亡的主要機(jī)制[3-4]。同時(shí)，研究表明線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激可能是VaD進(jìn)展的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制[5]。因此，有理由推斷銅死亡與VaD的病程進(jìn)展密切相關(guān)。然而，目前尚未有從銅死亡角度探討VaD的發(fā)病機(jī)制研究。進(jìn)一步闡明銅死亡相關(guān)基因（cuprotosis-related genes，CRGs）的分子特征，可能有助于闡明VaD病理類型的復(fù)雜性和發(fā)病機(jī)制和探索有效防治手段。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集和預(yù)處理

以“vascular dementia”為關(guān)鍵詞，檢索GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)數(shù)據(jù)集提供的相關(guān)信息，獲得所需芯片GSE122063。GSE122063共有80個(gè)樣本，其中包含36個(gè)VaD患者和44個(gè)健康人的樣本（正常），樣本來源于人大腦皮層。注釋數(shù)據(jù)后通過“l(fā)imma”R包對(duì)GSE122063的原始基因表達(dá)譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正得到normalize.txt。

1.2 銅死亡差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）的篩選

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]獲得19個(gè)銅死亡相關(guān)基因文本gene.txt。利用“l(fā)imma”“pheatmap”“reshape2”“ggpubr”和“RCircos”R包對(duì)normalize.txt和gene.txt進(jìn)行分析，獲取銅死亡相關(guān)基因表達(dá)量的文本CuproptosisGeneExp.txt，通過wilcox.test檢驗(yàn)[8]，以校正后的＜0.05為閾值篩選銅死亡相關(guān)DEGs，進(jìn)行可視化處理，輸出箱線圖。

1.3 銅死亡DEGs相關(guān)性分析

為進(jìn)一步研究銅死亡DEGs的相互關(guān)系，利用“corrplot”和“circlize”R包對(duì)其進(jìn)行分析，最后進(jìn)行可視化處理。

1.4 樣品聚類分型

基于銅死亡DEGs使用“ConsensusClusterPlus”R包對(duì)數(shù)據(jù)集中的樣本進(jìn)行分型，使用“pheatmap”“reshape2”和“ggpubr”R包對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行分析，并構(gòu)建亞型箱圖和熱圖。為觀察各亞型樣本內(nèi)部的相似性和不同分型樣本之間的區(qū)分度，使用“l(fā)imma”和“ggplot2”R包對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行分析，并繪制主成分分析（principal component analysis，PCA）散點(diǎn)圖。

1.5 分型后基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）通路富集分析

基于“1.4”項(xiàng)的分型結(jié)果，對(duì)normalize.txt進(jìn)行GSVA通路富集分析，篩選出校正后＜0.05且上調(diào)或下調(diào)顯著性前5名的通路，并繪制柱狀圖。

1.6 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）

基于分型結(jié)果與normalize.txt，使用“WGCNA”R包進(jìn)行WGCNA以識(shí)別共表達(dá)模塊。方差最高的前25%基因用于后續(xù)WGCNA，以保證質(zhì)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。選擇滿足無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)的標(biāo)準(zhǔn)軟閾值β構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)化拓?fù)渲丿B矩陣（topological overlap matrix，TOM）。當(dāng)最小模塊大小設(shè)置為100時(shí)，采用基于層次聚類樹算法的TOM不相似度量（1-TOM）獲得模塊。以基因與模塊相關(guān)性＞0.8，基因顯著性＜0.05為條件篩選模塊內(nèi)核心基因。

1.7 重要基因的篩選

利用“l(fā)imma”等包對(duì)normalize.txt進(jìn)行分析，以｜log2FC｜≥1且校正后＜0.05為篩選條件，獲取GSE122063的DEGs并與“1.6”項(xiàng)篩選出來的臨床性狀模塊核心基因取交集得到重要基因。

1.8 構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)列線圖模型

基于重要基因和normalize.txt，采用“rms”和“rmda”R包構(gòu)建列線圖模型，篩選風(fēng)險(xiǎn)因子，繪制決策曲線以評(píng)價(jià)該列線圖模型的臨床有效性。

