基于β-環糊精/殼聚糖/聚乙烯醇負載牛至油緩釋膜的制備及其性能評價

馬 源，唐善虎，李思寧，郝 剛，王健翔，駱卓伶，周海棟，廖彬旭，陳寒霜露

（西南民族大學食品科學與技術學院，四川 成都 610041）

聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）具有良好的成膜性、生物相容性以及可降解性等優點，已被廣泛應用于食品[1-3]、生物醫藥[4-6]以及化工[7-8]等領域。但是，由于PVA結構中存在大量羥基，導致成膜材料疏水性較差[9]，大幅限制了其在食品包裝領域中的應用。研究表明，殼聚糖（chitosan，CS）結構中的活性羥基和氨基與PVA中的羥基可形成分子間氫鍵[10]，能夠有效解決PVA易溶于水的問題。Liu Yaowen等[1]發現PVA/CS薄膜相較于純PVA薄膜呈現出低透氧性、高阻水性以及抗菌效果佳等特點；同時CS對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均表現出較高的抗菌活性[11]；Bonilla等[12]報道將CS摻入PVA薄膜降低了薄膜的紫外線透射率，并且改善了薄膜的抗菌性能。由此可見，PVA/CS可以充當成膜基質，在食品包裝行業具有較好的應用前景。

牛至油（oregano oil，OEO）是一種用途較為廣泛的抗菌劑，盡管其成分會受到原產地、氣候和環境等多種因素的綜合影響[13]，但多項研究表明其主要成分為香芹酚和百里酚等，這賦予了其獨特的氣味以及優良的抗菌抗氧化能力，而較高濃度的OEO卻會揮發出令人不適的刺鼻氣味[14-16]。有報道稱β-環糊精（β-cyclodextrin，β-CD）作為一種緩釋劑，可以適當掩蓋精油的刺激氣味，同時避免精油氧化或熱降解，從而使精油能夠更持久地發揮抗菌抗氧化能力[17]。

目前鮮有將含β-CD的精油加入PVA/CS薄膜中的報道。因此，本研究以PVA和CS作為成膜基質，以β-CD作為緩釋劑，以OEO作為抗菌劑，采用流延法制備具有抗菌抗氧化功能的OEO緩釋膜，并通過傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）圖、靜態水接觸角（water content angle，WCA）、熱穩定性、力學性能以及光阻隔性能等指標分別評估β-CD/CS/PVA復合膜中不同組分之間的相互作用以及不同體積分數OEO緩釋膜的理化性能；此外，研究復合膜的抗菌和抗氧化性能及在各種食品模擬液中的釋放行為，從而分析不同體積分數OEO對β-CD/CS/PVA薄膜的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213和大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 51459由北京北納創聯生物技術研究院提供。

OEO、1799型PVA（醇解度98%～99%）（均為分析純）上海麥克林生化科技有限公司；β-CD（生物試劑）成都市科龍化工試劑廠；CS（生物試劑，脫乙酰度90%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（98%）上海源葉生物科技有限公司；冰乙酸、無水乙醇、丙三醇、吐溫-80（分析純）成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

HMS-203D加熱型磁力攪拌器 上海滬析實業有限公司；T-25 digital高速分散機 德國IKA公司；5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；UV1810S紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；LR 64912C FTIR儀 美國PerkinElmer公司；OCA-20接觸角測量儀 德國Dataphysics公司；5967電子萬能材料試驗機 美國Instron公司。

1.3 方法

1.3.1 復合膜的制備

1.3.1.1β-CD/CS/PVA復合膜液的制備

取5 g PVA和0.7 gβ-CD溶于100 mL去離子水中，并于磁力攪拌器中以85 ℃、400 r/min攪拌1.5 h至完全溶解，得到0.05 g/mL PVA/β-CD溶液。

取2 g CS溶于100 mL 2%（體積分數，下同）冰乙酸，以60 ℃、350 r/min磁力攪拌4 h，得到0.02 g/mL CS冰乙酸溶液。隨后，將上述兩種溶液按體積比1∶1混合并加入1.6 g甘油，高速攪拌1 h使其混合均勻，得到β-CD/CS/PVA復合膜液。

