古代經典名方保元湯的藥效物質基礎及其分子水平機制的研究

李淑慧，王 雅，田 軍，郭雨軒，張淑涵，牟 越，翁小剛，孫 奕

古代經典名方保元湯的藥效物質基礎及其分子水平機制的研究

李淑慧1, 2，王 雅2，田 軍3，郭雨軒1，張淑涵1，牟 越1，翁小剛1*，孫 奕1*

1. 中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700 2. 蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050 3. 江蘇萬邦生化醫藥集團有限責任公司，江蘇 徐州 221001

闡釋古代經典名方“保元湯”的藥效物質基礎并探討其分子水平的作用機制，發掘保元湯更多潛在的臨床應用優勢。采用UPLC-QTOF-MS/MS技術，選用Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，以0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）為流動相系統進行梯度洗脫，高分辨飛行時間質譜電噴霧電離源（ESI），正、負離子掃描模式，檢測鑒定保元湯的化學成分組成，并分析保元湯大鼠多次多天ig給藥后含藥血漿中的原型化學成分及代謝產物，進一步運用網絡藥理學方法，利用TCMSP數據庫和藥物信息數據庫等分析保元湯入血原型成分的靶向作用，并揭示其治療潛能。根據精確相對分子質量數據和多級質譜碎片離子，結合對照品、數據庫以及文獻報道，共鑒定出保元湯中133個化學成分，并且確定大鼠ig保元湯后，35個成分能夠經口吸收入血達到血漿穩態的藥物濃度。保元湯入血原型成分“成分-靶點”網絡圖、核心靶基因基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析、疾病預測分析表明，保元湯可通過人參皂苷Rb1、丹皮酚、刺芒柄花素、刺甘草查耳酮、大豆異黃酮、甘草查耳酮A、6-姜辣素、水楊酸等8個關鍵成分作用于絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、信號傳導及轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription）等核心靶點，通過糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGE）-晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end- products，RAGE）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、非受體酪氨酸激酶（janus kinase，JAK）-信號轉導子和轉錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）等信號通路等途徑發揮藥效作用，提示保元湯除治療慢性心力衰竭外，還對阿爾茨海默癥、再灌注損傷、絕經后骨質疏松癥等具有潛在治療優勢。保元湯35個入血原型成分中含有多個同類成分的衍生物，且其中既有單一成分對接多個靶點、又有多個類似物對接同一靶點的情況，由此佐證了“中藥（復方）多成分多靶點協同作用”和“中藥多成分單靶點疊加作用”的理論。采用高分辨質譜分析技術和網絡藥理學及其數據庫，可以為全面闡釋中藥（復方）藥效物質基礎及探討其分子水平的作用機制提供可行的科學方法。明確了古代經典名方保元湯的入血化學成分，鑒定了其原型成分的代謝產物，并從分子水平闡釋了基于這些入血原型成分的作用靶點，并揭示其潛在治療優勢，為擴大該方劑臨床應用提供參考，發掘更多的臨床治療潛能。

保元湯；UPLC-QTOF-MS/MS；藥效物質基礎；分子水平機制；網絡藥理學；人參皂苷Rb1；丹皮酚；刺芒柄花素；刺甘草查耳酮；大豆異黃酮；甘草查耳酮A；6-姜辣素；水楊酸

保元湯是國家中醫藥管理局第一批公布的古代經典名方之一，源于明代《博愛心鑒》和《簡明醫彀》，由人參1錢、黃芪2錢、甘草5分，肉桂2分，生姜1片組成[1]，方中人參性稟中和，益元氣而生精血，善補脾肺之氣，為君藥；黃芪味甘性溫，固腠理而補元氣，與人參相須為用，增強補氣之功，為臣藥；配伍少量肉桂，取其溫通血脈、溫腎補陽之功用；甘草味甘性平，可解毒又能補氣中和，調和諸藥，為佐使藥?，F代藥理研究表明，保元湯具有調節免疫[2]、促進造血、調節凝血及纖溶平衡、抗氧化、抗應激[3]等作用[4]，在臨床上常用于心衰、冠心病、緩慢性心律失常等心血管疾病的治療[5]。2016年國家中醫藥管理局及國家藥監局明確規定了生產符合國家規定條件且源于古代經典名方的中藥復方制劑后，引起經典名方的研究熱潮。作為臨床常用經典名方保元湯，大多應用于心血管疾病的治療上，臨床應用相對較局限，保元湯的藥效物質基礎研究也較少[6]，本課題組從事保元湯的現代開發應用，已對保元湯進行了較為系統的研究探索，包括保元湯的處方組成、處方藥材基原考證、各項工藝參數的優化、定量分析、指紋圖譜的建立及量值傳遞等研究。國家中醫藥管理局遴選古代經典名方的原則是，體現“目前仍廣泛應用、療效確切、具有明顯特色及優勢”；古代中有較多記載及醫案證據，現代文獻中有較多臨床及實驗研究報道；得到中醫臨床進一步凝練、權威專家廣泛認可；以及各類中醫藥教材中廣為收錄等。保元湯能夠入選第一批名單，可見其具有廣泛的應用和確切的臨床療效基礎。為進一步闡明保元湯的藥效物質基礎及其作用機制，本研究采用UPLC-QTOF-MS/MS技術與網絡藥理學等方法，進行保元湯的化學分析及實驗動物藥動學研究，探討保元湯的藥效物質基礎及其分子水平的作用機制，發掘該方劑的臨床治療潛能。