1.9 基于多種機(jī)器學(xué)習(xí)方法的預(yù)測(cè)模型構(gòu)建

基于“1.8”項(xiàng)結(jié)果中的風(fēng)險(xiǎn)因子，將GSE122063數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)按7∶3分為訓(xùn)練組和測(cè)試組，訓(xùn)練組用于分類模型的構(gòu)建，測(cè)試組用于驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。利用“caret”“DALEX”“ggplot2”“randomForest”“kernlab”和“xgboost”R包構(gòu)建極限梯度上升（eXtreme gradient boosting，XGB）模型、廣義線性模型（generalized linear models，GLM）、隨機(jī)森林（random forest，RF）模型和支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）模型，并對(duì)共風(fēng)險(xiǎn)因子進(jìn)行分析，得到4種模型的殘差箱線圖，采用“pROC”包繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，根據(jù)殘差箱線圖和ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）選擇最優(yōu)模型及評(píng)估預(yù)測(cè)性能。

1.10 銅死亡DEGs與風(fēng)險(xiǎn)因子相關(guān)性分析

為進(jìn)一步研究銅死亡DEGs與高風(fēng)險(xiǎn)因子的相互關(guān)系，利用“corrplot”和“circlize”R包對(duì)其進(jìn)行分析，得出關(guān)鍵基因，最后進(jìn)行可視化處理。

1.11 銅死亡DEGs的中藥篩選

將銅死亡DEGs作為預(yù)測(cè)靶標(biāo)，在醫(yī)學(xué)本體信息檢索數(shù)據(jù)庫(kù)（CoremineMedical）中以＜0.05為條件，篩選對(duì)各預(yù)測(cè)靶標(biāo)具有生物學(xué)效應(yīng)的前10位中藥，并進(jìn)行四氣五味、歸經(jīng)和功效分析。

2 結(jié)果

2.1 銅死亡DEGs

如圖1所示，共篩選出9個(gè)銅死亡DEGs。其中，銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶β（ATPase copper transporting beta，）、硫辛酸合成酶（lipoic acid synthetase，）、脂酰基轉(zhuǎn)移酶1（lipoyltransferase 1，）、金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子1（metal regulatory transcription factor 1，）在VaD皮層組織中的表達(dá)水平較高，而NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，）、脂酰基轉(zhuǎn)移酶2（lipoyltransferase 2，）、二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoamide dehydrogenase，）、二氫脂酰胺-乙酰基轉(zhuǎn)移酶（dihydrolipoamide-acetyltransferase，）、丙酮酸脫氫酶E1亞基β（pyruvate dehydrogenase E1 subunit beta，）在VaD皮層組織中的表達(dá)水平明顯低于正常組。

2.2 銅死亡DEGs相關(guān)性分析

對(duì)以上DEGs進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示和、，和表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)；和、表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗效應(yīng)（圖2）。

2.3 樣品聚類分型分析

根據(jù)銅死亡DEGs對(duì)數(shù)據(jù)集中的額葉樣本進(jìn)行分型，結(jié)果顯示當(dāng)值設(shè)置為2時(shí)，共識(shí)聚類矩陣區(qū)分度最明顯，聚類數(shù)量最穩(wěn)定，各個(gè)亞型的一致性評(píng)分最高。PCA散點(diǎn)圖亦顯示2個(gè)亞型之間存在顯著差異。因此，最終將36例VaD患者分為2個(gè)亞型：C1（＝6）、C2（＝30）。見圖3。為了進(jìn)一步探索亞型間的分子特征，綜合評(píng)估了銅死亡DEGs在各亞型的表達(dá)差異。圖4可觀察到C1和C2 2種亞型DEGs的表達(dá)情況。在C1中明顯高表達(dá)；、、、、和在C2中明顯高表達(dá)。

*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

A-相關(guān)性分析扇形圖 B-相關(guān)性分析圈圖

2.4 分型后GSVA通路富集分析

結(jié)果顯示，通過分型后GSVA通路富集分析，富集到上調(diào)與下調(diào)顯著性前5條通路。其中，下調(diào)通路涉及核苷酸切除修復(fù)、去氧核糖核酸的復(fù)制、錯(cuò)配修復(fù)、組氨酸代謝和非同源端連接；上調(diào)通路涉及青少年成熟型糖尿病、刺猬信號(hào)通路、2型糖尿病、硫代謝和嗅覺轉(zhuǎn)導(dǎo)。見圖5。

