酶的耐酸性改造及在赭曲霉毒素A脫除中的應用研究進展

趙自通，張真真，張昊祥，阮 麗，梁志宏,2,3,*，王鴻磊

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.食品質量與安全北京實驗室，北京 100083；3.農業農村部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心（北京），北京 100083；4.中國農業大學煙臺研究院，山東 煙臺 264670）

蛋白酶是在現代化生產過程中廣泛應用的一類具有高效生物催化功能的蛋白質。過去的幾十年里蛋白酶制劑在生物制藥、精細化工、食品工業、生物燃料開發、紡織、造紙、農業等領域中的應用急劇增加，幾乎涵蓋人們日常生活中常見商品的生產制造過程，與人們的衣食住行息息相關[1]。生物酶的開發與設計是生物制造產業的核心技術，工業化應用中對酶功能特性的升級需求加速推動了對具有良好催化和經濟特性的改造酶的研究。酶在天然溫和的條件下具有高特異性、區域選擇性或立體選擇性等特性，有助于發展更可持續的化學過程；在真菌毒素脫除領域，已經發現多種氧化酶、水解酶能夠高效特異性降解如黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等真菌毒素，其已成為繼物理吸附、化學降解、微生物吸附/降解后解決真菌毒素污染最有前景的方法之一[2]。但應用于商業化的真菌毒素降解酶很少，大部分酶仍然因為穩定性差、環境適應性差而處于實驗室研究階段。由于酶催化作用對體系條件要求苛刻，從天然來源中分離出的酶通常在溫和條件下非常有效，但在工業化生產過程中的非自然條件（極端pH值、極端溫度、極端鹽度、有機溶劑）中活性受到抑制。因此，酶促生物催化的潛力尚未被充分開發，找到有效的策略來克服這些缺點是該領域研究人員的目標，同時天然酶對反應體系的苛刻要求使其不能適應食品及飲料等的工業化生產環境，成為阻礙酶工業化應用的瓶頸。本文總結了目前酶耐酸性改造的常用策略及其在OTA脫除領域的應用前景，以期為工業酶的耐酸性研究提供參考，也為真菌毒素脫毒酶的實際應用提供理論依據。

1 酶的耐酸性改造策略

分子改造能夠有效提高酶的穩定性。近年來，研究者普遍認同的分子改造方法分為定向進化、理性設計、半理性設計[3]（圖1）。影響酶蛋白耐酸性的因素主要有活性中心的pKa值[4]，底物結合位點的pKa值[5]，蛋白質表面電荷[6]，蛋白質內部的分子作用力如氫鍵[7-8]、鹽鍵[9]、芳香堆積[10-11]等，通過理性設計的定點突變改造酶蛋白的分子組成，進而改變其性質，具有快速、直接、準確率高的特點，最常用的耐酸性理性設計策略有同源序列比對[12]、表面電荷優化[13]、分子間相互作用力優化[14]等（圖2）。

圖1 生物酶的蛋白質工程改造常見方法示意圖Fig.1 Schematic diagram of common strategies for protein engineering modification of biological enzymes

圖2 生物酶的耐酸性理性設計策略示意圖[4,15-16]Fig.2 Schematic diagram of rational design strategy to improve the acid resistance of biological enzymes[4,15-16]