運用UPLC-QTOF-MS/MS技術，可以高效、準確地分析復方成分的相對分子質量、元素組成和裂解碎片等信息，可有效識別中藥的各類復雜成分及其化學結構，為中藥復方現代研究提供了進一步的技術支撐[7]。同時，采用網絡藥理學方法，并利用其日臻完善的數據庫，通過構建“多成分-多靶點-多途徑”多層次的網絡用于中藥藥效物質的篩選及其作用機制分析，可為中藥復方的深入研究提供有效的策略[8]。因此，本研究采用高分辨飛行時間質譜技術對保元湯水煎液以及ig給藥大鼠的血漿成分進行分析鑒定，結合網絡藥理學等方法進行系統分析研究，為保元湯的藥效物質基礎研究和臨床高效應用等提供必要的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相系統和Vion QTOF型高分辨質譜儀、UNIFITM1.9.4數據處理軟件（美國Waters公司）；Centrifuge 5424R型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；KQ5200B型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；VX-Ⅲ型多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；HDZ20型智能煎藥壺（容量2 L，額定功率500 W，穩定電壓220 V，美味世家永達基電器廠）；LGJ-10E型冷凍真空干燥機 [四環福瑞科儀科技發展（北京）有限公司]。

1.2 藥材與試劑

實驗用對照品咖啡酸（批號120160505）、肉桂酸（批號20091329）、桂皮醛（批號21051103）、槲皮素（批號10081-9905）、6-姜辣素（批號20041903）、姜黃素（批號151022）、黃芪甲苷（批號21050701）、甘草苷（批號20091106）、甘草酸（批號20041302）、毛蕊異黃酮苷（批號21010901）、人參皂苷Rg1（批號20110810）、人參皂苷Rb1（批號21011625）、人參皂苷Rf（批號21071411）、人參皂苷Re（批號21012405）、人參皂苷F1（批號O0915AS）購自北京倍特仁康生物醫藥科技有限公司，對照品質量分數均＞98%。乙腈、甲醇、甲酸（美國Fisher公司）均為質譜純；水為屈臣氏飲用水；其他試劑均為分析純。

人參（批號RS220311）、黃芪（批號HQ220402）、甘草（批號GC220406）、肉桂（批號RG220315）、生姜（批號SJY501-21-10-004），購于江蘇萬邦生化醫藥公司，均來源于道地產區或主產區，經中國中醫科學院中藥研究所孫奕研究員鑒定，5味藥材分別為五加科植物人參C. A. Mey. 的干燥根和根莖，豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的干燥根，豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根莖，樟科植物肉桂Presl的干燥樹皮，姜科植物姜Rosc.的新鮮根莖。

1.3 動物

SD大鼠，SPF級，雄性，體質量200～300 g，動物來源機構許可證號：SCXK（京）2021-0011或者SCXK（京）2021-0006；飼養于中國中醫科學院中藥研究所SPF級動物房，動物實驗倫理審批單位為中國中醫科學院中藥研究所，批準文號2022B023。

2 方法

2.1 分析溶液的制備

2.1.1 保元湯水提液化學成分分析

（1）保元湯水提液制備：分別取3倍處方劑量藥材飲片人參11.2 g、黃芪22.4 g、甘草5.6 g、肉桂2.3 g、生姜片約9.0 g，加水1200 mL，浸泡60 min，以武火煮沸后轉文火繼續煎煮至480 mL，多層紗布趁熱濾過，取續濾液；藥渣再加水900 mL，煎煮至420 mL，多層紗布趁熱濾過，取續濾液，合并2次濾液，得提取液。將少量提取液經0.22 μm濾膜濾過，取2 μL液質分析。

（2）對照品溶液制備：精密稱取各對照品約1.0 mg，精密稱定，加入甲醇配制成1.0 mg/mL的單一對照品儲備液。從上述各單一對照品儲備液中精密量取儲備液各100 μL，加入甲醇稀釋，配制成質量濃度為0.05 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 保元湯入血成分分析

（1）保元湯ig液制備：稱取保元湯水提液凍干粉末，加適量飲用水配制成0.14 g/mL的ig受試液。

（2）血漿樣品采集與處理：經預試驗，確定動物給藥及采血方案：6只SD雄性大鼠，分為給藥組與空白組，每組3只，給藥前禁食12 h，自由飲水，保元湯2倍臨床等效劑量ig給藥（1.41 g/kg），給藥容積1 mL/100 g，空白組給予同等體積的蒸餾水，每天給藥2次，連續給藥1周，1周后戊巴比妥鈉麻醉，腹腔主動脈取血，肝素管抗凝，靜置，4 ℃，3500 r/min，離心15 min，取上清液則為含藥血漿[9]。

取含藥血漿樣品200 μL，加入甲醇800 μL沉淀蛋白，渦旋5 min，離心（轉速13 000 r/min，15 min，取上清，氮氣吹干，備用。固相萃取柱活化，取氮氣吹干后樣品加0.5 mL水溶解，渦旋2 min后上樣，以5 mL水洗脫，收集洗脫液，再用5 mL的70%甲醇洗脫，收集2種洗脫液，將水洗脫液和甲醇洗脫液13 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，70%甲醇洗脫液經氮氣吹干，100 μL 70%甲醇復溶，經0.22 μm濾膜濾過，得血漿樣品進行分析。空白血漿處理方法同上。

