產香氣化合物微生物的研究進展

李媚媛，劉安琪，唐道埔，劉 冰，張新國,*，張 繼

（1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅省高校中藏藥篩選評價及深加工重點實驗室，甘肅 蘭州 730050；2.西北師范大學新農村發展研究院，甘肅 蘭州 730070）

香氣化合物是自身具有香氣的酯類、醛類、醇類、酮類、萜類、有機酸類等化合物的統稱[1-3]，其具有抗氧化、抗菌等活性，在食品、化妝品、香料等行業應用廣泛，部分香氣化合物還可以作為燃料、溶劑、天然殺蟲劑、信息素和藥物前體[4-5]。目前香氣化合物主要是通過化學合成以及從天然動植物中提取來獲得。化學合成是當前獲取香氣化合物的主要方法之一，但存在環境污染、產物含有反應副產物等問題，應用于食品、化妝品中安全性難以保證。盡管利用傳統方法從天然動植物中提取香精、香料可以滿足安全性的需求，但受到資源的限制，且溶劑消耗量大、提取率低、提取成本高[6]，難以滿足市場的需求。

隨著我國經濟發展和人民生活水平提高，人們對香氣化合物的需求日益增加[7]，綠色香氣化合物成為主流。研究顯示，許多微生物不僅能利用酶對香氣化合物進行從頭合成，還可以通過生物轉化作用產生香氣化合物[8-13]，這些微生物除了原始菌株外，還有通過基因工程改造后的工程菌株。中、美兩國均將酶法或微生物法所得的香料定義為天然香料[14-15]，推動了生物技術合成香料市場的發展[16-17]。本文就產香微生物來源、產香氣化合物研究概況及利用微生物發酵提高香氣化合物產量的探索與策略等方面進行綜述，為通過微生物生產綠色香氣化合物提供重要的理論依據。

1 產香微生物的來源與分離

1.1 土壤中的產香微生物及其分離

土壤是自然界最豐富的微生物庫，已有不少的研究從土壤中篩選產香微生物用于食品發酵或香料等生產。Wang Xuzeng等[18]從8 個不同地區的葡萄園土壤中篩選出了3 株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和1 株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），通過頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術對菌株揮發性物質進行檢測，得到45 種芳香物質，為獲得香氣濃郁的葡萄酒提供了重要參考。Muddapur等[19]從森林土壤中分離到一株黑青霉菌（Penicillium nigricans），該菌株能通過多種途徑將具有松木香氣的3-蒈烯[20]轉化為二氫香芹酮、香芹酮、紫蘇酸等香料物質或香料合成中間產物。Bao Yanrong等[21]從芒果園的芒果果皮及土壤中分離到一株庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），經HS-SPME和GC-MS對其揮發性物質進行檢測，發現了乙酸乙酯、異戊醇（蘋果味）、苯乙醇（蜂蜜和玫瑰味）以及β-紫羅蘭酮（花香、果香和甜味）。Li Xuewei等[22]從甘薯根際土壤中分離鑒定出一株淡紫鏈霉菌SPS-33（Streptomyces lavendulaeSPS-33），發現其代謝產物含有3-甲基-1-丁醇/異戊醇、癸酸乙酯、苯乙醇等多種香味化合物。

一些大型土壤真菌往往能合成數十種香氣物質。如松露作為定殖在松樹根部土壤的一類蕈菌，因能產生醇類、酮類、醛類、芳香族和硫類化合物而擁有獨特的香氣[23]，研究發現，多種定殖于松露上的細菌、酵母菌和絲狀真菌共同參與了松露的香氣產生[24]。Zhang Huiying等[25]發現鮮牛肝菌（Boletus edulis）具有29 種香氣物質，包括多種醛、醇類化合物。松露、牛肝菌及其他蕈菌也因其復雜的香氣而深受人們喜愛。張炳火等[26]對從森林土壤中分離的產香真菌JXJ 01進行鑒定，顯示該菌種與赤褐鵝膏菌（Amanita fulva）親緣相近但子實體形態不同，可能是一種新型蕈菌，通過GC-MS對其香氣成分進行分析，鑒定出20余種香氣物質，其中反-桂酸甲酯、桂酸乙酯和芳樟醇含量占到總揮發性成分的31.71%。