1.1 同源序列比對策略

在特定的酶家族中，其催化機理及活性中心具有高度相似性，具體體現為具有相同的保守氨基酸，這些氨基酸對酶的催化特性及穩定性具有重要意義[17]。因此，可以通過序列比對工具對比具有耐酸性的酶和不耐酸的酶在保守序列上的差異，進而分析對目標酶耐酸性具有關鍵影響作用的潛在氨基酸位點，后期通過定點突變、點飽和突變等方式進行驗證及篩選得到最佳突變體，目前已有大量研究采用同源序列比對策略改造了酶的耐酸性。Ma Fuqiang等[18]從木聚糖酶GH11家族序列中收集了113 個具有注釋pH值的酶構建數據庫，通過序列比對分析確定了5 個與pH值相關的潛在氨基酸位點，其中4 個突變體的最適pH值發生顯著變化，其組合突變使突變體的最適pH值降低了1.5。Tishkov等[19]通過對糖苷水解酶G12家族的同源序列比對及三維結構分析，發現源于疣孢青霉（Penicillium verruculosum）糖苷水解酶的Asp98Asn更容易與Glu203形成氫鍵，直接影響酶的pH值穩定性，活性驗證實驗結果表明Asp98在催化過程中起著一般酸的作用，突變體的羧甲基纖維素比活力沒有變化，但其最適pH值由4.0升高至5.1。Shi Xin等[20]采用基于結構的序列比對分析方法確定了源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的β-半乳糖苷酶的篩選突變位點，構建突變體并進行驗證，發現Tyr138Phe和Tyr364Phe的最適pH值從4.5分別變為5.5和6.0。Li Zhengxue等[21]通過序列比對和表面電荷工程的方法，對源于Bacillus terquilensis的中溫β-葡聚糖酶進行耐酸性改造，發現突變體Gln1Glu、Ile133Leu、Val134Ala、Gln1Glu/Ile133Leu酸穩定性提高，其中組合突變體Gln1Glu/Ile133Leu在pH 5.0和pH 6.0條件下處理1 h后，其酸穩定性分別為86.9%和100.5%，均顯著高于野生型（38.2%和56.4%）；進一步分析認為蛋白質表面負電荷比例的增加可能是其耐酸性提高的原因。

1.2 表面電荷優化策略

疏水氨基酸掩藏在蛋白質的內部，親水性氨基酸分布在蛋白質的表面，帶電荷氨基酸在蛋白質表面可通過靜電相互作用形成保護層，穩定蛋白質的結構；基于蛋白質的這一特點，可以通過優化設計蛋白質表面的帶電荷氨基酸，使蛋白質表面分布的電荷合理化，增強蛋白質表面的靜電相互作用力，從而提高蛋白質穩定性[6,22]。目前，用于分析蛋白質表面電荷分布情況的軟件Modeller、Rosetta等已用被廣泛應用，Modeller軟件可以采用遺傳算法來優化設計蛋白質表面帶電荷氨基酸的分布[23]；Rosetta軟件支持多種模式（Rosetta supercharge和AvNAPSA supercharge）用以評估和設計酶的表面電荷[15]。天然天冬氨酸酶（aspartase，AspB）（EC 4.3.1.1）的最適pH值為9，在堿性條件下具有較好的催化活性，Wang Yaling等[24]采用理性設計的策略改造該酶的耐酸性以用于生產β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）。其首先采用Rosetta supercharge算法設計了多個單點突變，發現突變體S133D在pH 8條件下的催化活性比初始酶提高了1.3 倍。然后在單點突變的基礎上擇優進行組合突變，結果發現六位點突變體K19E-N87E-N125DS133D-Q262E-N451E的最適pH值為8.0，且其比活力（120.78 mU/mg）是初始酶的3 倍，酶學性質分析也表明突變體酶的pH值穩定性和熱穩定性更好。Huang Ziyang等[25]采用定點飽和誘變和表面電荷修飾的半理性設計方法，提高了來源于Pyrococcus horikoshii的幾丁質脫乙酰酶（diacetylchitobiose deacetylase derived fromP.horikoshii，PhDac）的催化效率及耐酸性。他們首先通過定點飽和誘變篩選出PhDac突變體M14，其催化效率（催化常數（kcat）/米氏常數（Km））比初始酶提高了2.21倍；比活力達到5 162.17 U/mg，與野生型相比提高了70.02%。由于天然PhDac的最適pH值為7.0～8.0，在利用其制備氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）的過程中因環境酸度較低其催化活性受到抑制，為了進一步提高PhDac的耐酸性，利用Rosetta supercharge算法設計PhDac的表面電荷，針對潛在影響耐酸性的位點構建突變體并進行篩選和驗證，找到6 個對最適pH值有較大影響的氨基酸位點，并對其進行組合突變，最終發現突變體M20的最適pH值（pH 6.0）較天然PhDac顯著降低，且在pH 5.5時仍能保持較高的催化活性，比活力最高可達6 277.28 U/mg，是野生型PhDac的2 倍。