2.5 WGCNA

利用WGCNA算法建立共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和模塊，識(shí)別與VaD銅死亡聚類分型密切相關(guān)的關(guān)鍵基因模塊。結(jié)果顯示，根據(jù)無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)的擬合度0.8，得到構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的最佳軟閾值3（圖6-A）。其中1個(gè)模塊包含3026個(gè)基因被確定為顯著模塊，熱圖描繪了所有模塊相關(guān)基因的TOM（圖6-B）。基因模塊與臨床性狀之間的相關(guān)性如圖6-C所示，綠松石模塊與VaD分型高度相關(guān)。其中，綠松石模塊基因（37個(gè)）與所選模塊具有顯著的相關(guān)性（圖6-D）。

2.6 重要基因的篩選結(jié)果

如圖7所示，通過與正常組對(duì)比分析，GSE122063芯片獲得VaD所有DEGs 294個(gè)，與WGCNA篩選出來的臨床性狀模塊差異基因取交集得到5個(gè)重要基因含113螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白（coiled-coil domain-containing protein 113，CCDC113）、、、和EF手結(jié)構(gòu)域1蛋白磷酸酶（protein phosphatase with EF-hand domain 1，PPEF1）。見圖7。

A-k＝0.2～0.9，累積分布函數(shù)呈現(xiàn)一致性分布 B-k值不同，集群的穩(wěn)定性有所不同 C-k＝2時(shí)，共識(shí)聚類矩陣區(qū)分度最明顯 D-k＝2時(shí)，各亞型的一致性評(píng)分最高 E-聚類分型PCA散點(diǎn)圖

*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

圖5 銅死亡DEGs相關(guān)分型后GSVA通路富集分析

A-軟閾值圖 B-模塊聚類圖 C-模塊-臨床性狀關(guān)系圖 D-綠松石模塊基因顯著性散點(diǎn)圖

A-GSE122063火山圖 B-韋恩圖

2.7 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)列線圖模型

為了評(píng)估重要基因的預(yù)測(cè)效能，需構(gòu)建1個(gè)列線圖模型。結(jié)果顯示，基因可能是VaD的風(fēng)險(xiǎn)因子。校正曲線顯示，基于重要基因構(gòu)建列線圖模型來分析VaD患者的預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)概率與實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)之間的誤差非常小。決策曲線顯示列線圖模型具有較高的準(zhǔn)確性，可為臨床決策提供依據(jù)。見圖8。

2.8 機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)模型

如圖9所示，基于風(fēng)險(xiǎn)因子建立了4種經(jīng)過驗(yàn)證的機(jī)器學(xué)習(xí)模型：XGB、GLM、RF和SVM。殘差箱線圖顯示GLM機(jī)器學(xué)習(xí)模型的殘差相對(duì)較低，ROC曲線顯示GLM機(jī)器學(xué)習(xí)模型AUC最高（AUC＝0.838），表明基于風(fēng)險(xiǎn)因子的GLM機(jī)器學(xué)習(xí)模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性較好。

A-VaD患者列線圖模型 B-校正曲線驗(yàn)證 C-決策曲線驗(yàn)證

A-各機(jī)器學(xué)習(xí)模型殘差箱線圖（紅點(diǎn)代表殘差的均方根） B-各機(jī)器學(xué)習(xí)模型ROC曲線

2.9 銅死亡DEGs與風(fēng)險(xiǎn)因子相關(guān)性分析

如圖10所示，和、、、表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗效應(yīng)；和表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)。、、、與可作為銅死亡關(guān)鍵DEGs。

圖10 銅死亡DEGs與風(fēng)險(xiǎn)因子相關(guān)性分析

2.10 銅死亡DEGs的中藥篩選

經(jīng)過篩選共得到29味中藥，見表1。四氣五味、歸經(jīng)與功效分析結(jié)果顯示，藥物四氣多屬寒、溫、平，五味多屬苦、甘，歸經(jīng)主要集中在胃、腎、心和肝經(jīng)，功效多與清熱補(bǔ)虛相關(guān)。見圖11。