土壤微生物基數大且種類繁雜，對分離方法和技術有更高的要求[27]，現有產香微生物的研究多采用富集培養法，以花園、果園等土壤為樣本來源[18-21]。探索一些新方法是必要的，比如通過向培養基中加入特定生長介質，如待發酵物、轉化底物、生長因子等，或者直接以某種底物為唯一碳源，為目標菌種創造出適宜的環境[28-30]，以實現目的菌種的富集[31-32]。

1.2 植物中的產香微生物及其分離

植物內生菌是生活于健康植物組織內部、不引發植物明顯病癥的微生物，部分植物內生菌能產生與宿主相同或相似活性的物質[33]，因此分離香料植物內生菌已成為當前研究的熱點。

Monggoot等[34]從泰國采集的芳香木本植物Aquilaria subintegra中發現來自Arthrinium屬、Colletotrichum屬和Diaporthe屬的4 株菌能產生苯甲酸乙酯、苯甲酸芐酯以及β-沉香呋喃等廣譜揮發性化合物，這些化合物與宿主產生的沉香油組成成分非常相似，對于尋找沉香木主要香氣化合物的替代資源具有重要意義。劉選明等[35]用4 種不同的分離培養基從成熟香茅草中分離篩選出一株具有明顯清新、愉悅香味的菌株Pantoea ananatisCcSh-1，對其代謝產物進行分析發現，其中香氣化合物橙花醛和香葉醛的含量都相對較高。Bier等[36]從Pinus taeda樹皮中分離出一株擬莖點屬（Phomopsissp.）內生真菌，其能產生松油烯-4-醇、薄荷醇和香葉醇等香氣化合物。Molina等[37]從Dipteryx alataVog.果實中分離出3 株真菌，其能將α-蒎烯轉化為具有樟腦和薄荷風味[38]的馬鞭草烯醇，產量最高的菌株在發酵72 h后質量濃度達80 mg/L。從植物中尋找與宿主有相似代謝的內生菌發酵產香彌補了香料資源的短缺，也為香氣化合物的發現的提供了重要的機會。

植物產香微生物的分離與植物內生菌相似。采用傳統分離方法時應注意不同處理方法特別是消毒程序的選擇，會導致微生物量有較大差別[39]，需針對不同微生物選擇合適的培養基、適當延長培養時間從而兼顧環境中生長緩慢的微生物。此外，在分離過程中可以采用一些新技術，比如運用宏基因組學的技術[40]確定目標菌株、選擇合適的培養基，對于產香微生物的分離具有重要指導意義。

