崔旭海,白 云,徐幸蓮,周怡汝,畢海丹,*,馮曉慧
(1.棗莊學院食品科學與制藥工程學院,山東 棗莊 277160;2.南京農業大學食品科學技術學院,國家肉品質量安全控制工程技術研究中心,江蘇 南京 210095)
肌球蛋白是肌原纖維中含量最豐富的蛋白質,約占肌肉蛋白質的1/4,是影響肌肉蛋白凝膠形成能力的主要組分,在肉類品質中發揮著重要作用[1]。高壓已被證明會引起蛋白質結構的變化,從而改善肌肉蛋白質的凝膠特性[2]。高壓處理作為一種非熱處理技術,可用于改善食品中蛋白質的結構[3],進而改變其食用和功能特性,因此受到了廣泛關注。研究表明,不同水平的壓力處理對肌肉蛋白熱凝膠特性影響差異較大[4-6]。Xue Siwen等[7]的研究表明300 MPa的高壓處理會使肌球蛋白過度變性;Iwasaki等[8]也發現200 MPa以上的高壓處理會壓縮肌球蛋白分子的體積,導致凝膠強度和表面彈性下降,其作用效果與壓力和蛋白種類密切相關。絕大多數的報道均顯示,適宜的高壓處理可以增強肌球蛋白乳液的凝膠形成能力,顯著改善畜禽肉類產品的保水性和質構特性等凝膠特性[9-12]。
蛋白質的熱凝膠特性對于肉類食品最終質地和口感的形成影響很大,而植物油作為食品加工中重要的添加成分,同樣對產品的質地和風味影響較大。研究表明,添加的油脂在熱加工過程中能夠穩定肉糜蛋白質凝膠網狀結構,改善產品的質構特性和保水性,同時賦予產品良好的風味和口感[13]。對魚糜的研究表明,添加外源油脂不僅能改善魚糜制品的滋味和營養特性,而且脂質能通過與魚糜蛋白的乳化作用進而改善魚糜蛋白凝膠的功能特性[14]。目前,多數研究集中在探討超高壓條件[2,7,15]、食鹽的添加[16-17]、磷酸鹽的添加[12,17]等因素對肌原纖維蛋白或肌球蛋白凝膠特性[3-5]、理化性質[1-2]和相關功能性質[10,12]的影響方面;而關于超高壓條件下油脂的添加對肌肉蛋白凝膠特性的影響鮮有研究,尤其是不同壓力下結合油脂的添加對肌球蛋白熱凝膠特性的影響規律尚未明晰。
本實驗利用不同高壓處理的兔肉肌球蛋白在非變性溫度下添加不同體積分數植物油制備乳化體系,研究在后續升溫過程中熱凝膠特性與凝膠保水性的變化,確定較優的壓力水平與植物油的添加水平,探討其變化機理,以期為油脂在乳化型肉糜類制品中的使用及相關企業更好地利用超高壓技術提供一定的參考。
3 月齡健康新西蘭雄性白兔(2.5~3.0 kg)江蘇省農科院畜牧所;氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、戊二醛(體積分數25%)、無水乙醇、叔丁醇等(均為分析純)南京化學試劑有限公司;牛血清白蛋白、雙縮脲 北京索萊寶科技有限公司;非轉基因大豆油山東魯花集團;聚乙烯真空包裝袋(20 ℃下透氧率為1 cm3/(m2·h))北京華盾塑料有限公司。
S-IL-100-850-9-W高壓設備 英國Stansted Fluid Power公司;SIM-F124制冰機 日本三洋公司;FA1104B電子分析天平 上海越平科學儀器有限公司;Waring高速組織搗碎機 美國思伯明設備有限公司;Avanti J-E高速冷凍離心機 美國貝克曼有限公司;MCR 301流變儀 奧地利Physica公司;Spectra Max M2酶標儀 美國分子設備有限公司;TA-XT Plus型物性測試儀 英國Stable Micro Systems公司;MicroMR核磁共振分析儀 上海紐邁電子有限公司;S-3000N掃描電子顯微鏡 日本日立公司;Ultra Turrax T25高速勻漿器德國IKA公司。
1.3.1 肌球蛋白的提取