1.3.1.2 OEO/β-CD/CS/PVA復合膜液的制備

將不同體積OEO（0.2、0.4、0.6、0.8 mL）分別加入40 mLβ-CD/CS/PVA溶液中，并加入20 μL吐溫-80用以乳化OEO，10 000 r/min均質5 min，隨后4 ℃離心（2 000 r/min）消泡5 min，即得到OEO體積分數分別為0.5%、1%、1.5%、2%的OEO/β-CD/CS/PVA成膜液。

1.3.1.3 復合膜的制備

采用流延法成膜[18]，干燥、揭膜后平衡48 h備用。由于所有膜樣品中均添加了β-CD，因此為方便記錄，PVA/β-CD膜、β-CD/CS/PVA膜以及含不同OEO體積分數（0.5%、1%、1.5%、2%）的OEO/β-CD/CS/PVA緩釋膜分別記為P、CP、CP-O0.5%、CP-O1%、CP-O1.5%以及CP-O2%。

1.3.2 FTIR分析

參考Liu Liming等[18]的方法并稍加修改。借助FTIR儀測定復合膜在4 000～500 cm-1范圍內的透射率。設置參數為：分辨率4 cm-1，掃描16 次。

1.3.3 表面潤濕性分析

參考Liu Liming等[18]的方法并稍加修改。在25 ℃條件下吸取1 μL雙蒸餾水滴加到復合膜表面，待穩定后測定其WCA。

1.3.4 熱穩定性的測定

采用差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）測定復合膜的熱穩定性，參考張星暉等[19]的方法并稍加修改。稱取5.00 mg復合膜置于鋁坩堝中，壓蓋密封，以空坩鍋為對照。在50 mL/min的氮氣條件下，以10 ℃/min的恒定速率在30～150 ℃范圍內升溫，測定復合膜的熱穩定性。

1.3.5 水分質量分數的測定

將薄膜樣品裁剪成2 cm×2 cm的小正方形，稱質量記為m0/g。將其放置于鋁盒中，在105 ℃的烘箱中干燥24 h至恒質量，記為m1/g。水分質量分數按式（1）計算。

1.3.6 力學性能的測定

參考高素利[20]的方法并稍加修改。將復合膜裁剪為3 cm×2 cm的長條狀，夾在電子萬能材料試驗機兩端的夾具上。設定參數為：初始夾持間距為15 mm，拉伸速率為20 mm/min。拉伸強度（tensile strength，TS）和斷裂伸長率（elongation at break，EB）分別按式（2）、（3）計算。

式中：T為樣品斷裂時所受最大力/N；S為樣品橫截面積/mm2，即樣品寬度/mm×樣品厚度/mm。

式中：L0為初始夾具間距/mm；L為樣品斷裂時夾具間距/mm。

1.3.7 光學性能的測定

參考黃宸等[21]的方法并稍加修改。將復合膜裁剪成合適尺寸的小矩形，緊貼石英比色皿一側內壁，以空白比色皿作為對照，借助紫外-可見分光光度計測定復合膜在600 nm波長處的吸光度，并按式（4）計算不透明度。

式中：A600nm為膜在600 nm波長處的吸光度；d為膜厚度/mm。

1.3.8 抗菌性能的測定

分別以E.coli和S.aureus作為典型的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，吸取100 μL菌液涂布至瓊脂肉湯平板，將直徑6 mm的濾紙片（已于成膜液中浸泡6 h）貼在培養基表面，置于培養箱中37 ℃培養10 h，測定其抑菌圈直徑，從而評價復合膜的抑菌性能。

1.3.9 抗氧化性能的測定

參考梁杰等[22]的方法并稍加修改，通過測定DPPH自由基清除率評價膜的抗氧化性能。將薄膜裁剪成2 cm×2 cm，加入裝有30 mL蒸餾水的錐形瓶中，放置于搖床30 ℃下以110 r/min振搖48 h，使復合膜中的活性物質充分釋放，取上清液待用。取2 mL上清液至比色管中，加入2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，混勻后于室溫下避光反應40 min，隨后5 000 r/min、4 ℃離心10 min。以無水乙醇作為參比，測定樣品上清液在517 nm波長處的吸光度，每組樣品平行測定3 次。按式（5）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為2 mL H2O＋2 mL DPPH溶液的吸光度；A1為2 mL上清液＋2 mL DPPH溶液的吸光度；A2為2 mL上清液＋2 mL無水乙醇的吸光度。