1.3 水體中的產香微生物及其分離

地球上的水體約占地球表面積的71%，是地球上最大的生態系統，蘊藏著巨大的生物資源，其中不乏各種產香微生物。Hosoglu[41]對3 種海洋微藻（Crypthecodinium cohnii、Schizochytrium limacinum、Tetraselmis chuii）和2 種淡水微藻（Chlorella vulgaris、Chlorella protothecoides）的特征香氣成分進行分析，共檢測到29 種揮發性有機物，分屬硫化物、醛、醇、酮、芳香烴和酯等六大類，在這5 種菌株發酵樣品中都檢測到二甲硫醚（卷心菜氣味，嗅覺閾值低、氣味活性強，易由香味過渡到異味[42-43]）、1-辛烯-3-醇（蘑菇香味）、(Z)-1,5-辛二烯-3-酮（天竺葵清香）、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪（豌豆清香）和(E,Z)-2，6-二十二烯（黃瓜清香）等。Sutani等[44]從日本海洋沉積物中分離出菌株MS1和MS2，并被鑒定為白地霉（Geotrichum candidum），其可以釋放出類似甜瓜的香氣，GC-MS分析結果表明與其相關的主要化學物質為順式-3-己烯-1-醇、順式-6-壬烯醛、3,6-壬二烯-1-醇等。梁龍元等[45]從深海海泥中取樣，用含三丁酸甘油酯的培養基進行篩選得到一株產酯酵母。以乙醇和己酸為底物，酵母菌株的酯化能力為2.6976 U，經鑒定與近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）的同源性為99%。趙希景[46]從潮間帶沉積物中分離獲得8株可以將阿魏酸轉化為香蘭素的菌株，篩選獲得了一株高產菌株B-32，在1 g/L阿魏酸的發酵液中能生成0.71 g/L的香蘭素。Chen Wen等[47]對從印度洋分離的深海細菌Bacillus aryabhattaiMCCC 1K02966揮發性物質進行分析，結果顯示該菌能產生具有強烈洋蔥、大蒜和蘿卜香氣的硫代乙酸甲酯和具有花香和果香的1-丁醇[48]。

水體中產香微生物的取樣，特別是海洋產香微生物，通常在海洋沉積物和其他特殊生態位中進行[49]，培養時應考慮其特殊條件，引入含有海水的培養基，兼顧水壓、溫度等。微藻作為水體中較為豐富的微生物，培養時應注意光照、溫度和鹽度[50]。此外，一些新分離方法比如通過選擇性濾膜進行天然環境原位培養以分離難培養的產香微生物仍然值得期待[51]。

1.4 發酵環境中的產香微生物及其分離

除自然環境中存在的微生物，人類在發酵食品等過程中營造的人工環境也存在豐富的產香微生物，且由于特定的生長環境，這些菌種往往有更高的特異性。以中國的白酒為例，富志磊等[52]從衡水老白干酒曲中分離出一株高產β-苯乙醇的季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）F11601，在優化培養條件后β-苯乙醇產量可達1.66 g/L，除苯乙醇外，還能產生棕櫚酸乙酯、肉豆蔻酸、月桂酸等白酒中的重要特征香味物質。Lai等[53]從高粱酒的黃水中分離出3 株酵母菌，經鑒定分別為Candida humilis、釀酒酵母和Kazachstania exigua，均具有較強的產酯能力，產物中2-苯乙醇、乙偶姻、異戊醇、乙酸乙酯的含量較高。Liu Chaolan等[54]從濃香型白酒窖泥中分離出一株新型梭狀芽孢桿菌（Clostridium swellfunianumsp.nov.）S11-3-10T，其發酵產物含有豐富的乙醇、乙酸，以及微量的丁酸和異戊酸（奶酪味、酸味），這些化合物在白酒香氣形成中起著重要的作用。曾婉俐等[55]從自然醇化的紅大煙葉樣品取樣，用含煙葉浸提物的培養基進行分離純化，得到一株甲基營養型芽孢桿菌屬的產香細菌HD-40，從該菌的發酵液中檢測出44 種香味物質，包括苯乙醇、2,3-丁二醇、丙酸乙酯等，其中乙偶姻占比達60.31%，這些化合物有可能增加煙葉風味。余翔等[56]從發酵用煙葉中篩選出一株產香菌株GXY35，其被鑒定為克雷伯氏桿菌（Klebsiellasp.），GC-MS分析結果顯示該菌含量最高的特征香味物質為4-乙烯基愈創木酚。此外，葡萄酒[57]、酸奶[58]、醬油[59]和醋[60]的發酵都有豐富的產香微生物參與，賦予產品各種風味。