3 討論

由于VaD病理的異質(zhì)性和復(fù)雜性，目前對(duì)VaD的治療缺乏足夠的療效。在過去的幾十年里，VaD的抗神經(jīng)退行性治療取得了一些進(jìn)展，然而基于組織學(xué)的傳統(tǒng)分類對(duì)臨床治療依然欠缺有效的特異性指導(dǎo)作用[9]。因此，識(shí)別更合適的分子相關(guān)的分型可能對(duì)指導(dǎo)VaD的個(gè)體化治療至關(guān)重要。銅死亡是最近報(bào)道的一種銅依賴細(xì)胞死亡形式，主要表現(xiàn)為脂酰化線粒體酶的累積，與多種疾病的進(jìn)展密切相關(guān)[10]。目前，銅死亡在VaD中的調(diào)控機(jī)制尚未得到研究。因此，本研究試圖闡明銅死亡相關(guān)基因在VaD發(fā)病機(jī)制中的具體作用，并利用銅死亡相關(guān)基因預(yù)測(cè)VaD亞型。

表1 基于銅死亡DEGs的中藥預(yù)測(cè)

本研究首次全面分析了正常健康人和VaD患者腦組織中銅死亡調(diào)節(jié)因子的表達(dá)譜。與正常人群相比，VaD患者中較多銅死亡相關(guān)基因表達(dá)異常，提示其在VaD的發(fā)生中起重要作用。隨后分析了銅死亡DEGs之間的相關(guān)性，以闡明銅死亡調(diào)節(jié)因子與VaD之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些銅死亡相關(guān)DEGs具有顯著的協(xié)同或拮抗作用，說明它們?cè)赩aD發(fā)病機(jī)制中起到相互調(diào)控作用。為進(jìn)一步觀察銅死亡相關(guān)DEGs在VaD患者中是否存在不同的調(diào)控模式，本研究利用無(wú)監(jiān)督聚類分析對(duì)VaD樣本進(jìn)行聚類分型，并確定了2種亞型。與亞型1（C1）相比，亞型2（C2）具有較強(qiáng)的刺猬信號(hào)通路活性。據(jù)報(bào)道，抑制刺猬信號(hào)通路能抑制腦缺血性損傷早期纖維瘢痕的形成且不利于神經(jīng)功能的恢復(fù)[11]。因此，亞型2的VaD患者可能表現(xiàn)出更好的預(yù)后。

近年來，風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)列線圖模型和機(jī)器學(xué)習(xí)模型越來越多地應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)鍵基因的篩選和預(yù)測(cè)[12-13]。為進(jìn)一步篩選這9個(gè)銅死亡DEGs中的核心基因以及觀察風(fēng)險(xiǎn)因子預(yù)測(cè)效能，本研究對(duì)重要基因進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)列線圖模型、機(jī)器學(xué)習(xí)模型和相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，GLM模型的預(yù)測(cè)效能最高（AUC＝0.838），表明其具備臨床應(yīng)用價(jià)值；可能是VaD的高風(fēng)險(xiǎn)因子，、、、、與高度相關(guān)。

銅死亡主要包括銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。DLAT、PDHB和PDHA1共同組成丙酮酸脫氫酶復(fù)合體，催化三羧酸循環(huán)中的丙酮酸脫羧生成乙酰輔酶A，在線粒體呼吸調(diào)節(jié)銅離子誘導(dǎo)細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用[6,14]。Cu2+通過銅離子載體進(jìn)入依賴線粒體呼吸的細(xì)胞中過度蓄積，會(huì)與硫辛酰化DLAT結(jié)合，誘導(dǎo)DLAT的異聚化。異聚化的DLAT增加可產(chǎn)生細(xì)胞毒性，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。DLD是硫辛酸途徑的關(guān)鍵酶之一，其敲除后可明顯緩解銅離子載體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用[14]。同時(shí)研究表明，銅死亡相關(guān)基因和對(duì)肝癌患者的病程進(jìn)展、預(yù)后和免疫功能等方面具有重要意義[15]。上述基因都有可靠的證據(jù)支持它們參與調(diào)控銅死亡，但關(guān)于、、、和調(diào)控銅死亡在VaD中的作用研究尚未見報(bào)道。線粒體呼吸途徑是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的必要條件。據(jù)報(bào)道，腦缺血再灌注動(dòng)物模型三羧酸循環(huán)等能量代謝途徑明顯異常[16]。綜合本研究發(fā)現(xiàn)，VaD患者中較多銅死亡基因表達(dá)異常，進(jìn)一步提示銅死亡與VaD發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切，、、、和等銅死亡相關(guān)基因研究潛力較大。