1.3.10 復合膜緩釋效果評價

參考Lian Huan等[23]的方法并稍加修改，采用蒸餾水、50%乙醇溶液、95%乙醇溶液3 種食品模擬液分別作為水基食品、水包油乳狀液、酒精食品和脂肪食品模擬物。將2 cm×2 cm的薄膜浸入盛有50 mL食品模擬液的燒杯中，每隔一段時間移取3 mL浸泡液采用紫外-可見分光光度計測定277 nm波長處吸光度（測完后迅速將浸泡液移回燒杯）。待吸光度數值恒定后，將膜絞碎并置于磁力攪拌器600 r/min攪拌24 h，使OEO充分釋放，測定溶液在277 nm波長處的吸光度，從而計算OEO最大釋放量。同時，根據標準曲線計算OEO的釋放量（經全波長掃描，OEO的最大吸收波長為277 nm，OEO在1.95～125 nL/mL范圍內的標準曲線方程為y＝14.501x＋0.008 9，R2＝0.999 5），從而計算不同時間點OEO的釋放率。以時間為橫坐標、OEO釋放率為縱坐標，繪制復合膜在3 種模擬液中的緩釋曲線。

1.4 數據統計與分析

所有數據以平均值±標準差表示，顯著性均采用SPSS 26.0軟件中的單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan法進行多重比較，以P＜0.05表示差異顯著；采用Origin 2022軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 復合膜的FTIR結果分析

FTIR圖譜可以反映物質的化學鍵和官能團等獨特的結構信息，本研究采用FTIR分析了不同體積分數OEO對β-CD/CS/PVA復合膜結構的影響（圖1）。PVA膜中引入CS、OEO后，并無特征吸收峰產生或消失，僅表現出了峰強度的增強或減弱，說明其結構并未發生明顯變化，幾種成分彼此之間有良好的相容性。

圖1 復合膜的FTIR圖譜Fig.1 FTIR spectra of composite films

在PVA圖譜中，3 273 cm-1處的寬峰是大量羥基伸縮振動所造成的；加入CS后，該峰向左略微偏移且峰強度也發生了細微的變化。其原因可能是PVA和CS的質量濃度太大，二者發生締合，導致PVA的游離羥基與CS的羥基和氨基結合形成了氫鍵[24-25]。此外，2 929 cm-1處的吸收峰由—CH2的伸縮振動引起[26]，1 417 cm-1處的吸收峰由β-CD中O—H的特征彎曲振動引起[27]，835 cm-1處則是由C—C鍵的伸縮振動引起[28]。本研究中所有復合膜樣品在1 031～1 029 cm-1處均產生了特征峰，這歸因于膜制備的過程中均加入了甘油[29]。

2.2 復合膜的WCA結果分析

WCA通常被用來評價復合膜的親水性，大于90°為疏水，反之則為親水。由圖2可知，所有復合膜均具有親水性，但是各處理組親水程度不同，這是由于PVA、CS、β-CD、甘油以及吐溫-80都具有親水性，而OEO具有一些疏水基團導致的。

圖2 復合膜的表面潤濕性Fig.2 Surface wettability of composite films

加入CS后，復合膜的WCA顯著增大（P＜0.05），這意味著其疏水性增強，可能是PVA與CS之間締合形成了氫鍵。引入OEO后，復合膜的WCA下降，這是由于乳化OEO的吐溫-80具有強親水性，多余的—OH同水分子結合使薄膜親水性增強[30]，導致復合膜疏水性驟降；但隨著OEO添加量的增加，復合膜的WCA逐漸回升，在OEO體積分數為2%時達到62.15°，這是OEO中疏水基團（—CH3、—CH2和—CH）共同作用導致的[31]，說明OEO的加入可以顯著提高復合膜的疏水性（P＜0.05）。在食品包裝中，提高復合膜的疏水性有助于阻擋空氣中的水蒸氣，從而延長食品貨架期。

2.3 復合膜的DSC結果分析

通過DSC監測不同復合膜的熔融溫度可以分析其熱穩定性。由圖3可知，在6 種復合膜中均只觀察到單一吸熱峰，表明這幾種組分彼此之間具有良好的相容性[32]。此外，PVA膜在86.33 ℃處表現出吸熱熔融轉變；而加入CS之后熔融溫度升高，這可能是因為PVA和CS分子間締合形成了氫鍵，從而抑制了PVA分子鏈的運動，提高了復合薄膜的熔融溫度，這與FTIR以及WCA的結果相印證。