2.2 UPLC-MS/MS條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS-T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～3 min，2%～19% B；3～8 min，19% B；8～8.1 min，19%～22% B；8.1～14 min，22%～29% B；14～16 min，29% B；16～32 min，29%～45% B，32～32.1 min，45%～90% B，32.1～35 min，90%～95% B，35～36 min，95% B，36～40 min，95%～2% B；體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量2 μL。

2.2.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），掃描方式為MSe模式，正、負離子模式下離子源工作參數為毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓30 V，錐孔反吹氣流量（N2）50 L/h，脫溶劑氣流量1000 L/h，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度450 ℃，掃描范圍50～1500，數據分析采用UNIFITM1.9.4質譜分析軟件進行數據采集分析。

2.3 化合物鑒別與結構分析

采用UNIFITM1.9.4質譜分析軟件進行數據采集和分析，通過Chemspider數據庫、chemical book數據庫、本課題組化學成分實驗數據庫以及結合可參考文獻數據，建立包含保元湯5味藥材化學成分的質譜內部數據庫，通過精確相對分子質量、離子碎片信息以及對照品比對鑒定化合物，并按照化合物結構類型進行總結歸納；入血成分的鑒定方法同上，給藥后血漿與方劑提取液離子峰的保留時間、質荷比一致的化合物，則確認為保元湯中的入血成分，并對其中特征成分的代謝產物進行鑒別。

2.4 網絡藥理學分析

2.4.1 保元湯潛在作用靶點 將經UPLC-QTOF- MS/MS分析鑒定后的保元湯入血原型成分，通過TCMSP數據庫和藥物信息數據庫Drug Bank（http://www.drugbank.ca/）找到與之對應的靶蛋白。

2.4.2 網絡構建 在Uniprot數據庫中查找靶點蛋白對應的基因名稱和編號，將活性成分及相關靶點基因名導入網絡可視化軟件Cytoscape 3.8.2，運用Cytoscape軟件構建保元湯入血活性成分-靶點網絡。通過網絡將活性入血成分與作用靶點相關聯，實現從保元湯主要入血成分到作用靶點分析，通過String數據庫對相應的靶點繪制蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡圖，通過節點度（degree）值與combined score值大小篩選核心靶點。

2.4.3 數據分析處理與疾病預測 構建的“成分-靶點”網絡圖，運用Cytoscape軟件中的工具Network Analyzer來分析中介中心度（betweenness centrality）和節點度這2個重要的網絡拓撲參數；利用Metascape數據庫對獲得的靶基因進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。Bonferroni法校正后＜0.01的項目被認為是顯著富集，故根據＜0.01，進行篩選相關的生物過程（biology process，BP）、細胞組成（cellular componet，CC）、分子功能（molecular function，MF）以及KEGG富集后的主要通路。最后，將KEGG信號通路經FDR篩選，輸入CTD數據庫進行疾病預測。

3 結果

3.1 保元湯水提液化學成分鑒定

通過文獻綜述等方法整理出人參、黃芪、甘草、肉桂、生姜5味中藥化學成分，得到保元湯主要化學成分389種[10-11]，其中人參75種、黃芪109種、甘草162種、肉桂43種、生姜67種。通過Chemspider數據庫和Chemical Book數據庫下載保元湯主要化學成分mol格式文件，在UNIFITM1.9.4中建立了包含215種化學成分的內部數據庫。對UPLC-QTOF- MS/MS的采集數據對庫，結合本課題組內部數據庫及文獻中質譜裂解規律及對照品比對共鑒別出133個成分，保元湯水提液正、負離子模式下的總離子流圖及成分歸屬見圖1，保元湯水提液化學成分見表1，主要化學成分為皂苷和黃酮類。典型化合物質譜裂解規律如下，（1）皂苷類：化合物83（R＝22.85 min）在負離子模式下檢測得到準分子離子峰為/1 153.60 [M＋HCOO]?, 1 107.598 4 [M－H]?，其二級質譜圖（圖2-B）上可看到碎片離子/945.544 5 [M－H－Glc]?, 783.491 7 [M－H－GlcGlc]?, 621.438 5 [M－H－GlcGlcGlc]?，經查閱文獻，并與對照品比較，推斷化合物83為人參皂苷Rb1?；衔?3（R＝13.08 min）準分子離子峰為/799.486 0 [M－H]?, 845.491 9 [M＋HCOO]?, 637.433 1 [M－H－Glc]?, 475.379 7 [M－H－GlcGlc]?，經查閱文獻，并與對照品比較，推斷53為人參皂苷Rg1（圖2-A）。通過以上規律可以得出皂苷的裂解以糖苷鍵的斷裂為主，類似的化合物54被推斷為Re，其余化合物類比鑒別。（2）黃酮類：化合物35（R＝7.34 min）準分子離子峰為/417.119 4 [M－H]?，其二級質譜圖上可見碎片離子/255.066 7 [M－H－Glc]?, 135.008 6, 119.049 9，結合文獻，糖苷鍵的斷裂和RDA裂解是黃酮類化合物的主要質譜裂解規律，故推測135.008 6 [1, 3A]?, 119.049 9 [1, 3B]?，與對照品比對，推斷35為甘草苷（圖2-C），其余化合物依次類推得出。

A-保元湯負離子流圖 B-保元湯正離子流圖 C-混合對照品正離子流圖 D-混合對照品負離子流圖

表1 保元湯提取液化學成分信息

續表1

續表1

續表1

續表1

“*”表示有對照品；“?”表示該成分未查到確定碎片；表中來源用字母代表各藥材（R-人參，H-黃芪，G-甘草，S-生姜，C-肉桂）

“*”represents having standards; “?”represents no fragment; R, H, G-, S-, C, respectively.

