從人體腸道菌群及脂代謝的角度比較水蘇糖與益生菌糾正腸道失衡的能力

汪清美，趙 培，陳慶森，賈 彥，閆亞麗

（1.信陽農林學院制藥工程學院，河南 信陽 464000；2.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134）

目前，依據微生態學原理制成的微生態制劑（microecologics）在治療便秘、腹瀉等腸道疾病方面有很普遍的應用。益生菌、益生元和合生元都屬于微生態制劑[1-2]。報道已揭示人體攜帶有超出人體細胞數十倍甚至上百倍的微生物，其編碼的基因在數量上遠遠超出人類自身編碼的基因，僅在腸道中寄居的微生物就有約1 800 個屬，至少40 000 種細菌，這些細菌通稱為腸道菌群，即“人體腸道元基因組”[3]。雖然人體腸道內棲生著的微生物數量高達1014個，但細菌數量和種類卻隨著胃腸道微生物密度增高逐步增加，這表明腸道菌群分布是不均勻的[4]。

研究顯示，人體腸道菌群結構受人體內環境和外環境共同作用和影響，宿主基因型、年齡、飲食、疾病、藥物等成為影響人體腸道菌群結構的主要因素[2,5]。在這些因素的影響下，個體與個體之間腸道菌群的多樣性和結構也存在著差異。Wang Fang等[6]通過Illumina測序分析了中國廣西巴馬縣年齡在85～99 歲和100～108 歲兩組老年人的腸道菌群。結果顯示，在百歲老人中，腸道菌群的變化與年齡和高纖維膳食的攝入量相關。大量研究表明，腸道正常菌群對宿主健康有著十分重要的功效[7-8]。正常情況下，人體腸道內菌群結構處于平衡狀態，若這種平衡被外界擾亂，就會造成菌群失調，導致腸道功能紊亂，甚至引發或加重疾病。許多研究也證實腸道菌群失調與便秘、腹瀉、腸易激綜合征等腸道疾病相關。因此，許多研究試圖通過改善腸道微生物菌群結構來對一些疾病進行針對性治療，使人體恢復和維持健康狀態[9]。總之，胃腸道的健康直接影響著人們的生活質量和生活狀態以及健康水平，所以利用益生菌或益生元等非臨床治療的手段來達到健康的目的顯得尤為重要[10-11]。本研究選擇一組特殊的志愿者為研究對象，從改善腸道微生態著手，利用Ion Torrent PGM?測序平臺觀察微生態制劑干預后各類腸道疾病志愿者腸道菌群結構的變化，同時分析測定腸道糞便中膽固醇和膽汁酸代謝的變化。利用生物信息學的分析，建立腸道菌群結構變化與脂代謝產物變化的相關性圖譜，探究服用微生態制劑糾正志愿者腸道菌群結構失衡和改善脂代謝的能力，旨在為微生態制劑在治療人體腸道疾病和改善人體健康方面提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水蘇糖、復合益生菌（compound probiotics，CPb）和合生元MF-13由河北一然生物科技有限公司提供，其組成見文獻[12]。

總膽固醇測定試劑盒 北京北化康泰臨床試劑有限公司；總膽汁酸測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 德國QIAGEN公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit 寶生物工程（大連）有限公司；Qubit?dsDNA HS Assay Kit美國Invitrogen公司；PfuDNA Polymerase 美國Thermo Scientific公司；Ion Plus Fragment Library Kit、Agencourt?AMPure?XP Kit、Ion Xpress? Barcode Adapters Kit、Ion PGM? Template OT2 400 Kit、Ion PGM? Sequencing 400 Kit v2 美國Life Technologies公司。

1.2 儀器與設備

900超低溫冰箱、磁力架 美國Thermo Scientific公司；SW-CJ-2DD單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DYY-2C 電泳儀 北京六一儀器廠；508-U001 Ion Torrent PGM測序平臺 美國Life Technologies公司；2100生物分析儀 美國Agilent公司；Qubit 2.0熒光計 美國賽默飛世爾公司；Biowave DNA II-3分光光度計 英國柏諾公司。

1.3 方法

1.3.1 招募志愿者以及糞便樣本采集

本研究招募了一組特殊志愿者，來自合作單位河北一然生物科技有限公司，參與本研究的志愿者12 名（6男、6女），均為其公司職員和家屬，其腸道健康狀況包括健康、便秘、腹瀉、排便不規律以及口臭和失眠等癥狀（其中便秘、腹瀉癥狀由臨床醫學給定的癥狀界定，其他為自述癥狀）。在完全符合倫理道德情況下，與志愿者說明實驗目的和告知實驗流程，對志愿者進行培訓。微生態制劑干預方法參考文獻[24]。實驗期間，要求志愿者不服用抗生素藥物以及其他藥物。

糞便采集：發給志愿者糞便收集袋、采集樣本的棉棒、保存樣本的凍存管，經培訓后，自行采集糞便樣本，將采集的糞便樣品立即放入-20 ℃冷凍環境中。于干冰環境中4 h內運送至實驗室，存放于-80 ℃冰箱。采集樣本的詳細信息見表1。

表1 本研究糞便樣本收集信息Table 1 Information about fecal samples collected in this study

1.3.2 糞便微生物16S rRNA高通量測序

糞便微生物DNA的提取參考文獻[12]。將DNA提取液適當稀釋，結果A260nm/A280nm在1.8～2.0之間；取樣品DNA提取液5 μL，采用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像儀下觀察DNA條帶狀態，結果顯示獲得了完整且濃度較高的糞便細菌DNA。16S rRNA V3區的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增參考文獻[12]。按照Ion Plus Fragment Library Kit和Ion Xpress?Barcode Adapters Kit試劑盒說明書進行測序文庫的構建。