盡管鮮有研究對產香微生物多樣性進行系統分析，但是現有研究關于產香微生物主要集中在真菌界的酵母菌屬[61]、庫德畢赤酵母[20]、青霉屬[18]、曲霉屬[34]、地霉屬[44]、威克漢姆酵母屬[62]、節菱孢屬[33]、間座殼屬[33]、刺盤孢屬[33]、小球藻屬[41]、擬莖點屬[36]、假絲酵母屬[45,53]、Schizochytrium屬[41]、Crypthecodinium屬[41]、Tetraselmis屬[41]、Meyerozyma屬[52]、Kazachstania屬[53]、耶氏酵母屬[63]、蕈菌[26]、擔子菌[64]，細菌界的泛菌屬[35]、克雷伯氏菌屬[56]、鏈霉菌屬[21]、芽孢桿菌屬[47,55]、梭狀芽孢桿菌屬[54]、Chitinophaga屬[65]、假單胞菌屬[66]、腸桿菌屬[67]共26 個產香屬的微生物（部分無屬分類），其中以酵母菌、霉菌以及芽孢桿菌的研究最多。多樣性豐富的產香微生物不僅能直接用于生產，而且其代謝途徑及相關基因可用于代謝工程以高效生產香氣化合物，避免了毒性副產物的產生及大量污染物的排放[68-70]。

2 微生物產香氣化合物的研究概況

目前，微生物發酵作為香氣化合物的重要來源，資源廣泛、環境友好而且產物具有天然屬性，在食品行業有著巨大的應用潛力。

2.1 酯類香氣化合物

作為水果和花卉中香味的主要來源，酯類香氣化合物廣泛應用于香精、香料、食品、化妝品等方面[71]。Zhang Zhongtian等[72]研究發現菌株Clostridium tyrobutyricumATCC 25755能產生具有水果香氣的丁酸丁酯，在發酵過程中添加脂肪酶和丁醇可將丁酸丁酯產量提高60%。Kumar等[73]發現的一株芽孢桿菌Bacillus safensisDVL-43能產生耐有機溶劑的DVL-43脂肪酶，可產生具有特殊的果香的月桂酸乙酯。Gao Wenyuan等[74]用一種新型酯酶EST4構建了工程大腸桿菌EPI300?-T1R，以肉桂醇、香茅醇、香葉醇和異戊醇作為底物，獲得了乙酸肉桂酯、醋酸香茅酯、乙酸香葉酯和乙酸異戊酯4 種香氣化合物。鄰氨基苯甲酸甲酯是一種有葡萄香味的酯類化合物，天然存在于葡萄、草莓、葡萄酒中。Luo Ziwei等[75]以葡萄糖作為唯一碳源，利用工程大腸桿菌ZWA4和工程谷氨酸棒桿菌YTM8分別產生4.47 g/L和5.74 g/L鄰氨基苯甲酸甲酯，合成關鍵酶為鄰氨基苯甲酸甲基轉移酶1，該發現可以較大程度提高鄰氨基苯甲酸甲酯產量，從而降低獲得葡萄香味產品的成本。γ-十二內酯和γ-癸內酯天然存在于桃子、杏仁、草莓等水果中，可以作為食品香料。Marella等[76]發現一種解脂耶氏酵母Y-63746（Yarrowia lipolyticaY-63746），其以非羥基化脂肪酸亞油酸為底物，利用脂肪酸水合酶合成了γ-十二內酯。Braga等[77]利用解脂耶氏酵母W29（Yarrowia lipolyticaW29）獲得了γ-癸內酯，該過程與?；o酶A氧化酶密切相關。