圖3 復合膜的熱穩定性Fig.3 Thermal stability of composite films

加入OEO后，熔融峰的出現位置并未隨著添加量的增加表現出一定的規律，其熱穩定性由高到低依次為CP-O1%＞CP-O2%＞CP-O0.5%＝CP-O1.5%，這可能與吐溫-80的乳化能力有關。當OEO體積分數為1%時，復合膜液中的吐溫-80可充分乳化OEO，此時整個體系處于平衡態，復合膜液整體穩定性提高，因此熔融溫度最高；當OEO體積分數為0.5%時，未完全乳化的吐溫-80游離在水相中，與水分子通過共價鍵相連接，導致其結合水的能力強于其余處理組；當OEO體積分數大于1%時，復合膜中的吐溫-80已達乳化飽和，導致多余的OEO懸浮于復合膜液中，溶液的整體穩定性下降，熔融溫度也隨之降低，未參與乳化的OEO增強了復合膜的疏水性。

2.4 復合膜的水分質量分數分析

水分質量分數是反映復合膜耐水性的重要指標。如圖4所示，PVA膜的水分質量分數較高，當引入CS后，復合膜的水分質量分數有所下降，這意味著PVA與CS之間形成了氫鍵，從而抑制了水分子之間的交聯[10]。而加入少量OEO后，復合膜的水分質量分數有所回升，這是由于與OEO一并加入的吐溫-80具有較高的親水性[30]；但隨著OEO體積分數的增加，復合膜的水分質量分數有所下降，這是由于OEO結構中含有部分疏水性官能團[31]。上述結果與復合膜的WCA呈現出相反的趨勢，所得結論可相互印證。

圖4 復合膜的水分質量分數Fig.4 Water contents of composite films

2.5 復合膜的力學性能分析

TS與EB常被用來評判薄膜的力學性能。如圖5所示，在PVA膜中引入CS后，其TS顯著增大（P＜0.05），而EB顯著減小（P＜0.05）；在CP中加入少量的OEO時，其TS和EB均顯著減小。隨著OEO體積分數的增加，復合膜的TS先降低后增加：當OEO體積分數增加至1.5%時，TS呈現出減小的趨勢，這可能歸因于OEO中弱的油-聚合物鍵部分取代強的聚合物-聚合物鍵，導致復合膜網絡狀結構被削弱或破壞[33]；當OEO體積分數從1.5%增加到2%時，復合膜的TS由4.50 MPa顯著增加到9.48 MPa（P＜0.05），這與Mohsenabadi等[34]發現迷迭香精油-淀粉-羧甲基纖維素薄膜的TS隨著精油濃度增加先降低后增加的結果相吻合。復合膜的EB隨著OEO體積分數的增加而顯著增大（P＜0.05），說明OEO的引入可有效提高復合膜的延展性。

圖5 復合膜的力學性能Fig.5 Mechanical properties of composite films

2.6 復合膜的光學性能分析

圖6是不同復合膜在600 nm波長處的不透明度。其中，PVA膜的不透明度最低，僅為0.310；引入CS后薄膜的光阻隔性能顯著提高（P＜0.05），這是CS的引入使復合膜的顏色由無色轉變為淡黃色而引起的。添加OEO后，薄膜的不透明度隨著OEO體積分數的增加顯著提高（P＜0.05），這可能與OEO均勻分散在薄膜中致使光線被阻擋有關。CP-O2%組在600 nm波長處的光阻隔性能最好，其不透明度高達2.154，說明其可以更有效地抑制陽光直射造成的食品氧化。

圖6 復合膜的光學性能Fig.6 Optical properties of composite films

2.7 復合膜的抗菌性評價

為評價復合膜的抗菌效果，以E.coli和S.aureus為菌種，借助瓊脂紙片擴散法觀察其抑菌圈大小。如圖7所示，PVA膜并不具備抑菌作用，而CP也僅對E.coli有微弱的抗菌效果。隨著OEO體積分數的增加，復合膜對兩種菌的抑菌作用均顯著增強（P＜0.05），這是由于OEO中的酚類物質賦予了復合膜優良的抗菌活性[15]；其中，CP-O2%組的抑菌效果最好，其對S.aureus和E.coli的抑菌圈直徑分別達到8.42 mm和9.24 mm。此外，本研究發現添加OEO后復合膜對E.coli的抑菌效果要高于S.aureus，這與趙海伊[35]的研究結果一致。