參照錢暢等[12]的方法,選取健康的新西蘭雄性白兔,宰前提供飲水和充分休息,減少應激。機械擊昏后切斷頸部血管放血,迅速剝皮,去頭、爪及內臟,自來水沖洗去除血跡。瀝干后放入冰箱(4 ℃),15 min后取腰大肌并剔除可見脂肪及結締組織,切碎稱質量[12]。肌球蛋白的提取具體參照Xue Siwen等[1]的操作方法在0~4 ℃下進行,用雙縮脲法檢測肌球蛋白質量濃度。最后用0.6 mol/L KCl(pH 6.5)緩沖溶液將蛋白質量濃度調至20 mg/mL,備用。
1.3.2 高壓處理及不同油脂添加量下乳化體系的制備
將上述肌球蛋白溶液轉移至真空包裝袋中并密封(每袋約50 g,去除氣泡),置于超高壓腔體中,在壓力100、150、200 MPa下保壓2 min,腔體溫度為10 ℃,以未進行高壓處理(0.1 MPa)的肌球蛋白作為空白對照組。然后,分別取經高壓處理和未經高壓處理的肌球蛋白溶液50 mL(20 mg/mL)、不同體積的大豆油(分別為0、10、20、30 mL)、磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L,pH 6.5),三者共計100 mL,混合后利用高速勻漿器10 000 r/min勻漿2 min,制備好的乳化體系備用。其中,所制備的16 個樣品體系具體如下:0.1 MPa處理組(油脂的體積分數分別為0%、10%、20%、30%);100 MPa處理組(油脂的體積分數分別為0%、10%、20%、30%);150 MPa處理組(油脂的體積分數分別為0%、10%、20%、30%);200 MPa處理組(油脂的體積分數分別為0%、10%、20%、30%)。
1.3.3 肌球蛋白凝膠制備
參照錢暢等[12]的方法,將上述乳化體系置于玻璃小燒杯中,并在水浴鍋中從20 ℃程序升溫(1 ℃/min)至85 ℃,保溫20 min,獲得凝膠。再將凝膠置于0~4 ℃下過夜(12 h)。測定凝膠強度、保水性、水分分布并觀察凝膠微觀結構。
1.3.4 流變特性測定
參照Zhang Yulong等[18]的方法稍作改動,使用1.3.2節中制備好的肌球蛋白乳化體系作為樣品。儀器采用平行板(上板直徑50 mm),參數設置如下:頻率為0.1 Hz,應變為1%,狹縫為0.5 mm,升溫條件為20~85 ℃(2 ℃/min),記錄儲能模量G’(彈性特征)、損耗模量G”(黏性特征)的變化情況。
1.3.5 凝膠強度的測定
參照Chen Xing等[19]的方法并略做改動,利用質構分析儀進行凝膠強度的測定,單位為g。質構分析儀參數設定:測試前探頭(P/5)下降速率2.0 mm/s,測試速率1.0 mm/s,測試后探頭上升速率1.0 mm/s,穿刺測試距離5 mm,感應力3 g,用質構分析儀自帶軟件Texture Expert English 1.22進行分析,以穿刺曲線的第一個峰值即破斷強度(g)表征凝膠強度。
1.3.6 保水性測定
參照Zhang Ziye等[20]的方法并作適當改動,通過離心失水率來表征保水性。準確稱量上述制備的凝膠樣品5 g左右置于離心管中,將離心管兩兩配平,經3 000×g(4 ℃)離心5 min后取出去除水分,準確稱量余下樣品質量,按下式計算離心損失率。
式中:m0為離心前空離心管的質量/g;m1為離心前離心管和凝膠的總質量/g;m2為離心除水之后離心管和凝膠的總質量/g。
1.3.7 核磁共振自旋-自旋弛豫時間(T2)測試
參照Han Minyi 等[9]的方法進行核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)測試,并略作改動。測試條件:質子共振頻率為22.6 MHz,測試溫度為32 ℃。取2 g凝膠樣品放入核磁共振測試管再置于分析儀中。用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列進行測試。所使用τ值為350 μs,重復掃描32 次,間隔時間為7 000 ms,得到12 000 個回波峰點數。利用儀器自帶的Multi Exp Inv Analysis軟件進行反演,得到T2及對應的峰面積所占比例(P2)。
