鼠李糖脂處理對早酥梨抗黑斑病的誘導(dǎo)作用及其機(jī)理

盧玉慧，譚蕓秀，李永才，王小晶，畢 陽

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

早酥梨（Pyrus bretchneidericv.Zaosu）是我國西北地區(qū)主要栽培的一種早熟梨品種，因其果皮翠綠，果肉雪白、酥脆、多汁，從而深受消費(fèi)者青睞[1]。但是由于早酥梨的采收季節(jié)正值夏季，環(huán)境溫度的升高使得早酥梨果實(shí)極易受到病原菌的侵染，尤其是互隔交鏈孢菌（Alternaria alternata）引起的黑斑病作為早酥梨主要的采后病害，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。因此研發(fā)綠色安全采后病害控制方法已勢在必行。誘導(dǎo)抗性是一種能夠有效減輕果蔬采后病害的新方法，其通過生物或非生物方法激活果蔬自身的免疫能力，從而增強(qiáng)果蔬對病原物的抗性[3]。與傳統(tǒng)殺菌劑相比，誘導(dǎo)抗性具有抗菌譜廣、持續(xù)時(shí)間長、不會導(dǎo)致抗藥菌株出現(xiàn)等特點(diǎn)。此外，誘導(dǎo)抗性會導(dǎo)致植物組織中酚類化合物的含量增加，提高果蔬的抗氧化性能[4]。

鼠李糖脂（rhamnolipids，RLS）作為生物源表面活性劑，研究認(rèn)為其參與植物非特異性免疫，能誘導(dǎo)植物對多種病原真菌產(chǎn)生抗性[5]。RLS有雙重作用模式：它們既有抗菌作用，又能刺激植物防御反應(yīng)。Varnier等[6]研究發(fā)現(xiàn)RLS能誘導(dǎo)葡萄產(chǎn)生防御反應(yīng)，質(zhì)量濃度0.01 mg/mL RLS處理能使葡萄細(xì)胞幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)量增加30 倍，RLS在質(zhì)量濃度0.025 mg/mL下可強(qiáng)烈誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)，相當(dāng)于對照組（無PLS）的320 倍。源于銅綠假單胞菌的Rha-C10-C10和Rha-Rha-C10-C10以及來自植物芽孢桿菌的Rha-Rha-C14-C14在葡萄體內(nèi)引發(fā)了強(qiáng)烈的防御反應(yīng)，包括一些早期細(xì)胞信號傳導(dǎo)，如鈣離子內(nèi)流、活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的激活，能激發(fā)鈣離子內(nèi)流、ROS的產(chǎn)生和MAPK的細(xì)胞信號傳導(dǎo)[6]。同時(shí)RLS還誘導(dǎo)了致病相關(guān)的蛋白質(zhì)基因和參與氧化磷脂和植物抗毒素生物合成途徑的多種防御基因。RLS還能夠刺激煙草、小麥和擬南芥的防御基因以抵御病原物的侵染[7]。

果蔬在采后貯藏過程中發(fā)生成熟和衰老，自由基不斷積累，細(xì)胞膜受損，生理代謝紊亂，果蔬營養(yǎng)品質(zhì)下降[8]。誘抗處理可以調(diào)節(jié)果蔬ROS代謝，減少有害自由基的積累，防止膜脂過氧化。誘導(dǎo)抗性涉及的典型機(jī)制主要包括氧化爆發(fā)、苯丙烷代謝激活。研究表明，屬于水解酶類的病程相關(guān)蛋白幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶也屬于防御產(chǎn)物，與植物系統(tǒng)的誘導(dǎo)性抗性密切相關(guān)[9-11]。苯丙烷途徑是植物重要的次生代謝之一。由于苯丙烷途徑可合成如酚類、木質(zhì)素和黃酮大量的抗菌物質(zhì)[12]。所以，苯丙烷代謝途徑的激活被認(rèn)為是果蔬產(chǎn)生抗性反應(yīng)的標(biāo)志之一。ROS的產(chǎn)生和它們被抗氧化防御系統(tǒng)清除之間的平衡決定了成熟和衰老的速度，從而決定了水果的保質(zhì)期[13]。在果實(shí)成熟和衰老過程中，ROS的過量積累會導(dǎo)致氧化應(yīng)激[14]。植物體內(nèi)存在不同的酶系統(tǒng)來抵抗這種氧化應(yīng)激[15]。在清除ROS的酶促系統(tǒng)中，過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）起關(guān)鍵作用。目前有關(guān)RLS對梨果采后病害的控制作用及其機(jī)理尚鮮見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)研究了RLS處理對黑斑病的控制作用及對早酥梨組織苯丙烷代謝、ROS代謝以及對病程相關(guān)蛋白的影響，以期為早酥梨采后病害的綠色防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試早酥梨采摘自甘肅省白銀市景泰縣條山農(nóng)場，挑選無任何病蟲害、機(jī)械損傷，且大小形狀均勻的健康果實(shí)，去除田間熱后，于4 ℃冷庫中貯藏待用。