按照Ion PGM? Template OT2 400 Kit試劑盒說明書配置模板制備體系，最后按照Ion OneTouch 2儀器標準操作說明進行測序模板的制備，按照Ion OneTouchTMES操作規范并利用Ion PGMTMTemplate OT2 200 Kit試劑盒配置富集和洗脫反應體系，Ion OneTouchTMES儀器自動進行離子微球顆粒（ion sphere particles，ISPs）的富集。上機測序操作參見文獻[12]。

1.3.3 糞便中膽固醇含量的檢測

參照Kim等[13]方法，稱取糞便樣品0.2 g，轉入10 mL離心管，加入5 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V），充分勻漿。勻漿液以4 000 r/min離心l0 min，取2 mL上清移入干凈10 mL離心管，65 ℃水浴條件下用N2吹干，殘渣中加5 mL甲醇溶解，按照總膽固醇試劑盒說明書測定提取液中膽固醇的質量濃度，并進一步計算出糞便中的膽固醇含量。

1.3.4 糞便中總膽汁酸含量的測定

用10 mL離心管稱取凍存的糞便樣品約500 mg，加入5 mL蒸餾水，充分勻漿，勻漿液4 000 r/min離心10 min，取上清液[14]，按照總膽汁酸檢測試劑盒說明書測定上清液中總膽汁酸質量濃度，并進一步計算出糞便中的膽汁酸含量。

1.4 數據分析

測序數據的生物信息學及多變量統計學分析方法參見文獻[12]。

2 結果與分析

2.1 微生態制劑干預后糞便中膽汁酸和膽固醇含量的變化

如圖1所示，各干預組中糞便膽汁酸和膽固醇的含量波動較大，干預過程中均有顯著或極顯著變化，但整體變化趨勢不明顯。從膽汁酸含量的變化趨勢來看，微生態制劑干預1～2 周時，幾乎所有樣本較干預前都有顯著變化，但在干預3～8 周或干預后，除CPb組的失眠樣本外，膽汁酸含量基本上又恢復到干預前水平的趨勢，但含量整體上高于干預前水平。多數干預組膽固醇含量在干預3～8 周或干預后階段與干預前相比有顯著變化（P＜0.05、P＜0.01）。多數樣本（如水蘇糖干預組和CPb干預組）結果顯示，膽汁酸和膽固醇水平表現出此消彼長的關系，其因可能是膽汁酸的肝腸循環所致，即當腸道膽汁酸隨糞便排放量增加或減少時，膽固醇通過在肝臟中代謝來回補腸道膽汁酸的損失，引起腸道對膽固醇吸收增強或減弱[14]，而使糞便當中膽固醇含量呈現出減少或增加的趨勢。而在MF-13干預組中，膽汁酸和膽固醇水平變化趨勢呈正相關，且對促進腸道中膽汁酸和膽固醇排出有較明顯的作用，說明MF-13可能是通過影響膽汁酸的正反饋調節來使腸道中膽汁酸和膽固醇排出量增加。

圖1 各人群糞便中膽汁酸（A）和膽固醇（B）含量的變化Fig.1 Changes in bile acid (A) and cholesterol (B) contents in feces of different populations

為進一步探究3 種微生態制劑對糞便膽汁酸和膽固醇含量的影響，通過箱線圖將其在干預各階段的變化趨勢直觀地展示出來。從圖2A中可以看出，水蘇糖和CPb干預組中膽汁酸含量整體水平波動，變化趨勢不明顯，且干預前后無顯著性差異；而MF-13干預組中糞便中膽汁酸水平隨著干預時間延長呈持續增長的趨勢，整體上在3～8 周時增長顯著（P＜0.05），但在干預后有所回落，接近干預前水平。從圖2B中可以看出，水蘇糖和CPb干預組中膽固醇含量變化總體呈先下降后上升的趨勢，MF-13干預組中膽固醇平均含量變化趨勢與膽汁酸相似，在3～8 周時最高和最低值差異很大，停止干預后回到干預前的平均水平。說明3 種微生態制劑在干預過程中對糞便膽汁酸和膽固醇含量影響最為顯著是MF-13，其能夠促進腸道中膽汁酸和膽固醇的排出。但膽汁酸和膽固醇均在3 種微生態制劑干預后（即停止干預）含量恢復至干預前水平，表明微生態制劑對腸道膽汁酸和膽固醇的代謝可能有改善作用，但沒有持續性的影響。

圖2 3 種微生態制劑對糞便中膽汁酸（A）和膽固醇（B）含量的影響Fig.2 Effects of three microecological agents on contents of bile acids (A) and cholesterol (B) in feces

2.2 志愿者糞便微生物16S rRNA V3區測序文庫的構建

經StepOnePlusTM實時熒光PCR儀擴增定量，結果顯示，各樣本文庫濃度在50～300 pmol/L范圍內，均達到測序要求（≥10 pmol/L）。通過Ion Torrent PGM高通量測序平臺對樣品文庫進行測序，最終得到5 907 273 條原始序列，序列長度大多分布在170～200 bp范圍內，由于細菌16S rRNA基因的V3區長度為180 bp左右，所以測序基本符合V3區要求。對下機數據進行質控，在Bio-Linux操作系統下進行fastqc操作，最終，通過NGStoolkits軟件過濾掉序列長度低于50 bp和質量低于Q20的序列，得到2 659 306 條高質量序列。

以97%序列一致性為前提，經過Usearch軟件對所有樣品的全部Tags序列進行聚類，劃分得到1 067 個操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），其中有907 個OTU鑒定到科，666 個OTU鑒定到屬，587 個OTU鑒定到種，根據物種注釋情況，統計每個樣品注釋到各分類水平上的序列數目，由此可以了解各分類水平的整體注釋情況，結果見圖3。

圖3 糞便微生物的OTU聚類和注釋情況統計Fig.3 Clustering and annotation statistics of OTU from fecal microbial samples