1.3.8 掃描電子顯微鏡觀察
測試樣品的制備參照徐幸蓮[21]和錢暢[22]等的方法,首先用體積分數4%的戊二醛溶液進行固定,再用不同體積分數的乙醇溶液進行梯度脫水,然后放入叔丁醇中置換3 次,再將其凍干并用濺射鍍膜機將制備好的試樣進行噴金處理[22]。之后利用掃描電子顯微鏡選擇放大1 000 倍進行觀察。選取不同壓力下未添加油脂和添加20%油脂樣品的電子顯微鏡圖片進行分析。
本實驗凝膠強度、保水性、T2弛豫時間、P2峰面積百分數等指標均重復測定3 次,結果以平均值±標準差表示,流變特性取3 次重復的平均值進行作圖。數據分析使用Statistix 8.1軟件包中General Linear Models程序進行,對數據之間的顯著性采用Tukey HSD法進行對比(以P<0.05表示差異顯著),采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。
2.1.1 油脂添加量對凝膠G’的影響
由圖1可知,油脂添加量對肌球蛋白乳液G’的影響程度不同,且呈現一定規律性。隨著油脂添加量的增多,在所有壓力條件下,G’都呈現出明顯的增加趨勢,即30%處理組>20%處理組>10%處理組>0%處理組。與0%處理組相比,當溫度在40~49 ℃時,隨著油脂添加量的增加,各處理組G’的首個峰值溫度均上升了2~4 ℃,說明油脂的添加以及超高壓處理會使肌球蛋白頭部的變性凝聚過程延后,這促進了該部分結構域的展開[12,23],此時肌球蛋白和油脂會相互結合形成共聚物,G’開始增加。45 ℃左右時,肌球蛋白主體展開及分子間交聯重組,造成G’下降。當溫度達到53 ℃后,低聚物進一步聚集,涉及到尾部之間的交聯,使得G’再次增加[24],并在60~80 ℃明顯增加,尤其是隨著油脂添加量的增多這種現象更加明顯,但在隨后的升溫過程中曲線逐漸趨于平緩,表明乳化凝膠結構在60~80 ℃區間快速形成,此結果與莊濤[25]的研究結果一致。由圖1還發現,在相同油脂添加量條件下,G’整體表現為200 MPa處理組>150 MPa處理組>100 MPa處理組≈0.1 MPa處理組;油脂添加量為10%時,與未添加油脂的乳化體系相比,在0.1 MPa和100 MPa下升溫過程中的G’略高于未添加組,但差異不大,而在150 MPa和200 MPa下升溫過程中G’要明顯高于未添加油脂的乳化體系。此外,油脂添加量為20%與30%時,所有高壓處理組的凝膠黏彈性明顯高于0%處理組,且150 MPa處理組對應差值達到最大,200 MPa次之。綜上,適當的壓力處理和油脂的添加可以提高乳化體系的彈性。這可能是因為隨著油脂添加量的增加,一方面提高了肌球蛋白質溶膠的交聯程度,促進了彈性結構的形成;另一方面,蛋白和油脂形成的乳化物相互作用力增強,進而提高了彈性特征[13,25]。


圖1 不同壓力處理下油脂的添加量對肌球蛋白熱凝膠G’的影響Fig.1 Effect of soybean oil content on G’ of heat-induced myosin gels under different pressure levels
2.1.2 油脂添加量對凝膠G”的影響