2.2 醛類香氣化合物

醛類香氣化合物普遍存在于食物中并且對大多數香水的制作而言必不可少，常用作食品添加劑出現在酒類、軟飲料及冰激凌中[78-80]。Chattopadhyay等[81]利用菌株Streptomyces sannanensis（MTCC 6637）將麥麩中的阿魏酸酯生物轉化得到708 mg/L的香草醛。芳香醛作為香精、香料應用廣泛，Kunjapur等[82]成功搭建了芳香醛生物合成的平臺，利用醛酮還原酶、醇脫氫酶構建工程大腸桿菌K-12 MG1655產生芳香醛，該菌株合成的苯甲醛在24 h內向苯甲醇的轉化率低于12%，大大提高了苯甲醛產量。Buchhaupt等[83]用大豆脂氧合酶和西瓜過氧化氫裂解酶基因構建了一種釀酒酵母工程菌BY.JG10-2B，其以亞麻酸為底物合成了大量3(Z)-己烯醛（60 mg/L）。香茅醛是香茅精油中重要的成分之一[84]，Zhang Baoyi等[85]利用基因工程改造獲得了一株催化效率和立體選擇性同時提高的釀酒酵母工程菌株——Y84V，其能將(E/Z)-檸檬醛完全轉化為(R)-香茅醛。

2.3 醇類香氣化合物

醇類香氣化合物是一類常用的香料，通常具有花香、果香、葉香或木香特征。2-苯乙醇是一種芳香醇，具有蜂蜜和玫瑰香氣，是玫瑰中最主要的花香化合物[86]。Braga等[87]將Yarrowia lipolyticapET-rrbdh菌株用于L-苯丙氨酸的生物轉化生產2-苯乙醇，最終該菌株利用用4 g/LL-苯丙氨酸可生產2.2 g/L 2-苯乙醇。橙花醇（C10H18O）是一種無環單萜，是天然存在于植物精油中的一種香料成分。Zong Zhen等[88]在工程大腸桿菌LZ005中利用橙花醇合成酶對葡萄糖進行生物合成獲得產量為1.564 mg/L的橙花醇。香葉醇是一種無環單萜醇，具有玫瑰花氣息，可用于蘋果、草莓等果香型、肉桂、生姜等香型的食用香精。Wang Xun等[89]利用香葉基二磷酸合酶和香葉醇合酶構建工程大腸桿菌TOP10，并利用該菌株獲得了2.124 g/L的香葉醇。Chen Zhenya等[90]提出了一種利用工程大腸桿菌BW25113生產食品調味劑香草醇的人工途徑。該途徑從4-羥基苯甲酸開始，利用對羥基苯甲酸羥化酶、羧酸還原酶和咖啡酸鹽O-甲基轉移酶3 種異源酶對香草醇進行從頭生物合成，使香草醇的產量變得可控。苯甲醇常見于茉莉和風信子的精油中。Pugh等[91]在工程大腸桿菌yqhD中設計非天然途徑并利用多種內源性乙醇脫氫酶、醛酮還原酶探索了從葡萄糖生物合成苯甲醇，實現了高達114 mg/L的苯甲醇產量。

2.4 酮類香氣化合物

酮類香氣化合物在香料中的應用廣泛，一般具有花香或果香，化學性質穩定，在香料工業中占有重要地位[92-93]。4-(4-羥基苯基)丁烷-2-酮，又稱樹莓酮，是樹莓果實的主要香味成分，也可以作為食品添加劑。Yang Bo等[94]在工程大腸桿菌JM109中以4-羥基亞芐基丙酮為底物，表達樹莓酮合成酶和葡萄糖脫氫酶獲得轉化率高達98%樹莓酮。Nawrath等[65]發現菌株Bacterium ChitinophagaFx7914能合成食品級香料2-甲基四氫噻吩-3-酮。β-紫羅蘭酮存在于許多花卉和水果中具有突出香味。López等[95]構建了可合成β-紫羅蘭酮的釀酒酵母工程菌株JLS07，利用香葉基二磷酸合酶使β-紫羅蘭酮濃度增加了8.5 倍。α-紫羅蘭酮是覆盆子和黑莓中主要的香氣化合物。Chen Xixian等[96]將突變的類胡蘿卜素裂解雙加氧酶1與番茄紅素ε-環化酶進行融合表達，構建的工程大腸桿菌Bl21-Gold DE3可將α-紫羅蘭酮的濃度提高2.5 倍以上。乙偶姻主要用于配制奶油、酸奶和草莓等香料，He Yuanzhi等[97]開發了一種含有3-丁二醇脫氫酶、NADH氧化酶和Vitreoscilla hemoglobin相關基因的工程大腸桿菌pET-rrbdh-nox-vg，在最佳條件下誘導催化2,3-丁二醇立體定向氧化獲得質量濃度為72.38 g/L的(3S)-乙偶姻。