A-人參皂苷Rg1 B-人參皂苷Rb1 C-甘草苷

3.2 保元湯水提液主要入血化學成分鑒定

前項研究已得保元湯水提液化合物鑒定結果，由于水提液化合物鑒別方法的色譜條件、質譜條件等與大鼠含藥血漿中入血成分鑒定方法一致，因此保元湯水提液化合物保留時間及特征離子與血漿中入血成分數據也高度一致，以保元湯水提液中化合物信息為基準，構建“保元湯入血成分數據庫”，采用UNIFITM1.9.4進行數據匹配，對保元湯的入血成分進行識別（圖3），共鑒定出35個入血成分（表2），其中包括9個皂苷類、14個黃酮類、4個有機酸，8個其他類成分，對其中代表性成分中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、人參皂苷Rb1、甘草酸進行代謝產物鑒定，鑒定結果見表3。

A-血漿樣品70%甲醇層正離子流圖 B-血漿樣品70%甲醇層負離子流圖

3.3 基于網絡藥理學的功效物質及其靶點預測

通過TCMSP數據庫和Drug bank數據庫檢索并與文獻比對，保元湯35個入血原型成分中共有27個入血成分能得到對應的靶點，共有193個對應作用靶點。通過Uniprot進行基因名稱的轉化，利用Cytoscape構建出“成分-靶點”網絡圖（圖4），betweenness centrality和degree均大于平均值的主要成分有人參皂苷Rb1、丹皮酚、大豆異黃酮、刺甘草查耳酮、6-姜辣素、甘草查耳酮A、刺芒柄花素、水楊酸（表4）。利用String數據構建PPI網絡圖（圖5），根據degree以及combined score篩選關鍵靶點，主要靶點分別為E1結合蛋白P300（E1A binding protein p300，EP300）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、腫瘤蛋白p53（tumor protein P53，TP53）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase，AKT1）、信號轉導子和轉錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、人磷脂酰肌醇-3-激酶調節亞基1（phosphatidylinositol-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）、環腺苷3′,5′-單磷酸反應元件結合蛋白1（cyclic adenosine 3,5-monophosphate responsive element binding protein 1，CREB1）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、周期素依賴性激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）。

3.4 GO功能與KEGG通路富集分析

利用Metascape在線數據庫對預測靶點進行GO和KEGG富集分析，篩選出＜0.01的GO條目346個，其中BP 199個，CC 56個及MF 91個。BP主要有對激素的反應（response to hormone）、對異生素刺激的反應（response to xenobioti stimulus）、對缺氧的反應（response to hypoxia）、凋亡過程的負調控（negative regulation of apoptotic process）、對氧化應激反應（response to oxidative stress）等，CC主要涉及到膜筏（membrane raft）、胞膜小窩（caveola）、膜微區（membrane microdomain）、神經元細胞體（neuronal cell body）、突觸后膜（postsynaptic membrane）等；MF主要有酶結合（enzyme binding）、蛋白質結合（protein binding）、蛋白質異二聚化活性（protein heterodimerization activity）等分子功能。各取前20位制作富集氣泡圖，見圖6。

表2 保元湯入血化學成分信息

“?”表示該成分未查到確定碎片；“/”表示該成分未做網絡藥理學分析；“*”表示有對照品

“?”represents no MS/MS fragment; “/” represents without network pharmacological analysis; “*” represents with references.

通過KEGG富集分析得到信號通路，根據＜0.01篩選，共得到187條通路，其中主要涉及到糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGE）-糖基化終末產物受體信號（receptor for advanced glycation end products，RAGE）通路（AGE-RAGE signaling pathway）、脂質和動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、表皮生長因子-酪氨酸激酶抑制劑抵抗（epidermal growth factor receptor，EGFR-tyrosine kinase inhibitor resistance）、雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、缺氧誘導因子信號通路（hypoxia inducible factor-1，HIF-1 signalingpathway）、松弛素信號通路（relaxin signaling pathway）、白介素-17信號通路（interleukin-17，IL-17 signaling pathway）、Janus激酶-信號轉導子和轉錄激活子（Janus kinase，JAK；signal transducer and activator of transcription，STAT）（JAK-STAT signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、環鳥苷單磷酸蛋白激酶信號通路（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG signaling pathway）、血管內皮生長因子信號通路（VEGF signaling pathway）、環核苷酸信號通路（cAMP signaling pathway）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等信號通路。每條通路富集多個基因，體現了保元湯在治療疾病過程中多靶點、多通路的作用特點。以基因富集數目多，值大小為選擇依據，選取前20個通路制作富集氣泡圖見圖7。