RLS（相對純度≥95%）西安瑞捷生物科技有限公司；丙酮、硫代巴比妥酸、三氯乙酸 上海源葉生物科技有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP＋）試劑盒、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）試劑盒、H2O2試劑盒、試劑盒、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）試劑盒、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,GSSG）試劑盒、幾丁質(zhì)酶試劑盒、β-1,3-葡聚糖酶試劑盒蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2電熱恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器公司；TGL-20M低溫高速離心機(jī) 長沙平凡儀表有限公司；1510 型酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾公司；UV-2450型紫外-可見光分光光度計(jì) 日本島津公司；SPX-30085H-II型生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；A11 B S025研樣機(jī) 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 RLS誘抗處理對早酥梨黑斑病的控制效果

早酥梨清洗后用體積分?jǐn)?shù)1%次氯酸鈉消毒2 min，再經(jīng)蒸餾水沖洗，晾干，然后在質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50 mg/mL RLS溶液中浸泡20 min，室溫下晾干。24 h后用無菌鐵釘（直徑3 mm）在果實(shí)赤道部位均勻地打3 個(gè)孔（深3 mm），待其晾干后接種1×106個(gè)/mL的A.alternata孢子懸浮液，待孢子懸浮液晾干。以無菌水處理作為對照。通過十字交叉法，每3 d測量一次果實(shí)的病斑直徑，并記錄數(shù)據(jù)，測量至第15天。每個(gè)處理用9 個(gè)梨果實(shí)，重復(fù)3 次。

1.3.2 生化指標(biāo)測定取樣

誘抗處理后，在誘抗后的0、7、14、21、28、35 d用滅菌手術(shù)刀取皮下2 mm左右的果肉組織，液氮迅速冷凍后用研樣機(jī)研磨成粉末，于50 mL離心管保存待用，最后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 苯丙烷代謝相關(guān)酶活力及其代謝產(chǎn)物的測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活力的測定參照Shang Qingmao等[16]的方法，單位以U/g表示。C4H活力的測定參照Zhou Fuhui等[17]的方法，單位以U/（min·g）表示。4CL活力的測定參照Knobloch等[18]的方法，單位以U/（min·g）表示。CAD活力的測定參照Li Hua等[19]的方法，單位以U/（min·g）表示。總酚含量的測定參照Scalbert等[20]的方法，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示，單位為mg/100 g。類黃酮含量的測定參照Cvek等[21]的方法，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算類黃酮含量，單位以mg/100 g表示。

1.3.4 ROS代謝相關(guān)指標(biāo)的測定

細(xì)胞膜透率的測定參照Zhu Liqin等[22]的方法，用直徑為10 mm打孔器取皮下2～5 mm處的果肉組織圓片3.0 g，去離子水沖洗3 遍后瀝干水分，再放入含有40 mL去離子水的小燒杯中，放置3 h（25 ℃），記錄起始電導(dǎo)率E0/（μS/cm）和終止電導(dǎo)率E1/（μS/cm）。最后將杯沸水浴加熱（95 ℃、0.5 h），冷卻到室溫后測定其最終的電導(dǎo)率EZ/（μS/cm）。細(xì)胞膜透率計(jì)算如公式（1）所示。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）濃度的測定參照Sun Jiang等[23]的方法，在5 mL質(zhì)量濃度100 g/L三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液中加入2 g組織粉末研磨，振蕩混勻，冰浴浸提10 min后，4 ℃、8 000×g離心5 min后，取上清液2 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.67%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）溶液2 mL，對照組以TCA溶液代替，混勻后再次沸水浴20 min，冷卻至室溫后，4 ℃、8 000×g離心5 min后，在450、532、600 nm波長處測定反應(yīng)液的吸光度。MDA濃度計(jì)算如公式（2）所示。