2.3 志愿者腸道菌群α多樣性分析

2.3.1 測序深度分析

如圖4A所示，隨著測序量的增大，所有樣本的Shannon指數都到達平臺期，說明在此測序量下所有樣本中絕大多數菌群都能被發現。圖4B顯示，隨著測序數據量的增加，分析得到的類群數目也逐漸增長，最終曲線趨于平緩，說明測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種。如圖4C所示，隨著物種范圍的擴大，所有樣品Chao1指數基本達到飽和，說明所有樣本中絕大多數物種都被發現。如圖4D所示，隨著OTU種類的增多，曲線趨于水平，反映了較好的物種豐度和均勻度。用于判斷樣本量是否能充分估計物種豐富度的物種累積曲線如圖4E所示，隨著樣本量的增加，曲線趨于平緩，說明抽樣量充分，可以進行數據分析。

圖4 志愿者腸道菌群多樣性分析Fig.4 Analysis of intestinal flora diversity of the volunteers

2.3.2 多樣性指數分析

如圖5所示，Goods_coverage指數在3 種微生態制劑的各干預階段呈無規則小幅度波動狀，說明人體腸道菌群在各微生態制劑干預前后物種多樣性并無明顯變化。Shannon和Simpson指數變化總體趨勢較為相似：在干預1～4 周階段內，MF-13干預組Shannon和Simpson指數均有所升高，而水蘇糖和CPb干預組Shannon和Simpson指數均有所下降；在干預5～8 周和干預后階段，水蘇糖干預組和MF-13干預組Shannon指數持續均呈下降趨勢，Simpson指數干預后與5～8 周相比均有所下降，而CPb干預組Shannon和Simpson指數均為先下降后升高。水蘇糖和CPb干預組的Chao1指數在干預階段呈下降趨勢，MF-13干預組Chao1指數1～4 周階段明顯升高，但隨后的干預階段呈下降趨勢。各干預組中Shannon指數、Simpson指數和Chao1指數變化說明微生態制劑干預前后物種的多樣性以及均勻度變化是復雜的，但整體來說變化不大。

圖5 微生態制劑對腸道微生物多樣性指數的影響Fig.5 Effects of microecological agents on gut microbial diversity indexes

2.4 微生態制劑對志愿者腸道菌群在門和屬水平上豐度的影響

2.4.1 門水平的豐度變化

在所得到每個OTU包含的序列中，選取豐度最高的為代表序列，進而以此來劃分細菌分類地位，最后運用R軟件對所有樣本在門水平和屬水平上作相對豐度柱狀圖，如圖6所示。在門水平上選取每個樣本最大豐度排名前十的物種，所有OTU被劃分為10 個菌門，即疣微菌門（Verrucomicrobia）、TM7菌門、無壁菌門（Tenericutes）、互養菌門（Synergistetes）、藍細菌門（Cyanobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）。其中優勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），占到了總序列數的91.65%，其中擬桿菌門（Bacteroidetes）約占總序列數的70.10%，厚壁菌門（Firmicutes）則占總序列數的21.55%。其次是變形菌門（Proteobacteria），約占總序列數的7.30%，放線菌門約占總序列數的0.85%。無壁菌門（Tenericutes）、互養菌門（Synergistetes）、TM7菌門和疣微菌門（Verrucomicrobia）等在各樣品中所占比例基本都不足0.5%，還有0.1%左右的無法確定具體分類地位的細菌（Unassigned）。

圖6 各物種在門水平上的相對豐度Fig.6 Relative abundance of dominant phyla

水蘇糖干預組各樣本中擬桿菌門相對豐度在干預后整體上均有所升高，而厚壁菌門相應有所降低，兩者大致呈此消彼長的關系，其中，便秘（C）和大便異常（S1）兩種樣本中擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度變化幅度較大，擬桿菌門相對豐度分別由47.55%和29.18%增長至89.52%和69.96%（干預前到實驗的最后一個階段，下同），厚壁菌門相對豐度分別由44.11%和65.82%降低至8.93%和11.99%；此外，變形菌門相對豐度在水蘇糖組各樣本中變化較明顯的為便秘（C）（由4.21%降至0.51%）、大便異常（S1）（由2.27%升至16.01%）和失眠（I1）（由7.50%降至3.77%）這3 類樣本；說明水蘇糖對不同腸道環境的個體影響存在一定的差異；放線菌門和梭桿菌門所占豐度較小，除健康（H1）和大便異常（S1）樣本外，其余均無明顯變化。CPb干預組中，擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度在失眠（I2）樣本中分別呈現增長和降低的趨勢，而在健康（H2）樣本中則變化趨勢與前者相反，在其余樣本（腹瀉（D1）、口氣異常（T1））中變化幅度不大；變形菌門相對豐度在腹瀉樣本中由7.8%降至0.50%，而在其余樣本（H2、T1、I2）中有增長趨勢；放線菌門和梭桿菌門相對豐度在各樣本中整體變化不明顯。MF-13干預組中，擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度整體均無明顯變化；而變形菌門和放線菌門相對豐度呈增長趨勢，健康（H3）樣本和口氣異常（T2）樣本中變形菌門分別由8.26%和0.8%增長至16.02%和1.50%，而放線菌門分別由0.75%和0.12%增長至2.26%和0.44%，梭桿菌門相對豐度幾乎沒有變化。