源于豬的胃蛋白酶A具有極好的耐酸性，Cooper等[26]發現豬胃蛋白酶A中的Glu和Asp均有43 個，其酸性氨基酸的比例較高，因而具有非常低的pI值（pI 2～3），這可減少其在低pH值條件下正電荷的累積，提高其酸穩定性。B?nisch等[27]也發現來源于酸熱硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius）的嗜酸性鐵硫蛋白的可溶性結構域表面會積累Asp及Glu等酸性氨基酸，其占比為60%，遠高于堿性氨基酸的比例，蛋白表面主要呈現負電勢，因此蛋白質表面電荷優化策略也是改善酶蛋白pH值穩定性的有效策略之一。武文慧等[28]利用ROSETTA軟件改造谷氨酸脫氫酶，通過調整其正或負電荷殘基類型改變蛋白的凈電荷，構建的7 個突變體中Asn16Asp和Lys218Asp的最適pH值均由8.0下降到7.0，優化后的酶活力分別提高了2.9 倍和5.4 倍。Liu Yihan等[29]發現改變蛋白質表面的靜電作用能夠顯著提高突變體在低pH值條件下的催化效率和穩定性，表明蛋白質表面的靜電相互作用對維持蛋白質構象的穩定性具有重要作用。已經報道的部分酶在耐酸性改造前后的最適pH值變化如表1所示。

表1 已經報道的部分酶在耐酸性改造前后的最適pH值變化Table 1 Optimal pH of some reported enzymes before and after acid resistance modification

1.3 分子間作用力優化策略

酶的耐酸性除了與其表面電荷相關以外，還受到活性中心及底物結合中心氨基酸pKa值的影響，一些酶的最適pH值與其活性中心/底物結合中心關鍵殘基的pKa值緊密相關。pKa值表征氨基酸電離平衡常數，其變化的同時也改變了局部關鍵殘基的分子間相互作用力，如氫鍵、芳香堆積作用、鹽橋[7,10,38-39]。因此，以pKa值的變化作為指標進行理性設計，其本質也是改變酶的分子間相互作用力。Joshi等[7]研究表明，環狀芽孢桿菌（B.circulans）木聚糖酶突變體Asn35Asp最適pH值較初始酶降低了1.1，活力增加了20%，這源于Asp35和Glu172之間形成了一個短的氫鍵（2.7 ?），穩定了糖基轉移的過渡態。Shiraki等[10]研究發現，無色桿菌（Achromobacter lyticus）蛋白酶I在靠近催化三聯體位置的Trp169-His210處存在一個獨特的芳香環堆積，His210Ala或His210Ser突變體的酸性邊界（pH值）較初始酶降低了1.9。Yang Haiquan等[9]對源于枯草芽孢桿菌（B.subtilis）的α-淀粉酶進行耐酸性改造，將His222、His275、His293、His310突變為Asp構建單點突變體及組合突變體，發現突變體的耐酸性顯著提高，主要原因是其形成了新的氫鍵與鹽鍵。Qin Yuqi等[38]篩選得到催化活性提高的內切葡聚糖酶II突變體，該突變體Asn342Val在pH值為5.8時表現出最佳活性，最適pH值比初始酶提高了1，其催化殘基和底物間靜電相互作用產生了變化。

降低親核試劑的pKa值不僅可以提高其催化活性，而且可能有助于改變其最優pH值[4,37]。Wang Chenghua等[4]通過降低活性中心pKa值的方法提高來源于B.subtilis的α-淀粉酶（α-amylase，Amy7C）的耐酸性，在距離活性中心4.5 ?的范圍內基于計算機同源序列比對和pKa值預測分析構建了多個突變體，結果表明突變體Ala270Lys/Asn271His的最適pH值降低了2，催化效率較初始酶提高了約3.94 倍；突變體的結構分析表明其耐酸能力的改善可能是催化親核試劑和質子供體殘基pKa值的降低所致。Xie Ting等[37]利用相同的方法改變普魯蘭酶（PulPY2，EC 3.2.1.41）的耐酸性及催化活性，他們首先通過在距離活性中心6 ?的范圍內引入組氨酸，設計多個突變體，經過篩選發現Gln3His的最適pH值由6.4降低為5.0，最大催化活力為54.2 U/mg，比初始PulPY2（32 U/mg）提高了69.3%；然后對其進行表面電荷優化，發現突變體Ile25Glu的最適pH值降低至5.4，其催化活力比初始酶高1.4 倍；最終結合改變活性中心pKa值和表面電荷優化單點突變設計兩者的組合突變，結果表明突變體Gln3His/Ile25Glu的最適pH值為5，最大酶比活力為63.9 U/mg，是初始PulPY2的2 倍，同時突變體Q13H/I25E在pH值為5時的活力較初始酶提高了3.3 倍，其酸耐受性顯著提高，在pH 4.8～7.0的范圍內最大比活力高于70%。Liu Zhongmei等[16]基于表面電荷、序列比對以及已報道突變綜合分析等方法改造納豆激酶，構建了11 個突變體，發現Tyr217Lys的耐酸性增強，最適pH值較初始酶降低了1，可能的原因是His64的pKa值發生改變，穩定了其質子化狀態，進而導致納豆激酶的耐酸性發生變化。