H2O2含量及含量采用試劑盒進(jìn)行測定。H2O2含量以μmol/g表示，含量以nmol/g表示。

NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）活力的測定參照Fluhr等[24]的方法；SOD、CAT活力的測定分別參照Bewley[25]和Gao Huijuan[26]等的方法；POD活力的測定參照Venisse等[27]的方法；APX活力的測定參照Bao Gaihong等[28]的方法；以上結(jié)果均以U/g表示。

采用試劑盒測定NADP＋、NADPH含量，結(jié)果以nmol/g表示。谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活力的測定參照Cao Shifeng等[29]的方法，結(jié)果以nmol/（min·g）表示。單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）活力的測定參照Wei Meilin等[30]的方法，結(jié)果以nmol/（min·g）表示。脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）活力的測定參照Yu Xiaozhang等[31]的方法，結(jié)果以nmol/（min·g）表示。采用試劑盒進(jìn)行GSH、GSSG含量的測定，結(jié)果分別以μmol/g、nmol/g表示。

1.3.5 病程相關(guān)蛋白酶活力的測定

幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶活力的測定采用試劑盒進(jìn)行測定，結(jié)果以mg/（g·h）表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013軟件計(jì)算，并用Origin 2017軟件作圖，用SPSS 26.0軟件對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s多重差異顯著分析。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，且結(jié)果均以鮮質(zhì)量計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RLS誘抗處理對早酥梨黑斑病的控制效果

RLS誘抗處理顯著抑制了早酥梨黑斑病的擴(kuò)展，處理組與對照組之間差異明顯，但各處理之間差異不明顯（圖1A）。在12 d后，質(zhì)量濃度20 mg/mL的RLS處理組病斑直徑顯著低于質(zhì)量濃度10 mg/mL處理組（P＜0.05），其病斑直徑僅為對照組的64.29%，但與質(zhì)量濃度30、40、50 mg/mL的處理組之間無顯著差異（P＞0.05）（圖1B），因此以質(zhì)量濃度20 mg/mL的RLS處理研究其誘抗機(jī)理。同時(shí)由圖1A可知，RLS處理的早酥梨果實(shí)的黃化程度明顯低于對照組。

圖1 RLS誘抗處理對早酥梨黑斑病擴(kuò)展（A）及病斑直徑（B）的影響Fig.1 Effect of RLS treatment on the development of black spot disease (A) and lesion diameter (B) in ‘Zaosu’ pears

2.2 RLS處理對梨果苯丙烷代謝的影響

2.2.1 RLS處理對梨果PAL、C4H、4CL和CAD活力的影響

PAL、C4H、4CL和CAD是果實(shí)組織苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶。貯藏期間處理組和對照組梨果體內(nèi)PAL活力呈先升高后降低的趨勢，RLS處理后PAL活力較對照組顯著提高（P＜0.05），第28天達(dá)到峰值后降低，RLS處理組早酥梨的PAL活力在第28天時(shí)比對照組提高了24.56%（P＜0.05）（圖2A）。早酥梨果實(shí)的C4H活力呈單峰型變化，在第21天時(shí)RLS處理組C4H活力顯著高于對照組（P＜0.05），其活力高出對照組10.66%（圖2B）。梨果組織4CL活力整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第28天達(dá)到峰值，且整個(gè)貯藏過程中處理組顯著高于對照組（P＜0.05）（圖2C）。CAD活力隨貯藏時(shí)間的延長先增加后降低，在第28天達(dá)到峰值，此時(shí)RLS處理的早酥梨的CAD活力高出對照組20.73%（P＜0.05）（圖2D）。

圖2 RLS處理對貯藏期間早酥梨PAL（A）、C4H（B）、4CL（C）和CAD（D）活力的影響Fig.2 Effect of RLS treatment on the activities of PAL (A),C4H (B),4CL (C) and CAD (D) of ‘Zaosu’ pears during storage

總酚和類黃酮是苯丙烷代謝產(chǎn)物的主要產(chǎn)物。在貯藏期間果實(shí)的總酚含量總體呈上升的趨勢，且RLS處理的梨果總酚含量均顯著高于對照組（P＜0.05），在第28天，RLS處理的早酥梨的總酚含量高出對照組11.63%（P＜0.05）（圖3A）。梨果類黃酮含量隨貯藏時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，在第28天達(dá)到峰值，此時(shí)RLS處理組早酥梨的類黃酮含量高出對照組7.98%（P＜0.05）（圖3B）。