從各類志愿者樣本來看，在微生態制劑干預前，同類志愿者之間腸道菌群在門水平上的結構存在差異。健康人群（H1、H2、H3，分別由水蘇糖、CPb和MF-13干預）腸道菌群在門水平上的變化表現為：H1樣本擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門相對豐度增高，而厚壁菌門和變形菌門相對豐度下降。H2樣本擬桿菌門相對豐度有所降低，厚壁菌門和變形菌門相對豐度增加，放線菌門和梭桿菌門相對豐度變化趨勢不明顯；H3樣本擬桿菌門、厚壁菌門和梭桿菌門相對豐度變化幅度較小，而放線菌門和變形菌門相對豐度增長趨勢較明顯。說明在日常飲食不受控制的前提下，3 種微生態制劑對健康志愿者腸道菌群豐度有不同的影響，有較為突出的個體差異，總地來看，水蘇糖對腸道菌群擬桿菌門和厚壁菌門比例的調節作用最明顯。便秘人群（C1、C2均由水蘇糖干預）腸道菌群門水平上的變化為：擬桿菌門相對豐度大幅增長，厚壁菌門和變形菌門相對豐度明顯降低，而放線菌門和梭桿菌門變化趨勢不明顯。說明水蘇糖對便秘人群腸道菌群結構有明顯的調節作用，并且在干預后各菌門的豐度水平逐漸接近于同組健康人群，此外，包含有很多病原菌的變形菌門豐度降低，可能也對患者的腸道健康起到積極作用。失眠人群I1、I2兩個樣本（分別由水蘇糖和CPb干預）的擬桿菌門和厚壁菌門豐度變化趨勢相同，而變形菌門豐度與其變化趨勢相反。說明CPb與水蘇糖在調節擬桿菌門和厚壁菌門豐度變化有相似作用，而CPb中包含的各種外源益生菌可能同時對變形菌門的增殖產生促進作用。口氣異常人群（T1、T2，分別由CPb和MF-13干預）兩樣本干預前后腸道菌群門水平結構均相似，干預后，擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度變化不大，而變形菌門和放線菌門豐度均有所升高。說明CPb和MF-13自身攜帶的外源益生菌可能主要通過改變這兩者的豐度來調節腸道菌群。腹瀉樣本（D1，由CPb干預）中變化趨勢較為明顯的是變形菌門和放線菌門，同以上CPb組干預結果；腹脹樣本（A1，由水蘇糖干預）和大便異常樣本（S1，由水蘇糖干預）菌群變化趨勢同以上水蘇糖組干預結果。

通過以上結果可以得出，水蘇糖對人體腸道菌群中擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度影響較大，能大幅提高擬桿菌門豐度而降低厚壁菌門豐度，并以此來影響整體腸道菌群結構。有調查報告顯示，成年人體腸道內擬桿菌門和厚壁菌門存在一種相互促進的共生關系，且兩者的比例與肥胖之間有直接關系，兩者比例降低會促進肥胖，而擬桿菌門豐度升高或厚壁菌門降低也伴隨著體脂量的減少[15]。以此推斷水蘇糖可能具備預防人體肥胖發生的功能。CPb干預組中，可能由于樣本量較少，除個別樣本外，擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度整體變化規律不明顯，在整個干預過程中呈現波動，對腸道菌群整體結構影響較小，這也可能與志愿者的飲食、生活習慣不同以及干預時間較短有關。MF-13對擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度無明顯影響，而對變形菌門和放線菌門菌群的增殖有促進作用，可能是MF-13含有的益生元為其含有的外源益生菌同時提供了增殖底物，并促進了腸道內變形菌門和放線菌門菌群的增殖。

2.4.2 屬水平的豐度變化

在屬水平上選取每個樣本最大豐度排名前十的物種，如圖7所示，包括擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、毛螺菌屬（Lachnospira）、巨型球菌屬（Megasphaera）、薩特氏菌屬（Sutterella）、巨單胞菌屬（Megamonas）、柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium）、Parabacteroides、光崗菌屬（Mitsuokella）以及小類桿菌屬（Dialister）。其中優勢菌屬為同屬于擬桿菌門下的擬桿菌屬（Bacteroides）和普雷沃氏菌屬（Prevotella）（各占總序列數的33.1%和33.8%）。

圖7 各物種在屬水平上的相對豐度Fig.7 Relative abundance of dominant genera

在水蘇糖干預組中，普雷沃氏菌屬（Prevotella）隨著干預時間的延長相對豐度呈增長趨勢，而擬桿菌屬（Bacteroides）則波動變化，其中變化較明顯的為便秘樣本C1和大便異常樣本S1，樣本C1在水蘇糖干預后，普氏桿菌屬和擬桿菌屬分別由2.84%和13.79%增長至16.49%和64.64%；在干預過程中樣本S1普氏桿菌屬和擬桿菌屬豐度均有增長趨勢，但停止干預后擬桿菌屬又回降至干預前水平，而普氏桿菌屬豐度由8.40%增長至72.90%；毛螺菌屬（Lachnospira）、柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium）和巨型球菌屬（Megasphaera）在干預過程中相對豐度普遍呈下降趨勢；薩特氏菌屬（Sutterella）相對豐度變化較明顯的是樣本C1，其由最1.45%降低至0.18%，其次是樣本I1，其由1.26%降低至0.31%，而在其余樣本中變化不大；巨單胞菌屬（Megamonas）相對豐度在樣本H1和樣本A1中有所降低，分別由3.4%和0.2%降低至0.68%和0.05%，而在樣本C1中由0.01%增至0.34%；Parabacteroides相對豐度在樣本S1和I1中變化幅度較大，分別由1.24%和0.32%降低至0.25%和0.05%，而在其余樣本中變化不大；除樣本S1外，其余各樣本中的光崗菌屬（Mitsuokella）相對豐度幾乎沒有變化；小類桿菌屬（Dialister）在各樣本中豐度有增高趨勢，但變化不顯著。在CPb干預組中，普雷沃氏菌屬（Prevotella）和擬桿菌屬（Bacteroides）相對豐度總體呈增長趨勢，在失眠樣本I2中擬桿菌屬相對豐度大幅增長，由19.8%增長至82.84%；毛螺菌屬（Lachnospira）和柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium）在各樣本中相對豐度基本變化不大，只在腹瀉樣本D1中變化明顯，毛螺菌屬相對豐度由9.75%降至0.23%，而柔嫩梭菌相對豐度在大幅升高之后又降低到原水平；薩特氏菌屬（Sutterella）相對豐度在樣本D1中降低，在樣本I2中由0.78%增至5.23%；巨型球菌屬（Megasphaera）、Parabacteroides、光崗菌屬（Mitsuokella）、小類桿菌屬（Dialister）和巨單胞菌屬（Megamonas）相對豐度則無顯著變化。在MF-13干預組中，口氣異常樣本T2中普雷沃氏菌屬（Prevotella）相對豐度先降低后升高，但最終低于干預前水平，小類桿菌屬（Dialister）和毛螺菌屬（Lachnospira）相對豐度呈降低趨勢，薩特氏菌屬（Sutterella）呈現升高趨勢，其余菌屬變化不明顯；健康樣本H3中菌群相對豐度變化則表現為Parabacteroides和巨單胞菌屬（Megamonas）略微升高，毛螺菌屬（Lachnospira）略微降低。