由圖2可知,不同油脂添加量對G”的影響程度也不同,其結果與G’類似。隨著油脂添加量的增多,在所有壓力條件下,G”都呈現出明顯增加趨勢,即30%處理組>20%處理組>10%處理組>0%處理組;整體上每條曲線呈現先上升后下降的變化趨勢。溫度在40~49 ℃范圍內,G”出現最大值,然后較快速下降,這是肌球蛋白質尾部展開造成臨時的蛋白質網絡結構被破壞所致[23-25],當溫度高于65 ℃時G”的變化逐漸趨于平緩,這是由于肌球蛋白質的頭部易在此溫度范圍內發生結合聚集。在油脂添加量相同時,G”整體表現為150 MPa處理組>200 MPa處理組>100 MPa處理組≈0.1 MPa處理組;油脂添加量為10%時,與未添加油脂的乳化體系相比,不同壓力下其升溫過程中的G”略高,而油脂添加量為20%與30%時,所有高壓處理組的凝膠G”明顯高于0%處理組。150 MPa處理組油脂添加量為30%時G”最高值達到21.20 Pa,而200 MPa處理組G”最高值下降至19.91 Pa,表明若壓力過高會導致乳化凝膠的黏性特征受到一定破壞,這與Xue Siwen[1,7]、Chen Xing[19]等的研究結果一致。綜上,適當的壓力處理和油脂的添加可以提高乳化體系的黏性,進而改善凝膠性能。此外,對比圖1、2可以發現,在相同的油脂添加量下,G’明顯高于G”,表明乳化體系加熱過程中的彈性特征要顯著高于黏性特征,這與文獻[3,13]的研究結果相似。
由圖3可知,不同壓力下,隨著油脂添加量的增加,肌球蛋白凝膠的破斷強度與0%處理組相比均呈現顯著增加的趨勢(P<0.05),但20%與30%處理組間差異不顯著(P>0.05)。油脂的加入可以增強與肌球蛋白分子之間的相互作用,促進凝膠網絡結構的形成,一定程度提高凝膠強度[14],本研究結果與莊濤[25]和Wu Mangang[26]等的研究結果一致。由圖3也可觀察到,在相同油脂添加量下,隨著作用壓力的增加,肌球蛋白凝膠的破斷強度也都呈現增加的趨勢,與0.1 MPa處理組相比,150 MPa和200 MPa處理組破斷強度顯著增加(P<0.05),但兩組間差異不顯著(P>0.05),油脂添加量為30%條件下,200 MPa處理組破斷強度達到13.54 g,與0.1 MPa處理組相比增加了23.97%。上述結果同樣說明,一定的高壓處理可以適當提高肌球蛋白的凝膠強度,改善凝膠性能。

圖3 不同壓力處理下油脂的添加量對肌球蛋白凝膠破斷強度的影響Fig.3 Effect of soybean oil content on breaking strength of heatinduced myosin gels under different pressure levels
有報道指出,超高壓作用影響蛋白凝膠硬度的原因主要包括:誘導蛋白質的變性、通過二硫鍵的作用形成高分子質量多肽、形成三維網絡凝膠結構[4-5]。Sikes等[27]利用高壓處理低鹽牛肉香腸,發現超高壓可以促進蛋白質的溶解和部分蛋白質的伸展,進而改善低鹽肉腸的質構特性。Zhang Ziye等[28]通過研究指出,較溫和的壓力水平可導致兔肌球蛋白中度變性和拉伸,破壞蛋白質結構,暴露更多的巰基和疏水基團,這些變化進一步導致聚集體和二硫鍵的形成,從而形成更強的蛋白質-蛋白質相互作用和更均勻的凝膠結構,進而提高凝膠的彈性和強度[4,28];但較高的壓力加劇了蛋白質的變性速率或解聚程度,減弱了蛋白質分子間的相互作用,導致肌原纖維蛋白交聯度降低而不利于凝膠網絡結構的形成,從而形成弱凝膠[4-5]。Alvarez等[29]的研究表明植物油能夠增強蛋白質凝膠的網絡結構,改善凝膠彈性。凝膠強度的增加是因為油脂填充了凝膠蛋白網絡的空隙,限制了凝膠網狀結構中蛋白質基質的移動,進而形成了更致密的凝膠網絡結構[14,30],此外,有研究表明,當油脂添加量增加時,有更多的蛋白能夠參與凝膠結構形成,也會使凝膠強度增加[14]。