圖3 RLS處理對貯藏期間早酥梨總酚（A）和類黃酮（B）含量的影響Fig.3 Effect of RLS treatment on the contents of total phenols (A) and total flavonoids (B) in ‘Zaosu’ pears during storage

2.3 RLS處理對梨果ROS代謝的影響

2.3.1 RLS處理對梨果NOX和SOD活力的影響

早酥梨的NOX、SOD活力在貯藏期間呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢，RLS處理組的NOX活力在貯藏期間均顯著高于對照組（P＜0.01、P＜0.05），在第14天達(dá)到峰值，此時(shí)處理組高出對照組15.52%（P＜0.01）（圖4A）。除第28天外，處理組的SOD活力均顯著高于對照組（P＜0.01、P＜0.05），在第7天差異極顯著（P＜0.01），此時(shí)處理組高出對照組23.06%（圖4B）。

圖4 RLS處理對貯藏期間早酥梨NOX（A）、SOD（B）活力的影響Fig.4 Effect of RLS treatment on the activities of NOX (A) and SOD (B) in ‘Zaosu’ pears during storage

2.3.2 RLS處理對梨果H2O2和含量的影響

早酥梨果實(shí)的H2O2含量在貯藏期間呈單峰變化，RLS處理顯著提高了梨果組織H2O2含量，在貯藏第21天時(shí)，RLS處理的早酥梨的H2O2含量極顯著高出對照組54.79%（P＜0.01）（圖5A）。早酥梨組織的含量呈先上升后下降的趨勢，RLS處理提高了前期含量，后期處理組含量低于對照組（圖5B）。

城中，槍聲還在繼續(xù)。木排上的戰(zhàn)士們望著城中槍響的方向，心里說不出的悲傷。這時(shí)，一名戰(zhàn)士發(fā)現(xiàn)躺在身邊的夏國忠哼了一聲，他轉(zhuǎn)頭看去，夏國忠嘴里涌出一股血，隨即停止了呼吸。

圖5 RLS處理對貯藏期間早酥梨H2O2含量（A）和含量（B）的影響Fig.5 Effect of RLS treatment on H2O2 content (A) and superoxide anion radical content (B) of ‘Zaosu’ pears during storage

2.3.3 RLS處理對梨果CAT和POD活力的影響

貯藏前期，RLS處理組和對照組果實(shí)的CAT活力隨貯藏時(shí)間延長逐漸升高，貯藏第14天時(shí)，RLS處理組早酥梨的CAT活力高出對照20.83%（P＜0.05）（圖6A）。POD活力呈單峰型變化，在第7天達(dá)到最大值，此時(shí)RLS處理組高出對照組39.63%（P＜0.01）（圖6B）。

2.3.4 RLS處理對梨果APX、MDHAR、DHAR、GR活力的影響

APX 活力在誘抗處理期間先上升后降低，在第14天達(dá)到峰值，此時(shí)RLS處理梨果APX活力高出對照組27.59%（P＜0.01）（圖7A）。MDHAR活力在貯藏前期迅速上升，后面趨于平穩(wěn)，在第28天RLS處理組的MDHAR活力顯著高出對照組9.50%（P＜0.05）（圖7B）。DHAR的活力先上升后下降，在第21天達(dá)到峰值，此時(shí)RLS處理組高出對照組77.78%（P＜0.01）（圖7C）。RLS處理和對照果實(shí)的GR活力隨貯藏時(shí)間延長先升高后降低，與對照組相比，RLS處理提高了GR活力，在第21天達(dá)到峰值，其值高出對照組43.59%（P＜0.01）（圖7D）。

圖7 RLS處理對貯藏期間早酥梨APX（A）、MDHAR（B）、DHAR（C）和GR（D）活力的影響Fig.7 Effect of RLS treatment on the activities of APX (A),MDHAR (B),DHAR (C) and GR (D) in ‘Zaosu’ pears during storage

2.3.5 RLS處理對梨果GSH和GSSG含量的影響

RLS處理組和對照組果實(shí)的GSH含量隨貯藏時(shí)間延長均呈上升趨勢，RLS處理組GSH的含量顯著高于對照組（P＜0.05、P＜0.01），在第35天，處理組的GSH含量高出對照組25.97%（P＜0.05）（圖8A）。梨果組織的GSSG含量隨貯藏時(shí)間的延長呈先上升后降低再趨于平穩(wěn)的趨勢，除第7、14天外，RLS處理組梨果GSSG含量低于對照組，在第21天達(dá)到峰值，此時(shí)RLS處理組GSSG含量低于對照組5.40%（P＜0.05）（圖8B）。