A-四氣統(tǒng)計(jì)雷達(dá)圖 B-五味統(tǒng)計(jì)雷達(dá)圖 C-歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)雷達(dá)圖 D-功效柱狀圖

中醫(yī)將VaD歸屬“癡呆”“呆病”范疇，其基本病機(jī)為臟腑虛損、氣血虛弱，以致腦髓失養(yǎng)或邪實(shí)上擾清竅，其病性特征為本虛標(biāo)實(shí)。本研究對(duì)銅死亡DEGs進(jìn)行中藥預(yù)測(cè)與篩選，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的藥物四氣多屬寒、溫、平，五味多屬苦、甘，歸經(jīng)主要集中在胃、肝、心和腎經(jīng)，功效多與清熱補(bǔ)虛相關(guān)。從四氣五味角度來看，預(yù)測(cè)中藥苦寒以泄邪實(shí)，溫平甘以補(bǔ)虛，切合VaD本虛標(biāo)實(shí)的病性特點(diǎn)。從歸經(jīng)角度來看，預(yù)測(cè)中藥主要?dú)w于胃、腎、心和肝經(jīng)，亦與眾多學(xué)者從中焦脾胃、腎、心或者肝論治癡呆的觀點(diǎn)一致[17]。臨床上可將VaD分為痰濁阻竅證、腎精虧虛證、肝陽(yáng)上亢證、氣血虧虛證、火熱內(nèi)盛證及瘀血阻竅證[18]。以（方）藥測(cè)證是中醫(yī)臨床思維的重要方法和探討中醫(yī)“證”實(shí)質(zhì)的重要途徑之一[19]。從功效來看，預(yù)測(cè)中藥多為清熱補(bǔ)虛類，其中補(bǔ)虛類中藥以補(bǔ)氣虛如人參、人參葉和補(bǔ)腎如沙苑子、魚鰾膠為主，提示其對(duì)應(yīng)的證型為火熱內(nèi)盛伴有氣虛或腎精虧虛證，這也從側(cè)面反映臨床辨證VaD的復(fù)雜性。值得注意的是，這同時(shí)意味著等銅死亡DEGs很大可能有助于闡釋VaD火熱內(nèi)盛伴有氣虛或腎精虧虛證型的實(shí)質(zhì)機(jī)制。目前尚未見生物信息學(xué)結(jié)合預(yù)測(cè)中藥技術(shù)與證候?qū)嵸|(zhì)相關(guān)的研究報(bào)道。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)篩選VaD銅死亡DEGs、預(yù)測(cè)中藥進(jìn)而推測(cè)其火熱內(nèi)盛伴有氣虛或腎精虧虛證的實(shí)質(zhì)機(jī)制。這將有望為其證候?qū)嵸|(zhì)研究提供前期理論基礎(chǔ)。

本研究尚存在一定的局限性。首先，所采用的芯片數(shù)據(jù)雖然已滿足研究所需的樣本量，但因樣本量來源單一可能導(dǎo)致結(jié)果存在一定偏倚。其次，篩選VaD銅死亡DEGs和建立的預(yù)測(cè)模型，仍需后續(xù)的臨床或?qū)嶒?yàn)來驗(yàn)證。最后，通過預(yù)測(cè)中藥和以（方）藥測(cè)證中醫(yī)臨床思維方法對(duì)VaD火熱內(nèi)盛伴有氣虛或腎精虧虛證的證候?qū)嵸|(zhì)的初步探討，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡明。

綜上，本研究利用生物信息學(xué)、機(jī)器學(xué)習(xí)等方法對(duì)VaD的銅死亡DEGs進(jìn)行分析、預(yù)測(cè)其相關(guān)防治中藥并初步探討VaD的證候?qū)嵸|(zhì)，對(duì)后續(xù)證候?qū)嵸|(zhì)研究及臨床用藥具有參考意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Bioinformatics analysis of cuproptosis in vascular dementia and screening of traditional Chinese medicine for prevention and treatment