以上結果表明3 種微生態制劑均能提高普雷沃氏菌屬、擬桿菌屬的相對豐度，而對其余菌屬相對豐度影響主要表現在病理（便秘、腹瀉、大便異常以及腹脹）人群樣本中，如水蘇糖能降低便秘和失眠樣本中變形菌門下的薩特菌屬的相對豐度，CPb有降低腹瀉樣本中薩特菌屬以及升高具有抗炎性的柔嫩梭菌屬（Faeca Libacterium）相對豐度的作用，MF-13能夠提高樣本中Parabacteroides的相對豐度，有研究顯示，健康人腸道中Parabacteroides水平高于腸道疾病患者[16]。說明微生態制劑對腸道菌群結構影響特點雖有不同，但是均能通過降低有害菌或提高有益菌的豐度來改善腸道病理狀況。

不同志愿者腸道內核心菌屬呈現較大的差異性，大致分為兩類：一類以擬桿菌屬為優勢菌屬，另一類以普雷沃氏菌屬為優勢菌屬。以為擬桿菌屬為優勢菌屬的為健康（H2、H3）、便秘（C1）、腹瀉（D1）、口氣異常（T1）、失眠（I2）志愿者，擬桿菌屬的平均相對豐度為60.70%，而以普雷沃氏菌屬為優勢菌屬的為健康、腹脹（A1）、口氣異常（T2）、失眠（I1）志愿者，普雷沃氏菌屬的平均相對豐度為79.92%。這與Wu等[17]的研究相符，其將居民的腸道菌群劃分為以擬桿菌屬（Bacteroides）和普雷沃氏菌屬（Prevotella）為核心的兩種獨立腸道型（enterotype）[18]。

在以普雷沃氏菌屬（Prevotella）為核心菌屬的樣本（如H1、H2、A1、T2、I1）中，微生態制劑干預前后，除H2樣本的核心菌屬相對豐度有較大波動外，大部分樣本核心菌屬相對豐度未有大幅度變化；在以擬桿菌屬（Bacteroides）為核心菌屬的樣本（如H3、D1、T1）中，擬桿菌屬相對豐度在微生態制劑干預過程中有一些波動，其中腹瀉樣本（D1）在CPb干預第1周擬桿菌屬菌群豐度迅速升高，但隨著干預時間的延長又恢復至接近干預前水平。以上結果說明，各類微生態制劑對人體腸道菌群核心菌屬的影響較小，同時也印證了腸道菌群是一個處于動態平衡的生態系統，在人類進化過程當中，通過長期飲食結構、生活習慣及生存環境影響而形成的腸型結構是穩定的，其穩定與人體健康息息相關[19-20]，因此，本研究有力地證明，短時間內在外界的擾動或干預下，腸道原有的菌群結構不會發生較大改變。而個別樣本與以上變化結果不同，如便秘樣本C1、大便異常樣本S1及失眠樣本I2在干預前后核心菌屬均有波動甚至改變，但在干預后基本保持穩定，說明病理狀態下的樣本可能本身存在腸道菌群失調的狀況，而在微生態制劑干預作用下，可逐步恢復到穩定的健康狀態，也可能由于取樣不均勻的原因，造成了核心菌屬的較大波動。

2.5 微生態制劑對腸道菌群整體結構的影響

2.5.1 樣品聚類分析和降維分析

利用多變量統計學和UniFrac系統發育進化方法分析微生態制劑干預后人體腸道菌群整體結構的變化。首先，為了進一步研究OTUs的系統進化關系以及后續β多樣性指數研究的需要，通過多序列比對得到所有OTUs代表序列的系統發生關系，選取相對豐度排名前10的屬所對應OTUs的系統發生關系數據，并結合每個OTUs的相對豐度及其代表序列的物種注釋置信度信息進行整合展示[21-22]。這些屬中的OTU之間的系統進化關系如圖8所示。同屬于擬桿菌門的普雷沃氏菌屬（Prevotella）和擬桿菌屬（Bacteroides）為人體腸道菌群中的優勢菌屬，而且在進化關系上較為接近，與前文中研究結果相同；其次，菌群豐度從大到小排列依次為薩特菌屬（Sutteralla）、柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium）、Parabacteroides、巨單胞菌屬（Megamonas）、小類桿菌屬（Dialister）、Blautia菌屬、毛螺菌屬（Lachnospira）和Phascolartobacterium菌屬。

圖8 OTU的系統發育樹Fig.8 Phylogenetic tree of all OTU

隨后對OTU數據進行unweighted 和weighted UniFrac分析，生成相關的UniFrac距離矩陣。通過基于UniFrac的非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）分析和基于OTU水平的無度量多維標定（non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）分析[23]）來分析微生態制劑對人體腸道菌群整體結構的影響。