圖8 RLS處理對貯藏期間早酥梨GSH（A）、GSSG（B）含量的影響Fig.8 Effect of RLS treatment on GSH (A) and GSSG (B) contents in‘Zaosu’ pears during storage

2.3.6 RLS處理對梨果NADP＋和NADPH含量的影響

NADPH是NADP的還原態(tài)形式，在電子傳遞中也作為電子供體給出電子。貯藏期間，梨果NADP＋的含量呈先上升后下降的趨勢，在第28天達(dá)到峰值，此時(shí)RLS處理的早酥梨的NADP＋含量高出對照組13.51%（P＜0.05）（圖9A）。梨果組織NADPH的含量在貯藏前期上升明顯，在第14天時(shí)達(dá)到峰值，后期趨于平穩(wěn)。在第14天時(shí)，RLS處理組早酥梨NADPH含量高出對照組8%（P＜0.05）；在整個(gè)貯藏期間，RLS處理組果實(shí)的NADPH含量顯著高于對照組果實(shí)（P＜0.05）（圖9B）。

圖9 RLS處理對貯藏期間早酥梨NADP＋（A）和NADPH（B）含量的影響Fig.9 Effect of the RLS treatment on NADP+ (A) and NADPH (B)contents in ‘Zaosu’ pears during storage

2.3.7 RLS處理對梨果MDA濃度和細(xì)胞膜透率的影響

細(xì)胞膜透率是評估膜滲透性的有效參數(shù)，它和MDA濃度可反映細(xì)胞膜完整性和脂質(zhì)過氧化水平[32]。早酥梨貯藏期間組織的MDA濃度逐漸上升，RLS處理的早酥梨MDA濃度在貯藏第28天時(shí)低于對照組46.39%（P＜0.05）（圖10A）。早酥梨細(xì)胞膜透率呈上升趨勢，與對照組相比，RLS處理顯著降低了細(xì)胞膜透率（圖10B）。

圖10 RLS處理對貯藏期間早酥梨MDA濃度（A）和細(xì)胞膜透率（B）的影響Fig.10 Effect of RLS treatment on MDA content (A) and cell membrane permeability (B) in ‘Zaosu’ pears during storage

2.4 RLS處理對梨果組織幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活力的影響

RLS處理的早酥梨果實(shí)中幾丁質(zhì)酶活性被顯著誘導(dǎo)，在第7、21、28天RLS處理的早酥梨的幾丁質(zhì)酶活力分別高出對照組5.87%、3.51%和4.93%（P＜0.05）（圖11A）。梨果組織β-1,3-葡聚糖酶活力隨貯藏時(shí)間的延長先逐漸上升后下降，且RLS處理組顯著高于對照組（P＜0.05），在第28天，RLS處理的早酥梨β-1,3-葡聚糖酶活力高出對照組14.87%（P＜0.05）（圖11B）。

圖11 RLS處理對貯藏期間早酥梨幾丁質(zhì)酶（A）和β-1,3-葡聚糖酶（B）活力的影響Fig.11 Effect of RLS treatment on chitinase (A) and β-1,3-glucanase (B)activity of ‘Zaosu’ pears during storage

3 討論

苯丙烷的代謝是植物最重要的次生代謝途徑之一，其在植物防御生物和非生物脅迫方面具有重要作用[33]。PAL、C4H、4CL和CAD是苯丙烷途徑中的關(guān)鍵酶。苯丙烷途徑由L-苯丙氨酸脫氨基生成肉桂酸啟動，PAL是這一過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶[34]。PAL活力的增加與植物防御途徑中活性代謝物的生物合成有關(guān)，例如木質(zhì)素、酚類物質(zhì)和類黃酮[35]。POD是木質(zhì)素合成最后階段的關(guān)鍵酶，催化單體木質(zhì)素聚合成木質(zhì)素，木質(zhì)素交聯(lián)細(xì)胞壁蛋白有助于鞏固細(xì)胞結(jié)構(gòu)。酚類化合物和黃酮類化合物是苯丙烷途徑合成的主要產(chǎn)物。本研究表明，RLS處理誘導(dǎo)了PAL、C4H、4CL和CAD相關(guān)酶活力的提高（圖2），同時(shí)促進(jìn)了總酚、類黃酮的合成（圖3），表明RLS可通過激活梨果組織的苯丙烷代謝而增強(qiáng)其抗病性。