表3 代表性成分代謝產物信息

圖4 入血成分“成分-靶點”網絡圖

表4 保元湯中8個成分的網絡拓撲參數

3.5 疾病預測

將上述String數據庫得到的KEGG信號通路再經FDR值小于0.001篩選后得到的前5條信號通路（hsa04933：AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，hsa05200：pathways in cancer，hsa05215：prostate cancer，hsa05417：lipid and atherosclerosis，hsa05161：hepatitis B）輸入到CTD數據庫進行疾病預測，共得到284種疾病，從中篩選均涉及上述5個通路的疾病共有24種：心臟衰竭、心肌病、心肌炎、心肌梗死、心肌缺血、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、阿爾茨海默癥、再灌注損傷、絕經后骨質疏松癥、乙型肝炎、關節炎、類風濕、急性腎損傷、肺纖維化、哮喘、動脈粥樣硬化、肝硬化、2型糖尿病、結直腸癌、高血壓、腦缺血、黑色素瘤。

節點注釋：圓從小到大，相應節點的顏色從深藍色-淺藍色-米色-黃色-棕色-紅棕色代表節點degree值從小到大；邊注釋：線從細到粗，相應線的顏色從深藍色-淺藍色-米色-黃色-棕色-紅棕色代表combined score值從小到大

4 討論

課題組在前期的血漿前處理中，以檢測到物質最多為標準，比較了乙腈、甲醇、異丙醇沉淀以及樣品的處理方法，最終確定血漿樣品前處理選擇4倍量甲醇沉淀蛋白，再過固相萃取小柱富集、除雜，以70%甲醇復溶后液質進樣分析為最佳方案。

綜合各種可參考文獻數據可知，保元湯原藥材含有至少389個化學成分。運用高分辨質譜分析技術，從保元湯水提液中共鑒定得到133個化合物。本實驗制備的保元湯水提液符合臨床使用實際，故對保元湯進行藥效物質基礎分析時，基于實驗所得133個化合物更有針對性。

圖6 GO富集分析

圖7 KEGG通路富集分析

經多次多天大鼠ig給藥后，發現保元湯有35個原型成分可以被吸收入血在體循環中穩態分布，并且在大鼠含藥血漿成分檢測中，包含35種原型成分在內共鑒別了43個化合物，藥物吸收入血后會代謝轉化成代謝產物等物質，共鑒別14個代謝產物，其中有6個既是原型成分，也是代謝產物，分別為毛蕊異黃酮、大豆異黃酮、甘草素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd、18β-甘草次酸；其余8個化合物為原型成分的代謝產物，因而推測其主要成分的代謝類型有葡萄糖基水解、葡萄糖醛酸水解、葡萄糖醛酸化、氫化、硫酸化、甲酯化等過程。本實驗以入血的原型成分作為保元湯在體內的藥效物質基礎，故以鑒別出的35個原型成分為基準。

保元湯可通過人參皂苷Rb1、丹皮酚、大豆異黃酮、刺甘草查耳酮、6-姜辣素、甘草查耳酮A、刺芒柄花素、水楊酸等8個關鍵成分作用于EP300、MAPK1、TP53、AKT1、RELA、STAT3、MAPK14、PIK3R1、TNF、CREB1、AR、CDKN1A等核心靶點，通過AGE-RAGE、EGFR、JAK-STAT、cGMP-PKG、cAMP、PI3K-Akt信號通路等多種途徑發揮藥效作用，推測保元湯除治療慢性心力衰竭外，還對阿爾茨海默癥、再灌注損傷、絕經后骨質疏松癥等具有潛在治療優勢。更值得一提的是，本課題組在化合物靶點和通路等靶標分析時，發現多種化學成分中既有單一成分對接多個靶點、又有多個類似同類成分對接同一靶點的情況，由此可佐證“中藥（復方）多成分多靶點協同作用”理論與“中藥多成分單靶點疊加作用”假說。中藥復方能從多途徑、多靶點、多層次、多系統的對疾病進行干預，突顯了中藥復方治療疾病的潛力和優勢，即中藥（復方）具備“多成分多靶點協同作用”特征。蔡少青等[26-27]提出中藥“多成分單靶點疊加作用”假說，認為中藥多成分多靶點協同作用網絡中局部靶點可存在相似多成分的藥效疊加作用。

保元湯藥效物質關聯治療的潛能分析。保元湯作為臨床上常用的經典名方，對心血管系統疾病，如慢性心力衰竭、擴張型心肌病[28]、心肌炎、心絞痛等具有良好的效果[29-30]。通過多通路靶點發揮治療作用，慢性心力衰竭發病與VEGF、TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達[31]以及MAPK、JAK-STAT、NF-κB等信號通路[32]相關；擴張型心肌病的發病與MAPKs、PI3K-Akt、cGMP-PKG等通路密切相關。上述兩種疾病涉及到的信號通路與文章通過GO和KEGG功能富集得到保元湯作用主要信號通路AGE-RAGE、EGFR、JAK-STAT、cGMP-PKG、cAMP、PI3K-Akt等信號通路均相對應，推測保元湯可能通過細胞質、細胞膜、內質網等細胞組分調節PI3K-Akt、MAPK、AGE-RAGE、TNF等通路發揮抑制炎癥反應、抗氧化、抑制細胞凋亡等作用。