UPGMA聚類結果如圖9所示，左側為聚類樹，右側為各樣品在門水平上最大相對豐度排名前十物種的相對豐度分布圖。NMDS結果如圖10所示，其結果與UPGMA聚類結果相同。NMDS結果顯示，不同受試人群樣點群基本上分開，而同類志愿者樣點基本聚在一起，很好地反映出各類人群腸道菌群結構差異的特點。從圖中各樣點群來看，失眠（I2）與健康（H1、H2）樣點未交疊在一起，便秘（C1、C2）、大便異常（S1）、健康（H3）及腹瀉（D1）樣點的距離較接近，而口氣異常（T1）和腹脹（A1）樣點與其他樣點分開距離較大且各自緊密成簇，微生態制劑干預后樣點與干預前樣點分開距離較小，且與其他樣本點無任何交疊，原因可能是志愿者的腸道菌群結構相對較穩定，受外界干預擾動較小；從各樣點群內來看，各類人群菌群結構基本上是隨著干預時間延長，與干預前差異增大，而停止干預后，樣點又逐漸接近干預前的樣點，雖然微生態制劑干預的過程中對腸道菌群結構有一定的調節作用，但干預停止后腸道菌群結構又恢復至干預前，可能是因為志愿者飲食結構、年齡或生活習慣對腸道菌群結構作用較大原因。說明相對短期的外源干預并不能使腸道菌群結構有較大改變。其中較為特殊的是便秘（C1）樣點，在微生態制劑干預前后在圖中橫軸方向上拉開較大距離，并逐漸靠向腹瀉樣點群，說明水蘇糖對便秘志愿者的腸道菌群結構有著顯著的調節作用，并有助于改善便秘的病理狀況。

圖9 基于weighted UniFrac距離的UPGMA聚類樹Fig.9 UPGMA clustering tree based on the weighted Unifrac distance

圖10 志愿者腸道微生物樣本的NMDS分析Fig.10 NMDS analysis of fecal microbial samples from volunteers

2.5.2 樣本豐度聚類結果

如圖11所示，所有樣本中，除口氣異常樣本T1、腹脹樣本A1中干預前后樣本均單獨聚在一起外，其余受試人群的樣本均出現交疊，其中交疊跨度最大的為便秘樣本，此結果與圖10結果相似，說明微生態制劑對大部分樣本腸道菌群結構產生了影響，尤其是對水蘇糖干預下的便秘樣本影響顯著。

圖11 物種豐度聚類熱圖Fig.11 Heatmap showing the clustering of species abundance

從圖11可以看出，各樣品的菌屬存在明顯的差異，差異明顯的為普雷沃氏菌屬（Prevotella）和擬桿菌屬（Bacteroides），兩菌屬對應區域黃、藍顏色差異明顯，從橫向（樣本）來看，普雷沃氏菌屬在左右兩側偏藍，中間偏黃，而擬桿菌屬在左右兩側偏黃，中間偏藍，說明兩者呈負相關關系，同時可以看出，聚類圖根據這兩種菌屬的豐度將受試樣本主要劃分為分別以擬桿菌屬和普雷沃氏菌屬為核心菌屬的兩類，再次印證了腸道型的概念。

物種豐度聚類熱圖中菌屬豐度較高的菌屬及其對應的樣本，以及樣本中膽固醇和膽汁酸含量變化情況如表2所示。可以看出在干預前，C1、C2、S1、I2、DI這些病理樣本相對豐度較高的菌群不同，并且在干預中和干預后階段這些菌群豐度大幅降低，說明微生態制劑的干預可能導致了這些菌群豐度的降低，并且這些菌群也可能是引起相應病理狀況的特征菌。在干預中階段，樣本H1、C2、S1、H2、T1、T2、H3中有一些菌群豐度升高，在干預后階段H3樣本中也有相應菌群豐度增加，其中在MF-13干預下，外源益生菌Parabacteroides和Bifidobacterium相對豐度大幅增加。說明3 種制劑具有調節腸道菌群的作用，其中MF-13對于增加腸道菌群中的有益菌有更顯著的作用。

表2 個體中豐度較高的腸道菌群Table 2 Intestinal bacterial genera with high abundance in individuals

此外，結合膽汁酸和膽固醇含量變化來看，如在干預前，C1.P、C2.P、D1.P樣本對應的糞便膽固醇和膽汁酸水平均較低，但在干預后兩者均有升高趨勢，在干預中階段，H1.S.4、S1.S.3、T2.S.1等樣本對應的糞便膽固醇和膽汁酸水平有升高或者降低，而這些樣本對應的豐度較高的菌屬隨后豐度降低，說明這些菌屬可能是影響腸道脂質代謝的關鍵菌屬，但其對糞便膽固醇和膽汁酸水平變化的影響規律不盡相同，并且這些較高豐度的菌屬以及其對于腸道脂質代謝的具體作用機制和潛在臨床意義還有待于一步探索。

2.6 Metastat統計學分析

經Metastat分析檢測各組腸道菌群中具有明顯差異的物種。從各干預組來看，樣本在微生態制劑干預前后并無OTUs豐度的明顯變化，因本研究中志愿者復雜、分組較多，且具有不同的腸型[18]，所以嘗試從腸型入手，分析微生態制劑干預過程中同種腸型下各樣本間腸道菌群中具有顯著性差異的菌屬。文獻[24]展示了不同受試人群腸道菌群具有顯著差異（P＜0.05、q＜0.05，q值是P值校正后的結果）的物種，與本研究中的差異物種一致。