1.4 剛化柔性區域策略

酶的耐酸性與熱穩定性之間存在一定的關聯性，在利用剛化柔性區域策略進行酶的熱穩定性改造的過程中經常會發現酶的耐酸性、最適pH值也隨之發生變化；這說明增加酶的剛性在一定程度上也會增加酶的耐酸性。目前已報道的能夠提高酶耐酸性的剛化柔性區域策略有截短突變、引入二硫鍵等。

截短突變是剛化柔性區域的常用策略。天然酶的loop環由6～16 個表面氨基酸殘基組成，對于蛋白質的折疊、功能和穩定性具有重要作用，具有較強的柔性。嗜熱酶表面具有較短和較少的loop結構，有利于維持其熱穩定性，磷脂酶D的2 個loop環截短突變體Δ37-45和Δ38-46的半衰期較初始酶分別延長了11.7 倍和8.0 倍[40]。Kong Xiangya等[41]為了提高山羊溶酶體α-甘露糖苷酶外源表達產物活性及表達量，通過截短該酶部分結構域的方式構建了多個突變體進行外源表達，結果表明突變體chLAMt具有催化活性，同時發現截短突變體的耐酸耐熱性均提高，在79 ℃條件下突變體能保留40%的活性，同時其最適pH值由6.0降低到5.5。Pan Xian等[42]對β-甘露糖苷酶只保留核心區的截短序列以及對其全長堿基序列進行外源表達，發現截短后的突變體（MAN330）與其全長蛋白（MAN493）的最適pH值、最適溫度和底物特異性相似，但在pH 9.0～11.0范圍內，MAN330的穩定性比MAN493高約7%；在60～80 ℃范圍內，MAN330的穩定性比MAN493高約10%，說明截短表達的突變體pH值穩定性及熱穩定性比全長蛋白高。Yin Xin等[43]通過將木聚糖酶的N端替換為耐熱木聚糖酶片段構建多個突變體，篩選后發現突變體re-NhXyn1157的最適溫度由55 ℃升高到85 ℃，pH耐受范圍拓寬，可在pH 4.0～8.5內保持85%以上的活性。

引入二硫鍵也是剛化柔性區域的常用策略。Yang Min等[44]發現在海藻酸裂解酶（EC 4.2.2.3）中引入二硫鍵后，突變體半衰期延長2.25 h，熔融溫度（Tm）升高1.7 ℃。Turunen等[45]在內切-1,4-木聚糖酶II（XynII）的α-螺旋中引入二硫鍵（S110C-N154C），結果表明突變體在65 ℃下的半衰期由小于l min延長到14 min，同時其pH值穩定性提高，在pH 4.0～9.0的范圍內突變體酶活性均高于野生型。Suzuki等[46]在轉谷氨酰胺酶的N末端引入一個二硫鍵（D3C-G283C），發現突變體熱穩定性得到顯著改善，其中55 ℃條件下的半衰期較初始酶延長了1.79 倍，由29.2 min延長到81.5 min，半失活溫度由57 ℃升高到66 ℃。Teng等[47]在嗜酸性木聚糖酶中引入兩個二硫鍵（T2C-T29C、S39C-S186C）后，突變體在pH 3.0～5.0的酸性環境中保持相對穩定的同時，其最適溫度從50 ℃升高到70 ℃，比活力較初始酶提高了3.76 倍，kcat/Km提高了2.14 倍。因此，基于目前已有的文獻報道及國內外研究進展，采用剛化柔性區域的理性設計策略，能夠同時篩選出耐酸性及耐熱性提高的突變體，進而得到具有更高環境耐受性的重組酶制劑。