幾丁質(zhì)酶與β-1,3-葡聚糖酶作為受不同脅迫刺激誘導(dǎo)的一組病程相關(guān)蛋白，在植物抵御病原限制和對環(huán)境的普遍適應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，病程相關(guān)蛋白可以提高整個(gè)植物對病原菌攻擊的抵抗力，與植物的發(fā)育、抗病、逆境適應(yīng)等特定機(jī)制密切相關(guān)[36]。病程相關(guān)蛋白是分子質(zhì)量相對較低的多肽，其可在受感染的植物組織中積累，并顯示出對蛋白質(zhì)降解的高抗性，病程相關(guān)蛋白的積累是植物對病原菌最具特征的防御反應(yīng)之一[37]。植物β-1,3-葡聚糖酶是一個(gè)高度復(fù)雜的大基因家族，參與病原菌防御和廣泛的正常發(fā)育過程。底物幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖是各種真菌細(xì)胞壁的主要成分。已經(jīng)證明幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶可以降解真菌細(xì)胞壁和細(xì)菌細(xì)胞壁[38-39]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)RLS誘導(dǎo)的早酥梨果實(shí)體內(nèi)幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活力的增強(qiáng)和積累有助于提高對早酥梨黑斑病的抗性（圖11），該結(jié)果與RLS防治西瓜枯萎病的研究結(jié)果相似，該研究發(fā)現(xiàn)將RLS（質(zhì)量濃度1.0 g/L）噴施在西瓜葉片可使幾丁質(zhì)酶與β-1,3-葡聚糖酶活力分別提高49.95%和63.04%，從而預(yù)防西瓜枯萎病[40]。

果蔬組織中過多的H2O2積累會引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，從而加速細(xì)胞衰老和分解[41]。在本研究中，早酥梨在貯藏的前期和中期H2O2含量略有上升，在貯藏21 d，質(zhì)量濃度20 mg/mL RLS處理的早酥梨的H2O2含量高出對照組54.79%（圖5）。Nukuntornprakit等[42]研究發(fā)現(xiàn)過量的H2O2會對水果細(xì)胞造成損害。水果中的SOD、CAT、POD、GR和GSH是細(xì)胞清除這些ROS的主要保護(hù)酶和抗氧化劑[43]。這些保護(hù)酶增加了細(xì)胞膜通透性并減少了MDA的積累以實(shí)現(xiàn)自我抗氧化保護(hù)[44]。可見RLS處理可調(diào)節(jié)梨果組織的活性的產(chǎn)生和清除水平，有效維持組織的ROS水平，防止細(xì)胞免受傷害。

NADPH是一種重要的還原等價(jià)物，在細(xì)胞抵御氧化損傷方面必不可少。NADPH為ROS的分解提供還原能力，使其成為ROS防御過程中不可或缺的一部分，可促進(jìn)植物體的生物合成。此外，還原型的NADPH在抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（ascorbate-glutathione cycle，ASA-GSH）循環(huán)中作為電子供體起重要作用[45]。NADP＋和NADPH參與生物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)是通過傳遞電子實(shí)現(xiàn)的，從而能夠調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的各種代謝活動[46]。NADPH可參與清除各種脅迫下產(chǎn)生的自由基。因此RLS處理通過改變NADPH的含量從而影響細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生和清除能力來保持細(xì)胞膜完整性以延緩果實(shí)衰老（圖9）。

RLS對梨果抗病性具有顯著的誘導(dǎo)作用，其中質(zhì)量濃度20 mg/mL RLS處理顯著抑制了早酥梨黑斑病的擴(kuò)展，同時(shí)顯著提高了梨果組織的PAL、C4H、4CL和CAD活力，以及總酚和類黃酮的含量，整體上顯著誘導(dǎo)了幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活力，顯著提高了NOX、SOD、CAT、POD活力及貯藏前期和中期H2O2和的含量，同時(shí)ROS清除系統(tǒng)AsA-GSH循環(huán)被激活，維持了梨果組織ROS動態(tài)平衡狀態(tài)，進(jìn)而降低了梨果細(xì)胞膜透率和MDA的含量。可見，采后RLS處理可通過調(diào)節(jié)梨果組織苯丙烷代謝、ROS代謝及病程相關(guān)蛋白進(jìn)而增強(qiáng)其抗病性，其在果蔬采后病害控制中具有潛在的應(yīng)用前景。