ZHUO Gui-feng1, 2, CHEN Wei2, ZHU Jian-min1, KUANG Long-jiao1, LIAO Nai-bin2, ZHANG Jin-zhi2, SU Ming-yang2, WU Lin1, 3

1. Science Experiment Center, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530022, China 2. TheFirst Clinical Faculty of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530022, China 3. Guangxi Key Laboratory of Basic Research of Traditional Chinese Medicine, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530022, China

Key cuproptosis differentially expressed genes (DEGs) involved in the pathogenesis of vascular dementia (VaD) were selected by machine learning and otherbioinformatics methods. Differentially expressed genes (DEGs) were analyzed.Cuproptosis DEGs were screened based on GSE33000 data set and their correlation was analyzed. Pathway enrichment was performed by cluster typing and gene set variation analysis (GSVA). The weighted gene co-expression network was used to analyze the genes closely related to VaD and the intersection was used to obtain the important genes. The risk prediction nomogram model was constructed to screen the risk factors of important genes. Based on the risk factors, a variety of predictive models of machine learning methods were constructed, and the correlation analysis between them and copper death DEGs was carried out to obtain key genes, and clinical correlation analysis and screening of prevention and treatment of traditional Chinese medicine were carried out.A total of nine cuproptosis DEGs including ATPase copper transporting beta () and lipoic acid synthetase () were obtained. DEGs showed strong synergistic or antagonistic effect between them. According to cuproptosis DEGs, VaD patients could be divided into two subtypes and the expression of DEGs was different among the subtypes. The enrichment results of GSVA pathway after typing involved hedgehog signaling pathway, etc. The turquoise module (37 differential genes) was highly correlated with VaD typing, and its intersection with the dataset differential genes resulted in five important genes, among whichmay be a risk factor for VaD. The prediction performance of generalized linear models (GLM) machine learning model is the highest. Lipoyltransferase 2 (), dihydrolipoamide-acetyltransferase (), dihydrolipoamide dehydrogenase (), pyruvate dehydrogenase E1 subunit beta () and metal regulatory transcription factor 1 () were strongly correlated with risk factors, and could be used as key DEGs for cuproptosis. The expressions of MTF1 and PDHB were negatively correlated with the age of VaD patients (< 0.01). According to cuproptosis death DEGs, 29 traditional Chinese medicines such as sea clam shells, icthyocolla were screened, and their four properties and five flavors were mainly cold, warm and flat, bitter, and sweet, and belonged to the stomach, kidney, heart, liver channels and clearing heat and tonifying deficiency.,and other 9 cuproptosis DEGs regulate each other and their related hedgehog signaling pathways may be an important link in the pathogenesis of cuproptosis in VaD, among which,,,andare key cuproptosis genes. GLM machine learning model can accurately diagnose VaD. ATP7B, LIAS and other cuproptosis DEGs may help to explain the parenteral mechanism of VaD fire-heat internalization accompanied bydeficiency or kidney essence deficiency syndrome. Sea clam shells, icthyocolla, and other traditional Chinese medicines may be sources of potential molecular drugs to combat VaD.

vascular dementia; cuproptosis; heat-clearing and deficiency-tonifying medicine; syndrome parenchyma; machine learning; generalized linear models; sea clam shell; icthyocolla

R285；Q811.4

A

0253 - 2670(2023)21 - 7120 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.021

2023-08-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82160885）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（YCSW2023384）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)2015年廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（KJT15007）；廣西中醫(yī)腦病臨床研究中心項(xiàng)目（桂科AD20238028）；廣西高等學(xué)校高水平創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及卓越學(xué)者計(jì)劃（桂教人才（2020）6號(hào)）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（院字 [2018]146）；廣西中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（GZXK-Z-20-13）

卓桂鋒，博士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治腦系疾病。E-mail: 12942105@qq.com

通信作者：吳 林，博士研究生導(dǎo)師，教授，從事中醫(yī)藥防治腦系疾病研究。E-mail: 358304005@qq.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]