由圖4可知,在相同壓力下,隨著油脂添加量的增加,離心損失率呈現顯著下降趨勢(P<0.05),凝膠保水性增強。當油脂添加量為10%時,隨著壓力的增加,離心損失率呈現顯著下降趨勢(P<0.05),與未添加油脂組變化趨勢相似;當油脂添加量為20%時,壓力增加到200 MPa時離心損失率降低到最低值(45.21%);當油脂添加量為30%時,隨著壓力的增加,150、200 MPa處理組與100 MPa處理組離心損失率差異顯著(P<0.05),150 MPa處理組和200 MPa處理組之間差異不顯著(P>0.05),但在200 MPa時離心損失率仍然最小(43.71%)。由以上結果可知,熱凝膠的離心損失率不僅會受到油脂含量的嚴重影響,同樣也會受到高壓作用的影響,150 MPa與200 MPa處理組添加20%或30%油脂時離心損失率較小,保水性較好。Brewer等[31]研究發現,油脂含量越低,則蒸煮損失率越高,保水性和乳化穩定性越低[13],適當地添加油脂會提高凝膠的保水性。這可能跟油脂與蛋白質的相互作用有關,當油脂含量在一定范圍時,在適當壓力下,脂肪微粒可以很好地分布于肌球蛋白中,肌球蛋白可以完全包裹脂肪微粒,形成穩定性較好的乳化物,提高保水性。Jiménez-Colmenero等[32]也發現,乳化橄欖油的添加可提高法蘭克福香腸的乳化穩定性,這與本研究結果一致。

圖4 不同壓力處理下油脂的添加量對肌球蛋白熱凝膠離心損失率的影響Fig.4 Effect of soybean oil content on centrifugal loss rate of heat-induced myosin gels under different pressure levels
如圖5所示,當未添加油脂時,隨著處理壓力的增加,凝膠的網絡更加致密,三維空間由疏松大孔結構逐漸轉變為致密小孔結構,尤其在150 MPa和200 MPa時,表現為凝膠強度明顯增加。如圖6所示,當油脂添加量為20%時,油脂的添加形成了肉眼可見的片層狀凝膠結構。結合圖5進行比較分析,隨著處理壓力的增加,其結構更加致密、緊湊,形成了更加連續的凝膠基質,外在表現為凝膠強度和保水性增加,同樣在150 MPa和200 MPa時,其表現更加明顯。這可能是因為,經過一定高壓處理后,肌球蛋白的粒度變小,進而在凝膠乳液中形成具有更加致密小孔的凝膠結構,所以表現為相對較高的凝膠強度[28];當一定的油脂加入時,因為脂肪和蛋白質的相互作用,二者包合在一起,形成了更加緊湊的乳化微球結構,再通過加熱作用進一步促使聚集的乳化微球結構形成最終致密而又緊實的片層狀凝膠結構,此時凝膠強度最好。綜上,適當的壓力處理和油脂的添加可以顯著改善肌球蛋白乳液熱凝膠的質地特性,使凝膠基質的三維網絡結構更加致密和緊湊,進而提高凝膠強度,而這種凝膠網絡結構對于水分的保持又非常有利,所以同樣有助于凝膠保水性的提高。這與前文凝膠強度與保水性的研究結果相印證。

圖5 不同壓力處理下未添加油脂的肌球蛋白熱凝膠的掃描電子顯微鏡圖Fig.5 Scanning electron microscopic images of heat-induced myosin gels without soybean oil addition under different pressure levels

圖6 不同壓力處理下添加20%油脂的肌球蛋白熱凝膠的掃描電子顯微鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopic images of heat-induced myosin gels with 20% oil addition under different pressure levels
Boyer等[33]指出,三維凝膠網絡是蛋白質-蛋白質之間、蛋白質-溶劑之間平衡的結果,在熱誘導凝膠的形成過程中蛋白質分子側鏈的快速反應能力會導致更大的分子間鍵形成。Hoogenkamp[34]發現,當用油脂對肉類蛋白進行預乳化時,會導致更多的鹽溶性蛋白參與凝膠網絡結構的形成,進而有助于凝膠強度的提高。而本研究中,適當的高壓處理或油脂的添加會顯著增加肌球蛋白分子參與更多的側鏈反應,進一步提高蛋白和脂肪分子間化學鍵的相互作用,從而提高凝膠強度,改善保水性,這與前人的研究結果[1]一致。