分析以普雷沃氏屬為核心菌屬的樣本H1、A1、I1、T2，以健康樣本H1為參照，將樣本A1、I1、T2分別與其進行兩兩對比經Metastat分析發現（表格未附上，下同），腹脹樣本A1、失眠樣本I1與H1之間在門、綱和目水平上沒有差異顯著的菌群，而樣本A1中消化球菌科（Peptococcaceae）相對豐度高于樣本H1，失眠樣本I1與H1相比，Barnesiellaceae科和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）相對豐度較低，而Butyricicoccus相對豐度較高；口氣異常樣本T2與H1相比，厚壁菌門（Firmicutes）及其門下的梭菌綱（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）及毛螺菌科（Lachnospiraceae）相對豐度較高，并且T2中變形菌門下的變形菌綱（Deltaproteobacteria）、脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）、脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）和嗜膽菌屬（Bilophila），以及放線菌門下的Coriobacteriia綱相對豐度均顯著高于樣本H1。

分析以擬桿菌屬為核心菌屬的樣本H3、C1、D1、S1、I2、T1，以健康樣本H3為參照，進行兩兩對比，經Metastat分析發現，便秘樣本C1中與健康樣本H3菌群存在顯著差異的為變形菌門及其門下的β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、伯克氏菌目（Burkholderiales）、產堿桿菌科（Alcaligenaceae）以及薩特氏菌屬（Sutterella），此外，樣本C1擬桿菌門下的普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、[Odoribacteraceae]科、理研菌科（Rikenellaceae）及普雷沃氏菌屬（Prevotella）、[Odoribacter]相對豐度顯著高于H3，而薩特菌屬（Sutterella）和光崗菌屬（Mitsuokella）相對豐度較低；大便異常樣本S1中差異較顯著的為β-變形菌綱及其下的產堿桿菌科及薩特氏菌屬和擬桿菌門下的[Paraprevotellaceae]菌科及Paraprevotella菌屬，其相對豐度顯著低于樣本H3；腹瀉樣本D1中差異顯著的是變形菌門下的β-變形菌綱、伯克氏菌目（Burkholderiales）、產堿桿菌科（Alcaligenaceae）和薩特氏菌屬（Sutterella），以及厚壁菌門下的光崗菌屬（Mitsuokella）和小類桿菌屬（Dialister），其相對豐度較低；失眠樣本I2與H3差異顯著的為光崗菌屬（Mitsuokella）；而口氣異常樣本T1與H3差異顯著的菌群較多，有4 個菌門、4 個菌綱、5 個菌目、11 個菌科、12 個菌屬差異顯著，主要是分布在擬桿菌門及其門下的綱、目、科、屬相對豐度較高，梭桿菌門和厚壁菌門及其門下所屬物種、變形菌門、放線菌門下所屬物種相對豐度較低，此結果與NMDS分析結果相似（樣本T1在NMDS圖上與其他樣本樣點距離分開較大）。

3 討論

從整體上看，本研究通過對微生態制劑干預后不同疾病人群腸道微生物α多樣性分析發現，在水蘇糖和CPb干預組中呈波動甚至有降低趨勢，但干預前后無明顯性差異；而MF-13對樣本內物種豐度及多樣性的提高有促進作用，其原因可能是MF-13含有的益生菌和益生元共同促進了腸道內相關菌群的增殖，并且其促進作用較單獨的益生元或益生菌更明顯，說明合生元MF-13能夠在一定程度上改善宿主腸道微生物的多樣性和物種豐度。李艷艷等探討不同組合的合生元對CCl4所致急性化學性肝損傷小鼠的肝臟保護作用，結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠擬桿菌門和變形菌門相對豐度升高，而厚壁菌門相對豐度降低[25]。此外，在干預過程中由于未對外界因素（如飲食和作息習慣等）進行控制，且各干預組中存在個體間生理狀態的差異，這些因素可能對腸道微生物多樣性產生較大干擾，但實驗結果顯示，微生態制劑對腸道微生物多樣性并無明顯變化，提示在多種外界因素存在情況下，微生態制劑可能在一定程度上抵御了外界因素對腸道微生物多樣性的干擾，維持了腸道微生態的平衡。

本研究對各類志愿者所有樣本在門水平和屬水平上的相對豐度變化進行分析，在門水平上占優勢的為擬桿菌門和厚壁菌門，各干預組門水平相對豐度變化結果顯示，水蘇糖對兩大優勢菌門相對豐度影響趨勢較明顯，其能促進擬桿菌門而抑制厚壁菌門菌群的增殖；CPb對各菌門的豐度變化無顯著影響；而MF-13對變形菌門和放線菌門相對豐度影響較明顯，兩者均呈增長趨勢。結果表明，水蘇糖作為一種增殖因子，可能促進了腸道內某些菌群的增殖，間接抑制了另一些菌群的增殖，而較集中地表現在擬桿菌門菌群相對豐度增長和厚壁菌門相對豐度的降低。許多研究顯示，肥胖者腸道內兩者的比例往往低于健康者。提示水蘇糖有維持機體健康的潛在益生作用。CPb對各菌門的豐度變化無明顯影響，可能與外界干擾因素或干預周期長短相關。而MF-13同時含有益生菌與益生元，能使其含有的外源益生菌更好地定植于腸道內，從而促進放線菌門的增殖，但結果顯示同時伴隨有變形菌門的增殖，其可能的原因是腸道各菌群之間復雜的共生及競爭關系所致。從菌屬水平上的分析發現，志愿者被劃分為擬桿菌屬腸型和普雷沃氏菌屬兩種腸型，這與Wu等[17]的研究結果相似。從微生態制劑對腸型的影響來看，除個別樣本外，3 種微生態制劑對于腸型即核心菌屬的改變幾乎無影響，說明相較于短期的微生態制劑干預，長期固定的膳食結構對腸道菌群結構的形成及穩定有著深遠的影響。岳文秀等[26]的研究結果顯示，紅葡萄酒花色苷可促進腸道益生菌生長，抑制部分有害菌增殖，可調節腸道菌群結構和功能、提高人體腸道新陳代謝能力，但未說明停止干預時，腸道菌群結構的變化情況。微生態制劑干預后，個別樣本中核心菌屬變化較大，但隨著干預時間延長，核心菌屬逐漸穩定，原因可能是志愿者本身處于的病理狀態的影響或者是初期取樣不均造成。另外，3 種微生態制劑均能普遍提高普雷沃氏菌屬和擬桿菌屬的相對豐度，對于病理樣本菌群的影響主要表現為提高有益菌相對豐度而降低有害菌的豐度。