2.5 萜類香氣化合物

萜類香氣化合物是食品和化妝品工業不可缺少的天然香料[98]。檸檬烯是柑橘類精油中主要的單萜。Rolf等[99]將甘油作為檸檬烯合成的唯一碳源，利用含有甲戊酸途徑和檸檬烯合成酶基因的工程大腸桿菌BL21（DE3）pJBEI-6410合成3.6 g/L檸檬烯。月桂烯是一種單萜類香料化合物，在云杉油、松節油、檸檬草油等中均存在，Kim等[100]以甘油作為碳源，通過引入異源甲戊酸途徑、表達香葉二磷酸合酶及月桂烯合酶，利用工程大腸桿菌Ec-pM1/pGM(Qi)得到產量達58.19 mg/L的月桂烯。香檜烯是天然雙環單萜，常被用作香料添加劑使用。Zhang Haibo等[101]利用甲基赤蘚糖醇4-磷酸或異源甲羥戊酸構建生物合成途徑，在工程大腸桿菌菌株BL21(DE3)中插入香檜烯合酶基因，經工藝優化使香檜烯的產量提高至82.18 mg/L。β-古巴烯是三環倍半萜烯，主要存在于煙草、茶葉及一些芳草中[102]，Mischko等[64]從擔子菌Coniophora puteana中發現萜烯合酶被證明參與了倍半萜烯的合成并在工程大腸桿菌HMS174中表達，并得到215 mg/Lβ-古巴烯。

2.6 有機酸類香氣化合物

部分有機酸類香氣化合物可作為香料為食品帶來清爽口感。對香豆酸常被用于制備香精香料[103]，Rodriguez等[104]開發了生產對香豆酸的工程釀酒酵母菌株CEN.PK102-5B，在該菌株中通過高效表達酪氨酸解氨酶、DAHP合成酶（ARO4K229L）、分支酸變位酶（ARO7G141S）和大腸桿菌莽草酸激酶II，最高可得到產量為1.937 g/L的對香豆酸。檸檬酸是一種弱有機酸，常作為酸化劑增強食品的風味和香氣[105]。Yarrowia lipolyticaH222菌株是可以產檸檬酸的酵母菌，Abghari等[106]對該菌株進行基因改造，高表達乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A，發酵最高可產檸檬酸45 g/L。Mi Jia等[66]通過基因改造獲得的重組工程菌Pseudomonas putidaDSM 12264在48 h內可產有機酸香料香葉酸193 mg/L。對羥基肉桂酸可用作調味劑,Vargas-Tah等[107]構建了含有編碼分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基因的工程大腸桿菌W3110，使對羥基肉桂酸的產量增加了8 倍。

2.7 其他香氣化合物

吡嗪化合物在肉味香精、堅果香精及蔬菜香精中起著重要作用。2-乙基-3,5(3,6)-二甲基吡嗪（2-ethyl-3,5(6)-dimethylpyrazine，EDMP）具有烘焙可可或堅果的宜人香氣，Zhang Huaizhi等[108]提出并證實了EDMP的生物合成途徑，從白酒發酵中分離到一株產EDMP的枯草芽孢桿菌Nr.5（LAM 19024），研究表明該反應與L-蘇氨酸脫氨酶、L-蘇氨酸脫氫酶有關。當然，自然界豐富的微生物中是否存在其他結構新穎的香氣化合物以及其安全性如何，仍然是一個值得深入研究的課題。