低場核磁共振技術是一種快速、無損的檢測手段,常用于測定樣品中水質子的分布狀態和移動性[35-36],能夠提供關于蛋白質固定水分子及其與氫質子相互作用的直接信息,從而反映肌球蛋白變性以及凝膠持水性的變化[9,13]。
由表1可知,熱凝膠水分的分布在不同壓力處理及不同油脂添加量下呈現不同的變化規律。T2b表示結合水,T21表示不易流動水,T22表示自由水,P2b表示結合水峰面積,P21表示不易流動水峰面積,P22表示自由水峰面積。油脂添加量為10%時,隨著壓力增加P22峰面積百分數降低,P21峰面積百分數增加,P2b峰面積百分數先上升后下降,T21弛豫時間整體上沒有明顯變化,T22弛豫時間先升高后降低,整體上隨著處理壓力的增加,水的流動性減弱,油脂的加入促進了肌球蛋白質的水合作用,利于保水[13],這與前面離心損失率測定的結果相印證。油脂添加量為20%時,隨著壓力增加,T21弛豫時間先升高后降低,并在200 MPa時T21弛豫時間達到最小,且顯著小于0.1 MPa處理組(P<0.05);T22弛豫時間也呈現先升高后降低趨勢,但各處理組之間的T22弛豫時間差異不顯著(P>0.05);P21峰面積百分數隨著壓力增加而增加,與0.1 MPa處理組相比,高壓處理組均顯著增加(P<0.05),P22峰面積百分數隨著壓力增加而下降,與0.1 MPa處理相比,高壓處理組均顯著降低(P<0.05),但高壓處理組之間的差異不顯著(P>0.05),上述結果表明隨著壓力的增加,不易流動水的質子部分結合程度增加,使結合水含量增加,自由水的比例下降,更有利于凝膠網絡的形成。油脂添加量為30%時,T21弛豫時間隨著壓力的增加達到110 ms左右后趨于穩定,不同壓力處理組之間T22弛豫時間沒有顯著變化(P>0.05),P21峰面積百分數與P22峰面積百分數的變化與添加20%油脂時相似,同樣說明隨著壓力的增加自由水的比例減少。上述結果表明:適當的壓力處理和油脂的添加會使原有的不易流動水與肌球蛋白結合更加緊密,促進自由水向不易流動水轉變[9,13],導致乳化物水合能力增強,并有利于增加保水性,這與前文保水性的研究結果相印證。

表1 不同壓力處理下油脂的添加量對肌球蛋白熱凝膠低場核磁弛豫特性(T2)的影響Table 1 Effect of soybean oil content on NMR relaxation properties (T2)of heat-induced myosin gels under different pressure levels
壓力和油脂添加量均會影響肌球蛋白熱凝膠的G’、G”、凝膠強度等凝膠特性,并改變其熱凝膠的微觀結構,進而影響凝膠水分的分布,最終導致凝膠保水性的變化。總體上,所有高壓處理組的G’、G”、凝膠強度、保水性等指標均明顯高于未經高壓處理組,在相同壓力處理下,上述各指標表現為隨著油脂添加量的增加而增大,即0%處理組<10%處理組<20%處理組<30%處理組;在油脂添加量相同時(以20%為例),除G’和G”外上述各指標也都隨著處理壓力的增加而增大,即0.1 MPa處理組<100 MPa處理組<150 MPa處理組<200 MPa處理組;掃描電子顯微鏡觀察結果顯示,在200 MPa條件下凝膠質地最佳;結合高壓處理和油脂添加的影響,在200 MPa條件下添加30%油脂時,其凝膠強度、保水性均達到最大值,均顯著高于0%處理組,同時具有較高的G’和G”,此時形成了致密少孔的片層狀有序凝膠結構,凝膠質地和保水性最好。此外,低場核磁共振分析實驗結果也表明適當的壓力處理和油脂的添加能夠促進乳化物水合能力的增強,并有利于保水性增加。
綜上,高壓處理結合油脂的添加對改善兔肌球蛋白熱凝膠的功能特性起到了積極作用,尤其是在200 MPa條件下添加30%植物油時凝膠性能表現最好,但是更高壓力下結合油脂處理對其熱凝膠特性的影響仍需進一步探討。