在NMDS分析和聚類分析中，微生態制劑干預過程中大部分志愿者腸道菌群結構出現交疊，而停止干預后，又接近于干預前狀態，說明微生態制劑對腸道菌群結構的改變有一定的影響，但并不能產生持續性的影響，同時揭示腸道微生態一直處于動態平衡，外在干擾因素消失后，又恢復到干擾前狀態。但對于病理樣本，如便秘和腹瀉樣本干預前后相比腸道菌群結構變化較大，在停止干預后并未出現恢復至干預前狀態，表明微生態制劑可能對于失調的腸道菌群有著明顯的調節作用和益生作用。本研究還對同種腸型人群下個體間菌群差異進行了Metastat分析，將各類疾病人群與健康人群對比，意在找到存在顯著差異的菌群。分析發現即使在同種腸型下比較，個體之間存在的差異仍較大，其結果與NMDS及聚類分析結果相似，與健康人群存在差異菌群越多，在NMDS及聚類圖上相應的距離也越遠。

總之，因各干預組樣本量及受試個體差異較大，本實驗未能找出各微生態制劑在干預前后腸道菌群結構明確的變化規律，但通過干預前后的比較發現，3 種微生態制劑對腸道菌群結構，特別是對于病理狀態下個體的腸道菌群有一定的調節作用，并使其趨向于健康狀態。

膽固醇是人體必需的營養成分，而膽汁酸有助于腸道中膳食脂肪和脂溶性維生素的吸收[27]，膽固醇在肝臟中經一系列酶促反應轉換膽汁酸，兩者的代謝密切相關，在肝腸循環中互相調控，以維持機體代謝平衡，其中，腸道內菌群對膽汁酸和膽固醇的代謝發揮著重要作用。許多研究顯示，益生菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌以及糞球菌等能夠促進腸道內膽汁酸的排出，減少膽汁酸的肝腸循環，同時促進膽固醇轉變為膽汁酸，如此，益生菌在降低機體膽汁酸的同時能夠降低血液中膽固醇水平，而兩者在糞便中的含量有所增加。

本研究結果顯示，水蘇糖和CPb對糞便中膽汁酸和膽固醇含量變化趨勢的影響不明顯，膽汁酸和膽固醇水平在水蘇糖和CPb組表現出此消彼長的關系，可能是膽汁酸和膽固醇的肝腸循環和膽固醇的回補作用所致；而在MF-13干預組中，膽汁酸和膽固醇水平變化趨勢呈現正相關，MF-13對糞便中膽汁酸和膽固醇的排放有促進作用，且整體上均在干預階段3～8 周時作用顯著（P＜0.05），但在干預停止后糞便中膽汁酸和膽固醇含量均回落至干預前水平。一方面，MF-13在促進腸道中膽汁酸排出的同時也能促進膽固醇的排出，說明MF-13除了能對膽汁酸的肝腸循環產生影響外，還有可能是其所含有的某些益生菌及其引起的腸道中某些變化的菌屬，通過某些降膽固醇機制來促進機體膽固醇的排出；另一方面，3 種微生態制劑在停止干預后，對糞便膽汁酸和膽固醇水平不再產生影響，此結果與腸道菌群在門、屬水平豐度和菌群結構的變化結果相類似，表明相對短期的干預不能產生持續性的影響，提示相對短期內，益生菌在腸道內的定殖或其所引起的相關菌屬的變化是不穩定的。

4 結論

本實驗通過微生態制劑干預不同腸道疾病人群，利用二代測序結合生物信息學的分析方法進行研究，發現3 種益生菌制劑均會對腸道菌群的多樣性和結構造成影響。在門水平上，水蘇糖能促進擬桿菌門而抑制厚壁菌門菌群的增殖；CPb對擬桿菌門和厚壁菌門菌群相對豐度的影響不明顯，在整個干預過程中各菌門的豐度變化呈現波動；合生元MF-13對擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度無明顯影響，而對變形菌門和放線菌門菌群的增殖有促進作用。在屬水平上，水蘇糖能明顯降低便秘和失眠樣本中變形菌門下的薩特菌屬的豐度，CPb對降低腹瀉樣本中薩特菌屬以及升高柔嫩梭菌屬的豐度有明顯作用，MF-13能夠提高樣本中Parabacteroides的豐度。在腸道菌群結構上，大部分樣本在微生態制劑干預過程中菌群結構都產生變化，并有群體間相互交疊的趨勢，而干預停止后又趨于干預前狀態。說明短期的微生態制劑干預相較于長期的飲食結構、環境和生活習慣等，對腸道菌群結構的糾正是暫時性而非持久性的，且從腸型的改變上來看，其糾正的強度也相對較弱。

另外，通過對各類人群糞便樣本中膽固醇和膽汁酸含量的測定，發現在3 種微生態制劑干預過程中，水蘇糖和CPb對志愿者糞便膽汁酸和膽固醇含量變化趨勢整體不明顯，而MF-13對腸道膽汁酸和膽固醇的排出整體上有顯著的促進作用（P＜0.05），但干預的持續性不明顯，表明MF-13有利于改善膽固醇的代謝，在干預過程中對維持機體健康狀態具有積極作用。