表1對微生物源香氣化合物的研究進行了匯總。

表1 微生物產香氣化合物研究概況Table 1 Overview of research on aroma compounds produced by microorganisms

3 利用微生物發酵提高香氣化合物產量的探索與策略

產香氣化合物的微生物普遍存在培養液中香氣化合物含量低、缺乏適于發酵的工業菌株等問題。除了繼續從自然界中篩選更好的原始菌株，對現有產生菌進行遺傳改造及發酵工藝條件優化提高產量仍然是該方向研究的熱點之一。

3.1 菌種改良

菌種改良主要是對微生物菌種進行基因改造以提高其應用潛力[109]?？赏ㄟ^增刪編碼基因或誘變等方式獲得所需的獨特菌株，將其用于香氣化合物的生產。Wang Yuepeng等[110]將低雙乙酰積累的Bacillussp.DL01-ΔalsD菌株與高溫敏感穿梭質粒載體pKS1進行同源重組，刪除了編碼磷酸三酯酶的基因，使雙乙酰產量增加了130%。Devanthi等[111]通過基因重組得到一種高耐鹽性Z.rouxii突變體，其可在較短時間內大量合成乙酸乙酯。Binder等[112]將光誘導的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷應用于谷氨酸棒狀桿菌的tac表達模塊中，使瓦倫烯產量大幅度提升。此外，在誘變技術上，室溫常壓等離子體（atmospheric room temperature plasma，ARTP）介導的誘變技術已成為了菌種改良的新型誘變工具[113]，其可瞬間破壞DNA鏈，避免了對熱敏微生物的潛在熱損傷[114]。Li Yuncheng等[115]利用ARTP系統對產酯酵母進行誘變處理，最終使其總酯含量比野生型菌株高1.4 倍左右。此外，與香氣化合物密切相關的閾值問題同樣值得關注。例如，酸奶中的乙醛質量濃度低于8.0 mg/kg會使風味變弱，過高時又會產生澀味[116]。乙酸乙酯通常具有較低的氣味閾值，有學者通過在酵母基因組中的相關代謝基因前后插入磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase，PGK1）基因啟動子和終止子來修飾靶基因的表達強度，提升了乙酸乙酯滴度[117]。Darsonval等[118]將克隆的EstA2等相關基因在Oenococcus.oeni菌株中表達，使葡萄酒中合成的乙酸異丁酯低于閾值以達到較好風味。

原生質體融合也是菌種改良常見的手段，通過兩個或兩個以上不相容物種的快速組合，從而得到親本菌株特征被改進后的新重組菌株以提高香氣化合物的產量。Lin Lucheng等[119]將3 株酵母菌經兩輪原生質體融合后得到融合菌株，發酵轉化后得到的2-苯乙醇滴度高于親本，達4.31 g/L。Xin Yi等[120]將菌株酵母菌株Et20和CTZ30通過原生質體融合產生酵母雜交種，其發酵產生的風味化合物總含量比原來高19.99%～26.55%。

針對傳統方法突變隨機和不定向性的缺點，近年來，使用現代基因工程技術對原生菌細胞進行定向改造的代謝工程漸成菌種改良的熱點方向。通過增加前體供應、過度表達或提高瓶頸酶的效率、引入關鍵酶并優化表達、減少不需要的副產物或競爭途徑的通量等手段提高產物滴定度或產量[121-122]。Chen Hefeng等[123]將瓦倫烯合酶引入釀酒酵母BJ5464，通過構建啟動子-終止子對優化瓦倫烯合酶表達，提升了瓦倫烯的產量。異戊二烯是合成香料的重要中間體，有學者對工程異戊二烯生產菌株的關鍵酶IspG過表達，使異戊二烯產量增加30%，約為21 mg/L[124]。Lin Pocheng等[125]將香葉二磷酸合酶引入菌株SynechocystisPCC 6803，并對磷酸戊糖途徑中5-磷酸核糖異構酶和核酮糖-5-磷酸3-二聚體酶基因過表達，最終將檸檬烯產量提高至6.7 mg/L。Furuya等[126]使用表達脫羧酶的大腸桿菌細胞將阿魏酸轉化為4-乙烯基愈創木酚，再利用表達加氧酶的大腸桿菌細胞將其進一步轉化為香蘭素，滴度達到7.8 g/L。利用代謝工程進行合理菌株改良無疑是提高香氣化合物產量的一個有前途的工具。