1.5 突變體的篩選策略

通過隨機突變或理性設計策略進行脫毒酶改造的過程中，發生有益突變的概率非常低（低于1/105），因此對突變體快速高通量篩選以獲得最佳突變體尤為重要[48]。傳統的篩選方法是采用瓊脂平板或微孔板進行篩選；酶（如纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶等[49-51]）對顯色底物具有降解作用，其可以在菌落周圍產生水解圈，因此常用于篩選高活性菌株[52]。與瓊脂平板篩選法相比，微孔板篩選可借助計算分析平臺，通過如吸光度、熒光強度等信號高通量篩選有益突變體，其篩選量可達104～105個/周[53]，顯著提高了篩選速率。最近的研究表明，流式細胞術及微流控技術聯合生物傳感器、電化學傳感器可以輕松篩選106～1010個突變體文庫，為生物酶改造中的快速高通量篩選提供了有力支撐[48]。

盡管采用蛋白質工程方法改造生物酶的技術已經相當成熟，但針對真菌毒素脫毒酶進行改造并導向實際應用的研究仍然處在初步階段。在眾多已經發現的真菌毒素脫毒酶中，目前僅有少數研究采用理性設計策略改造OTA脫毒酶、ZEN脫毒酶的耐酸性、熱穩定性及催化活性。雖然理性設計具有無需高通量大量篩選突變體的優勢，同時也存在改造效果不理想的情況，以及可能遺漏活性更好的突變體等問題。因此，為了獲得更加理想的真菌毒素脫毒酶突變體以用于實際的脫毒應用，未來可以借助日趨成熟的高通量篩選技術對脫毒酶進行改造。

2 脫毒酶耐酸性改造在OTA脫除中的潛在應用

2.1 OTA的限量標準及污染現狀

赭曲霉毒素（ochratoxins，OTs）是由曲霉屬和青霉屬等霉菌產生的一類氯酚類真菌毒素，現已發現超過20 種OTs家族的化合物[54]，主要包括OTA和赭曲霉毒素B（ochratoxin B，OTB），其中OTA暴露范圍最廣泛，毒性最強，1994年被國際癌癥研究機構和世界衛生組織列為IIB類致癌物質[55]。近期研究發現長期低劑量接觸OTA有引起兒童自閉癥惡化的潛在風險[56]。GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》對葡萄酒（2.0 μg/kg）、咖啡（5.0 μg/kg）等都有OTA限量要求；歐盟EC/1881—2006Setting Maximum Levels for Certain Contaminants in Foodstuffs規定葡萄酒中OTA限量同樣是2.0 μg/kg，但其2020年將食品及輔料中的OTA限量修訂為0.5（嬰兒食品）～20 μg/kg（干辣椒）；食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）認為受到OTA污染嚴重的農產品/食品排序依次為谷物＞葡萄及其制品＞咖啡及其制品＞白酒＞其他[57]，葡萄和咖啡是受污染最嚴重的經濟作物（表2）。根據國內市場監督管局及歐盟食品飼料類快速預警系統（The Rapid Alert System for Food and Feed，RASFF）發布的通知，葡萄、咖啡及其制品等產品中檢出OTs的頻率較高，2021年RASFF發布的預警中，在葡萄、咖啡及其制品等產品中檢出OTA的頻率為44.1%[58]。綜上，葡萄酒及咖啡中的OTs污染造成了巨大的食品安全隱患。

表2 不同農產品中OTA的檢出率和污染水平Table 2 Detection rates and contamination levels of OTA in different agricultural products

2.2 耐酸OTA脫毒酶的應用前景

目前已經發現羧肽酶A（carboxypeptidase A，CPA）、酰胺酶、酯酶、蛋白酶等具有OTA降解活性，其能夠催化OTA降解為赭曲霉毒素α（ochratoxin α，OTα）和苯丙氨酸，是OTA無害化處理的理想方式[71]。其中源于牛胰臟的CPA發現最早，而且同時具有降解OTA及OTB的能力[72-73]，能夠在短時間內將OTA完全降解，最適作用pH值為8.0，CPA降解OTA的pH值范圍為6.0～9.0，超出此范圍其OTA降解活性急劇下降[74]。此外，源于枯草芽孢桿菌（B.subtilisCW14）及溶桿菌（Lysobactersp.CW239）菌株的羧肽酶DacA及rCP4同樣具有OTA降解活性，其最適pH值均為7，在酸性環境中其OTA降解活性均受到一定程度的抑制[72,75]。除了羧肽酶以外，近年來發現來源于寡養單胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）和黑曲霉（Aspergillus niger）的酰胺酶AHD3和OTase同樣具有OTA降解活性，且其降解活性高于牛胰臟CPA，其最適pH值均為7，在酸性環境中的催化活性受到抑制[74,76]。