本實驗所提示的保元湯潛在治療優勢病種除傳統治療心衰外，還有23種預測疾病?！盎衔?靶點”網絡分析結果顯示，保元湯中人參皂苷Rb1、丹皮酚、大豆異黃酮、刺甘草查耳酮、6-姜辣素、甘草查耳酮A、刺芒柄花素、水楊酸等8個成分的潛在作用靶點較多，推測它們在保元湯對疾病的治療中發揮重要作用。有研究表明人參代表性成分人參皂苷Rb1能顯著降低心肌梗死面積，可能是通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶磷酸化、激活mTOR信號通路和調控線粒體功能實現；人參皂苷Rb1同時有治療阿爾茨海默病癥的潛力，人參皂苷Rb1通過改變β-淀粉樣前體蛋白裂解途徑，減少Aβ的生成，抑制Aβ誘導的神經毒性反應；通過抑制細胞凋亡因子Bax、Caspase-3表達，激活抗細胞凋亡因子Bcl-2，保護神經元細胞從而改善癡呆鼠的認知功能[33]，臣藥黃芪中主要活性成分皂苷和黃酮類，已有臨床研究證明[34]，黃芪能通過抑制氧化應激的激活與擴散，減輕心肌損傷，從而起到保護心肌的作用。黃芪中芒柄花素能通過抑制ERK1/2、p38及NF-κB磷酸化，誘導細胞凋亡；還可通過PGC-1α通路、NF-NRF-2/HO-1通路抑制高脂血癥誘導的炎癥，改善認知功能[35]。毛蕊異黃素可通過調節PI3K/Akt信號通路及Bcl-2、Bax，增加H9c2細胞的細胞活性，并通過抑制氧化應激及細胞凋亡改善阿霉素誘導的心臟毒性[36]。甘草中活性成分大豆苷元能通過活化ERα對MG-63細胞IL-6的表達起抑制作用[37]，IL-6是骨代謝過程中重要的調節因子，與雌激素缺乏導致的骨丟失密切相關，婦女絕經后骨質疏松癥的發生，很可能是由于患者的雌激素下降致使IL-6分泌水平升高[38]。通過GO功能和KEGG富集結果顯示雌激素信號通路也是保元湯作用主要信號通路之一。也有研究表明大豆苷元有防治阿爾茨海默癥的作用及其抑制Aβ神經毒性發揮神經保護作用[39]。此外，甘草查耳酮A抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化并促進乳腺癌細胞自噬[40]；刺甘草查耳酮能通過抑制NLRP3炎癥小體的異?；罨瘡亩委煻喾N炎癥性疾病[41]。研究發現[42]6-姜酚能夠通過抑制細胞內PDE4蛋白表達而抑制環磷腺苷水解，升高細胞內cAMP含量，從而發揮其抗炎作用。

綜上所述，結合疾病預測結果，發現保元湯除了對臨床常規治療疾病心臟衰竭、心肌病、心肌炎、心肌梗塞、心肌缺血等心血管疾病外，還對阿爾茨海默癥、再灌注損傷、絕經后骨質疏松癥、多種炎癥疾病等具有治療潛力。

因此，本研究基于UPLC-QTOF-MS/MS技術，明確鑒定了保元湯水提液中133個化合物，其中，皂苷類54個、黃酮33個、生物堿4個、有機酸17個、其他類25個；鑒定到入血成分35個，代謝產物8個，并結合網絡藥理學等方法對保元湯入血原型成分的主要作用靶點及分子水平作用機制進行探討，預測了12個關鍵靶標基因，8個主要入血藥效活性成分，發現保元湯藥效分子機制主要涉及炎癥相關通路、氧化應激等方面，對阿爾茨海默癥、再灌注損傷、絕經后骨質疏松癥、多種炎癥疾病有治療潛力，本次研究可為保元湯質量標準、質量標志物、擴大臨床適應癥等研究提供參考，進一步拓展保元湯的臨床應用，也可以為古代經典名方的現代開發應用提供研究方法學借鑒。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1]成煥波, 胡輝, 李清安, 等. 保元湯古代文獻分析與現代研究概況 [J]. 中國現代中藥, 2021, 23(10): 1842-1850.

[2]陳殿學, 李建春, 孫宏偉. 保元湯加減對卡氏肺孢子蟲肺炎模型大鼠的免疫調節作用初探 [J]. 中國寄生蟲病防治雜志, 2003(5): 293-295.

[3]劉超, 潘曉艷, 朱慧娟, 等. 加味保元湯對束縛應激大鼠海馬CA3區神經元損傷的影響 [J]. 大連大學學報, 2014, 35(3): 94-97.

[4]李艷青. 保元湯及其類方研究 [D]. 濟南: 山東中醫藥大學, 2006.

[5]余格, 梁慧慧, 文雯, 等. 保元湯的研究進展及其質量標志物的預測分析 [J]. 中草藥, 2021, 52(2): 567-577.

[6]楊凈堯. 經典名方保元湯的物質基準研究 [D]. 長春: 長春中醫藥大學, 2020.

[7]張雅莉, 韓建勛, 圖爾蓀托合提·托合提薩伊普, 等. 基于UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜和分子對接技術篩選藿香正氣水潛在質量標志物[J]. 中草藥, 2022, 53(19): 6023-6034.

[8]許雅婧, 樂心逸, 葛一蒙, 等. 復方芩蘭口服液的體內外成分分析和網絡藥理學研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(9): 2623-2632.

[9]張銳, 張季林, 李冰濤, 等. 基于網絡藥理學研究梔子入血成分抗阿爾茨海默病的作用機制 [J]. 中國中藥雜志, 2020, 45(11): 2601-2610.

[10]Ma X L, Guo X Y, Song Y L,. An integrated strategy for global qualitative and quantitative profiling of traditional Chinese medicine formulas: Baoyuan Decoction as a case [J]., 2016, 6: 38379.