3.2 生產及發酵工藝的改進

發酵是通過微生物代謝獲得各種初級、次級代謝產物的過程，具有成本低、能耗低、環境污染小等顯著特點[127]。改進發酵工藝中條件參數、操作方式是生產高質量、高產量香氣化合物的重要保障。Zhang Wenqing等[128]以釀酒谷物改進的Fuqu 培養基培養芽孢桿菌XJB-104，使得風味化合物四甲基吡嗪的前體乙炔產量提高至5.23 g/kg。Saeed等[67]在以石榴皮為底物的發酵中，使用Enterobacter屬腸桿菌進行生物轉化，對工藝參數進行優化后香蘭素的產量達4.2 g/L。Nitta等[129]對菌株腸桿菌（Pantoea ananatis）IP04S/pBLAAaLINS-ispA采用“雙階段”補料分批發酵并優化條件，提高了(S)-芳樟醇的生產效率。Shi Wenke等[130]采用畢赤酵母F2-24與釀酒酵母順序發酵，產生的葡萄酒酯類含量更高。Chen Li等[131]在反式二氫卡瓦酮的生產過程中，對發酵溫度、攪拌速度、檸檬烯濃度等優化后，產量增加16 倍，達1 058 mg/L。Martínez等[132]以甘蔗渣為底物，接種菌株Kluyveromyces marxianu并提高還原糖的含量后香氣化合物總量增加了70%。Czajka等[133]利用對甘油、纈氨酸和異亮氨酸進行優化后的酵母-氮堿培養基培養β-胡蘿卜素菌株，最后生產的β-胡蘿卜素（紫羅蘭酮前體）滴度為1.26 g/L。Henke等[134]將十二烷改進的兩相有機覆蓋培養基用于廣藿香醇生產的優化，將廣霍香醇的滴度提高至60 mg/L。因此，除了獲得最優良的菌株，通過發酵工藝的優化改進還可以控制生產成本、提質增效，是提升微生物產香氣化合物最經濟有效的方式。

4 結語

隨著消費觀念的改變和環保意識的增強，人們對于綠色香氣化合物的需求不斷增加。在可持續發展成為全球發展戰略的今天，采用綠色技術從源頭上消除或減輕污染，已經成為必然趨勢。利用微生物細胞工廠生產香氣化合物具有反應條件溫和、產物可降解、香味純正持久等明顯優點，正在變成獲取高質量、高附加值的香氣化合物的重要途徑，但由實驗室層面轉變為能產業化的生物技術存在著以下瓶頸[135-136]。1）尋找新的產香微生物仍然是未來需要關注的重點。微生物資源豐富，但目前進入生產研究的種類還較少，需要擴大篩選，挖掘更多的產香微生物。2）新微生物分離方法的應用。目前產香微生物多采用常規分離，新的微生物分離技術如原位培養等相關研究依然不足。3）尋找適宜產業化的菌株是當前階段的重點問題。香氣化合物作為次級代謝產物在野生菌株中濃度很低，如何充分利用基因工程、發酵工程等技術手段深入研究，加大與產業化對接仍然需要長期關注。4）微生物產香機制以及生物香氣化合物在相關行業中的應用仍然需要持續探索。目前，用生物技術代替化學合成正在加速推進，相信更符合綠色化學時代潮流的微生物制備香氣化合物將迎來美好的未來。