研究表明，OTA在pH＞12的堿性條件下不穩定，能夠通過打開內酯環或者降解酰胺鍵的方式產生毒性低于OTA的產物[77]；但是在自然或者酸性條件下OTA非常穩定，很難發生降解[78]。由表3可知，目前已經發現的OTA降解酶的最適pH值均為中性或者偏堿性，且大多數酶的活性范圍較窄，在pH值低于5的酸性環境中其OTA降解活性受到強烈抑制，因此獲得具有更好耐酸性的酶是解決酸穩定性OTA脫除問題的必然選擇。宋佳等[79]研究了重組酰胺水解酶Af-Otd降解OTA的酶學性質，結果表明該酶在弱堿性條件下的活力更高，最適pH值為7.5，但是在酸性條件下活力明顯降低；同時，他們發現乙醇濃度對該酶活力有顯著影響，在乙醇體積分數超過8%時Af-Otd失去OTA降解活性。易受OTA污染的葡萄酒乙醇體積分數在8%～15%之間，且食品、飼料的pH值均為偏酸性（表2）；所以在未來的實際脫毒應用中偏酸性的食品體系會導致OTA降解酶失活，進而失去脫毒能力，這是阻礙OTA脫毒酶工業化應用的瓶頸。因此，利用理性設計的策略對目前已經發現的具有OTA降解活性、背景明確的OTA脫毒酶進行分子改造，使其最適pH值向偏酸性轉移，或者增強OTA降解酶的耐酸性，是解決目前OTA降解酶活性作用范圍與實際脫毒環境條件不匹配問題的關鍵。OTA降解酶的催化活性及pH值范圍如表3所示。

表3 OTA降解酶的催化活性及pH值范圍Table 3 Catalytic activity and pH range of OTA-degrading enzymes

2.3 脫毒酶耐酸性改造研究

盡管已經有大量可降解OTA的羧肽酶、酰胺酶、酯酶、蛋白酶等被發現/挖掘、鑒定和研究（表3），但其在耐酸性及耐熱性方面仍然無法滿足工業應用的要求。為了提高CPA降解OTA的穩定性，馬蕾等[87-88]采用沸石咪唑酯骨架化合物（zeolitic imidazolate framework-8，ZIF-8）對CPA進行負載與保護，結果使CPA的底物轉化率提高了3 倍，并使其穩定性及OTA降解能力顯著提高。雖然采用酶固定技術可以提高酶的表觀穩定性，但沒有改變酶本身的環境抗逆性，不能從根本上解決脫毒酶穩定性差的問題。因此，基于脫毒酶的晶體結構，采用理性設計改造酶的耐酸耐熱能力逐漸引起了研究人員的關注。Xiong Lu等[89]通過對CPA進行截短表達，發現去除CPA酶原中的信號肽及前導肽后在畢赤酵母中表達的成熟CPA（mature CPA，M-CPA）在pH值為3～4及pH 11的環境中比從牛胰臟中直接提取商用CPA（commercial CPA，M-CPA）具有更好的穩定性及催化活性，可能是截短后提高了CPA分子的剛性所致（圖3A）。Ming Yue等[90]預測了CPA的柔性區域，以剛化柔性區域的方式構建了多個突變體，結果發現突變體r133-139的熱穩定性顯著提高，其半衰期延長了40.3 min，半失活溫度升高了6.7 ℃，熔融溫度Tm升高了3.1 ℃，其熱穩定性的提高可能與局部氫鍵的形成有關（圖3B）。

圖3 基于理性設計的真菌毒素脫毒酶改造Fig.3 Rational design-based modification of mycotoxin degradation enzymes