圖7 復合膜的抗菌效果Fig.7 Antibacterial effect of composite films

2.8 復合膜的抗氧化性評價

通常DPPH自由基清除率越高表明復合膜的抗氧化能力越好。如圖8所示，PVA膜的DPPH自由基清除率僅為3.01%，表明其幾乎沒有抗氧化能力；引入CS后，復合膜的抗氧化能力顯著提高（P＜0.05），這歸因于CS結構中—NH2提供的氫原子可與DPPH自由基結合形成穩定的DPPH-H結構，從而延緩了自由基鏈式反應[36]。此外，隨著OEO體積分數的增加，復合膜的DPPH自由基清除率也顯著升高（P＜0.05），CP-O2%復合膜的DPPH自由基清除率達80.84%，說明添加OEO可以顯著提升復合膜的抗氧化能力；這是OEO中的百里酚和香芹酚等酚類物質所發揮的作用，這些成分能夠延緩食品中的脂質過氧化進程，同時加快自由基的清除速率[31]。作為一種抗氧化薄膜，CP-O2%可有效延長乳類、肉類、蛋類以及各種油類等食品的貯藏期，從而更好地保證食品質量。

圖8 復合膜的抗氧化能力Fig.8 Antioxidant capacity of composite films

2.9 復合膜的緩釋效果分析

由于食品包裝與食物之間的接觸是不可避免的，因而在接觸過程中復合膜中的活性物質會逐漸釋放到食品表面，因此有必要研究復合膜在各種食品模擬液中的釋放曲線[37-38]。如圖9所示，在3 種體系中，OEO中的活性物質從復合膜上逐步釋放至食品模擬液中，直至達到動態平衡狀態；各復合膜的OEO釋放曲線相似，即前期OEO釋放較快，后期OEO釋放較為緩慢。

圖9 復合膜在不同體系的緩釋效果Fig.9 Sustained release levels of composite films in different systems

添加不同OEO體積分數的復合膜在3 種介質中的釋放曲線均呈現出了相似的趨勢，其釋放率由快至慢依次為50%乙醇溶液＞水＞95%乙醇溶液，這與Lian Huan等[23]的研究結果相似，他們發現在3 種介質中，CS-百里香精油復合膜中的精油在50%乙醇溶液中釋放最快，在95%乙醇溶液中釋放最慢。產生這種現象的原因可能是由于50%乙醇溶液對復合膜的浸潤性較高，從而可以明顯減弱OEO小分子與復合膜大分子之間的結合力，使得OEO釋放較快[39]。此外，β-CD作為一種親水性的緩釋劑，也是促進水分子擴散到基質中的水合劑，因而對精油在水和50%乙醇溶液中的快速釋放也起了一定的促進作用[40]。復合膜在95%乙醇溶液中OEO緩慢釋放，在該體系中CP-O0.5%和CP-O1.5%這兩種復合膜可以持續釋放540 min，CP-O1%中的OEO可以持續釋放480 min，CP-O2%雖在240 min時釋放率達到動態平衡狀態，但仍優于其在其他兩種體系中的緩釋效果。上述結果充分說明CP-O0.5%和CP-O1.5%可以作為95%乙醇溶液體系中的緩釋材料。

3 結論

本研究以PVA和CS作為成膜基質，β-CD為緩釋材料，OEO為抗菌抗氧化劑，采用流延法成功制備出了一種兼具抗菌和抗氧化效果的緩釋膜。分析了復合膜的理化結構、機械性能、疏水特性、熱穩定性和光阻隔性能，并通過瓊脂紙片擴散法以及DPPH自由基清除率分析分別評估了復合膜的抗菌和抗氧化能力，最后通過模擬復合膜在3 種食品模擬液中的遷移探討了其緩釋性能。

本研究結果顯示，復合膜的不同組分之間具有良好的相容性，OEO的加入并未改變其化學結構；當OEO體積分數為2%時，復合膜具有最佳的光阻隔能力、疏水性能、抗菌和抗氧化能力，并展現出良好的力學性能和熱穩定性；不同OEO體積分數的緩釋膜均在95%乙醇溶液中呈現出良好的緩釋效果，在該介質中CP-O0.5%和CP-O1.5%中的OEO可持續釋放540 min。

綜上，本研究所開發的復合膜性能優良，并且具有良好的抗菌抗氧化性能，在食品包裝領域具有廣闊的應用前景。今后仍需進一步對復合膜的力學性能和疏水性能進行改良，使其可應用于更多的食品中。