[11]The integrated study on the chemical profiling andcourse to explore the bioactive constituents and potential targets of Chinese classical formula Qingxin Lianzi Yin Decoction by UHPLC-MS and network pharmacology approaches [J]., 2021, 272: 113917.

[12]施懷生, 畢小鳳, 史憲海. UPLC-Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯用分析黃芪根及其莖葉中黃酮和皂苷類成分 [J]. 世界中西醫結合雜志, 2018, 13(3): 357-361.

[13]許如玲, 范君婷, 董惠敏, 等. 經典名方黃芪桂枝五物湯標準煎液化學成分的UPLC-Q-TOF-MS分析 [J]. 中國中藥雜志, 2020, 45(23): 5614-5630.

[14]肖觀林, 江潔怡, 胥愛麗, 等. 基于UPLC-Q-TOF-MS的布芍調脂膠囊化學成分分析 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2020, 26(14): 190-199.

[15]陳佩東, 周習, 丁安偉. 炙甘草水煎液的HPLC-MS分析 [J]. 中成藥, 2014, 36(10): 2115-2120.

[16]成煥波, 胡輝, 李清安, 等. 保元湯物質基準UPLC-PDA指紋圖譜的建立及化學成分指認 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2021, 27(7): 16-23.

[17]李曉鳳, 張少強, 劉金彪, 等. 基于UPLC/Q-TOF MS/MS的穩心顆粒主要成分分析及鑒定 [J]. 天津中醫藥, 2020, 37(8): 943-948.

[18]Zhu D, Fang X, Chen Y,. Structure-activity relationship analysis ofglycoproteins with cytoprotective effects using LC-MS/MS and bioinformatics [J]., 2020, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2020.05.034.

[19]孫政華, 邵晶, 郭玫. 黃芪化學成分及藥理作用研究進展 [J]. 中醫臨床研究, 2015, 7(25): 22-25.

[20]Yang L, Li C L, Cheng Y Y,. Development of a validated UPLC-MS/MS method for analyzing major ginseng saponins from various ginseng species [J]., 2019, 24(22): 4065.

[21]樂文, 馮芳, 王婭. 梔子甘草豉湯的LC-PDA-MS/MS分析及抗抑郁作用研究 [J]. 中國藥科大學學報, 2009, 40(4): 342-347.

[22]梁娜, 桑亞新, 周妍, 等. HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS法分析干姜中的姜辣素類化合物 [J]. 食品工業科技, 2018, 39(9): 252-256.

[23]王李俊, 楊琴, 王飛, 等. 大鼠ig毛蕊異黃酮-7-O-β--葡萄糖苷后尿中代謝產物的分離和鑒定 [J]. 中草藥, 2017, 48(12): 2382-2384.

[24]董世奇, 樊慧蓉, 李全勝, 等. 甘草苷在大鼠體內的代謝途徑研究 [J]. 中草藥, 2014, 45(17): 2499-2505.

[25]宋瑋, 鄭偉, 張潔, 等. 中藥皂苷類成分的體內代謝研究進展 [J]. 藥學學報, 2018, 53(10): 1609-1619.

[26]蔡少青, 王璇, 尚明英, 等. 中藥“顯效理論”或有助于闡釋并弘揚中藥特色優勢 [J]. 中國中藥雜志, 2015, 40(17): 3435-3443.

[27]徐風, 楊東輝, 尚明英, 等. 中藥藥效物質的“顯效形式”、“疊加作用”和“毒性分散效應”: 由中藥體內代謝研究引發的思考[J]. 世界科學技術-中醫藥現代化, 2014, 16(4): 688-703.

[28]白志冬, 劉麗華, 黨濤, 等. 生脈保元湯加味對擴張型心肌病合并心力衰竭患者心功能及血清BNP、CA125的影響 [J]. 現代中西醫結合雜志, 2017, 26(19): 2074-2076.

[29]張定寶, 張蘊慧, 張進進. 保元湯治療心血管疾病研究進展 [J]. 中國中醫藥現代遠程教育, 2015, 13(13): 158-159.

[30]元仙穎. 保元湯對阿霉素誘導的大鼠心肌損傷及內質網應激凋亡機制的影響 [D]. 長春: 長春中醫藥大學, 2021.

[31]陳仙芳, 毛偉君, 吳燕飛, 等. 磷酸肌酸鈉對心衰伴肺部感染患者VEGF、IL-6、TNF-α及心功能影響 [J]. 中華醫院感染學雜志, 2020, 30(8): 1234-1239.

[32]Luong C, Barnes M E, Tsang T S M. Atrial fibrillation and heart failure: Cause or effect? [J]., 2014, 11(4): 463-470.

[33]許方方, 張珊, 李建玲, 等. 人參皂苷Rb1對阿爾茨海默病模型小鼠術后認知功能、海馬內突觸后致密蛋白- 95及尼氏體表達的影響 [J]. 中西醫結合心腦血管病雜志, 2022, 20(3): 440-444.

[34]趙振霞, 趙振敏, 李彤. 黃芪注射液對病毒性心肌炎患者氧化應激和炎性反應影響 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2015, 21(23): 176-179.

[35]Fu X X, Qin T T, Yu J Y,. Formononetin ameliorates cognitive disorder via PGC-1α pathway in neuroinflammation conditions in high-fat diet-induced mice [J]., 2019, 18(7): 566-577.