除了針對OTA 降解酶的改造外，關于ZEN 降解酶（ZHD101）的改造研究也有報道（圖3C）。Yu Xinrui等[92]基于結構和同源序列比對分析，使突變體ZHDM1和Ile160Tyr對ZEN的催化活力較初始酶分別提升了2.9 倍和3.4 倍。Lin Min等[93]采用優化表面電荷的方法提高了ZHD101耐酸性，通過引入帶正電荷的賴氨酸改變ZHD101的活性位點pKa值，發現突變體M2（Asp157Lys）和突變體M9（Glu171Lys）在酸性條件下催化效率提高；同時，突變體M8（Asp133Lys）和突變體M9（Glu171Lys）的kcat分別比初始酶提高了2.73 倍和2.06 倍。陳權等[94]通過剛化柔性區域策略改造ZEN水解酶ZHD101的熱穩定性，發現突變體Asn156Phe、Ser194Thr和Thr259Phe的熔融溫度升高（ΔTm＞4 ℃），且酶活力與初始酶類似甚至更高（相對酶活力分別為95.8%、131.6%和169.0%）；進一步將3 個突變體進行迭代組合突變，發現Asn156Phe/Ser194Thr的熱穩定性最好，Tm較初始酶升高了6.7 ℃。許中霞等[95]通過在ZHD101分子中引入二硫鍵構建7 個雙點突變體，其中突變體Asp143Cys/Pro181Cys在50 ℃孵育后的殘余酶活力是初始酶的2 倍。

ZEN降解酶的改造還涉及對底物特異性及降解活性的研究。Xu Zhongxia等[96]將ZHD101中活性中心附近153位的纈氨酸突變為帶有極性殘基的組氨酸（Val153His），提高了其與底物α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol，α-ZOL）的氫鍵相互作用，最終使Val153His對毒性更強的α-ZOL的降解活性提高了3.7 倍。隨后，Wang Meixing等[97]通過將ZHD518與ZHD101進行序列比對分析獲得突變體Asn156His，發現其對α-ZOL的催化活性提高了3.3 倍，且對ZEN、α-玉米赤霉醇（α-zearalanol，α-ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-zearalanol，β-ZAL）的降解活性也顯著提高。Zheng Yingying等[98]解析了源于Rhinocladiella mackenziei的ZEN降解酶RmZHD的晶體結構，通過與ZHD101的結構進行對比分析，將160位的酪氨酸突變成體積更小的丙氨酸，使底物結合口袋具有更大的空間以結合底物α-ZOL，最終突變體RmZHD對α-ZOL的水解活性是初始酶的1.7 倍。目前對黃曲霉毒素脫毒酶、DON脫毒酶也有研究和初步應用，為了適應工業化需求，真菌毒素降解酶的改造是近期及未來的研究熱點。

3 結語

酶制劑具有催化效率高、專一性強等特點，在食品、化工、醫藥等領域發揮著越來越重要的作用。從天然來源中分離出的酶通常在天然條件下非常有效，但在實際工業化應用的苛刻條件（極端pH值、極端溫度、極端鹽度、有機溶劑）下極易失去催化活性。因此，對天然酶進行改造使其適應實際生產需求是目前的研究熱點，也是推動酶制劑工業化應用的關鍵。理性設計是目前常用的酶改造方法，其通過分析現有的結構信息提出可能有效的突變策略，然后利用定點突變技術引入突變位點，并篩選出活性或者穩定性增強的突變體酶，具有功能靶向性高、相比于定向進化和半理性設計工作量小等優點。大量研究結果表明理性設計是提高酶耐酸性的有效策略，基于對目標酶背景的調查，可采用同源序列比對、表面電荷優化、分子內作用力優化等策略進行突變體設計，經過異源表達、純化驗證篩選得到穩定性增強的重組酶突變體。但是目前酶的耐酸性改造仍然存在成功率偏低、改造過程中對酶催化活性的影響具有不確定性、最適pH值改變幅度小等問題；未來可以進一步深化計算機輔助突變體設計，嘗試綜合多種改造策略，進一步提高改造成功率。同時，基于調查結果發現多數易受到OTA污染的食品及食品原料的酸度較低，而目前發現的具有較好實際應用前景的OTA降解酶的最適pH值均為中性或者偏堿性，其活性在偏酸性條件下受到抑制；因此，利用理性設計的策略對目前已經發現的OTA脫毒酶進行分子改造，使其最適pH值向偏酸性轉移，或者增強OTA降解酶的耐酸性，是解決目前OTA降解酶活性作用范圍與實際脫毒環境條件不匹配問題的關鍵，也是酶制劑脫毒工業化推廣的必由之路。