[36]閆浩, 劉瀟瀟, 于春雪, 等. 基于網絡藥理和分子對接探究黃芪葛根湯治療糖尿病的作用機制 [J]. 陜西中醫藥大學學報, 2022, 45(4): 126-132.

[37]李葆林, 麻景梅, 田宇柔, 等.甘草中新發現化學成分和藥理作用的研究進展[J]. 中草藥, 2021, 52(8): 2438-2448.

[38]李樂飛, 金鑫, 李程育, 等. 大豆苷元抑制人成骨樣MG-63細胞分泌IL-6的分子機制研究 [J]. 武警后勤學院學報: 醫學版, 2018, 27(6): 467-471.

[39]楊紅. 異黃酮苷元防治AD及抑制Aβ神經毒作用的分子機制研究 [D]. 廣州: 暨南大學, 2010.

[40]劉雪雙. 甘草有效活性成分甘草查爾酮A抗腫瘤藥效學研究報告 [D]. 延吉: 延邊大學, 2021.

[41]Xu G, Fu S B, Zhan X Y,. Echinatin effectively protects against NLRP3 inflammasome-driven diseases by targeting HSP90 [J]., 2021, 6(2): e134601.

[42]李冰. 生姜揮發油成分分析及其主要活性成分6-姜酚的抗炎機制初步探究 [D]. 沈陽: 中國醫科大學, 2019.

Research on pharmacodynamic substances and molecular mechanism of ancient classical formula Baoyuan Decoction

LI Shu-hui1, 2, WANG Ya2, TIAN Jun3, GUO Yu-xuan1, ZHANG Shu-han1, MU Yue1, WENG Xiao-gang1, SUN Yi1

1. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China 2. School of Life Sciences and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China 3. JiangSu Wanbang Biopharmaceuticals, Xuzhou 221001, China

To elucidate the pharmacodynamic substances and the molecular mechanism of the ancient classical formula Baoyuan Decoction (BYT), in order to explore more potential clinical application advantages of BYT.The UPLC- QTOF-MS/MS technology was was used to perform gradient elution on a Waters ACQUITY UPLC-HSS T3column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) with 0.1% formic acid water (A)-acetonitrile (B) as mobile phase system. High resolution time-of-flight mass spectrometry electrospray ionization source (ESI) and positive and negative ion scanning modes were used to detect and identify the chemical components of BYT, and the prototype chemical components and metabolites in the drug-containing plasma of BYT rats after multiple and multi-day ig administration were analyzed. Furthermore, key targeting effects and the therapeutic potential of the absorbed prototype components of BYT into blood were predicted using network pharmacological methods through TCMSP database and drug information database.According to accurate relative molecular mass data and multistage mass spectrometry fragment ions, combined with reference products, databases and literature reports, a total of 133 chemical components in BYT were identified, and it was determined that 35 components could be absorbed into the blood through oral absorption to achieve stable plasma concentration after rats were given BYT by ig. The “component-target” network map of the absorbed prototype components of BYT into blood, core target gene gene ontology (GO) functional enrichment analysis, Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis, and disease prediction analysis indicated that BYT might act on mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1), tumor protein p53 (TP53), signal transducer and activator of transcription and other core targets through eight key components, including ginsenoside Rb1, paeonol, formononetin, echinatin, daidzein, licochalcone A, 6-gingerol and salicylic acid, and exert medicinal effects through the signaling pathways of advanced glycation end products- receptor for advanced glycation end-products (AGE-RAGE), epidermal growth factor receptor (EGFR), janus kinase-signal transducer and activator of transcription (JAK-STAT). It suggests that BYT has many potential therapeutic advantages on such as Alzheimer disease, reperfusion injury, postmenopausal osteoporosis, besides chronic heart failure. There were several derivatives of the same components in the 35 absorbed prototype components of BYT,, and one compound can dock with multiple targets, as well multiple analogues dock with the same target, which supporting the theoretical understanding of “multi-component, multi-target synergy of traditional Chinese medicine (formula)” and “multi-component, single-target superposition of traditional Chinese medicine”.Applying the UPLC-QTOF-MS/MS, network pharmacological and its database, which could provide a feasible scientific method for exploring the pharmacodynamic substances of traditional Chinese medicine (formula) and its molecular mechanism of action, as well clarifying the absorbed prototype components of BYT into blood and identifying some metabolites of some prototype components. And the target of action based on these prototype components was explained from the molecular level, and its potential therapeutic advantages were revealed, so as to provide reference for expanding the clinical application of this prescription and explore more clinical therapeutic potential.

Baoyuan Decoction; UPLC-QTOF-MS/MS; pharmacodynamic substances; molecular mechanism; network pharmacology;ginsenoside Rb1; paeonol; formononetin; echinatin; daidzein; licochalcone A; 6-gingerol; salicylic acid

R284.1

A

0253 - 2670(2023)21 - 6971 - 17

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.006

2023-03-04

中國中醫科學院科技創新工程（CI2021A04514）

李淑慧，在讀碩士，從事中藥質量控制與品質評價研究。Tel: (010)64021051 E-mail: 1744140302@qq.com

通信作者：孫 奕，研究員，從事中藥化學與天然藥物化學研究。Tel: (010)64020151 E-mail: ysun@icmm.ac.cn

翁小剛，研究員，主要從事中藥復方配伍、藥動學研究。E-mail: xgweng@icmm.ac.cn

[責任編輯 王文倩]