宰后成熟過程中脂多糖誘導劑對灘羊肌細胞線粒體凋亡信號通路的影響

李 榮，羅瑞明，杜 瑞，羅玉龍,*，王金霞，張 倩，陳雪妍

（1.寧夏大學食品科學與工程學院，寧夏 銀川 750021；2.銀川市農產品質量檢測中心，寧夏 銀川 750000）

線粒體作為細胞凋亡的中樞調控者，參與調控細胞氧化還原狀態變化過程和能量供應，同時對肌細胞凋亡進程起著極其重要的調控作用[1-2]。宰后肌肉組織與外界切斷聯系，缺氧缺血等變化導致細胞發生一系列生理生化反應[3]，ATP耗竭使細胞從有氧呼吸轉變為無氧糖酵解，活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導的氧化應激等使線粒體膜通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）構象發生改變，導致線粒體內促凋亡因子線粒體細胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）、凋亡誘導因子（apoptosis-inducing factor，AIF）等大量釋放，最終引發細胞凋亡級聯反應[4]?？赏ㄟ^線粒體能量變化、氧化應激水平、標志酶以及凋亡因子釋放情況等指標來表征凋亡對線粒體的影響。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，可以和TLR4基因編碼的跨膜蛋白Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）結合。LPS誘導細胞凋亡通過TLR4激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），激活后的NF-κB誘導產生促炎癥細胞因子從而介導炎癥基因和BCL-2家族的蛋白通過激活半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）活性來參與細胞凋亡過程[5]。張釗等[6]發現LPS刺激可以改變線粒體的形態，導致細胞線粒體膜電位下降，促進ROS的產生，誘導細胞凋亡。Gogvadze等[7]的研究表明從線粒體內膜釋放的各種促凋亡蛋白在胞漿中介導細胞凋亡發生，即線粒體對調控細胞凋亡的發生有著至關重要的作用。McIlwain等[8]發現給予一定劑量的LPS會引起Caspase-3的激活，LPS被認為能夠參與細胞凋亡的主要執行者——Caspase3的活化；張永波[9]的研究表明LPS可以通過氧化應激損傷的途徑使細胞發生凋亡，具有誘導細胞凋亡的能力。Ji Yinglei等[10]使用LPS處理大鼠細胞，發現其顯著上調了Caspases-12和Caspases-3蛋白的表達，表明LPS可能以劑量和時間依賴性的方式導致細胞活力降低和細胞凋亡率增加。以上研究結果均表明，LPS可誘導細胞凋亡的發生，但對于LPS誘導細胞凋亡對線粒體凋亡通路的影響鮮有研究。

本實驗以灘羊背最長肌為研究對象，通過LPS誘導凋亡，測定其在4 ℃成熟0、6、12、24、72 h過程中灘羊肉細胞凋亡率、凋亡酶活力、線粒體ATP含量、琥珀酸脫氫酶（succinatedehydrogenase，SDH）和檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）活力，采用酶聯免疫吸附測試（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒測定Bcl-2家族蛋白含量，采用Western blot法測定細胞凋亡因子Cyt-c和Caspase-3的表達量，以此闡釋灘羊肉成熟過程中LPS誘導凋亡與線粒體凋亡途徑的關系，以期為后續揭示LPS誘導凋亡的機制提供思路，并為冷卻灘羊肉貯藏期間肉品質量控制技術研發提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9 只胴體質量相近的6 月齡公灘羊購自寧夏鹽池縣寧鑫肉業有限公司。

LPS、甘露醇、4-丙磺酸基嗎琳、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸 北京索萊寶生物科技有限公司；Arsenazo III 美國MCE公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒 江蘇凱基生物科技發展有限公司；總蛋白定量測定試劑盒、ATP含量測定試劑盒、SDH活力檢測試劑盒、CS活力檢測試劑盒、Caspase-3活力檢測試劑盒、Caspase-9活力檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；雙花扁豆凝集素（dolichos bifows agglutinin，DBA）試劑盒 上?？道缮锟萍加邢薰?；綿羊Bax ELISA試劑盒、綿羊Bcl-2 ELISA試劑盒 武漢新啟迪生物科技有限公司；Anti-Cytochrome c抗體、Anti-Caspase-3抗體 美國Abcam公司。

1.2 儀器與設備

752N紫外分光光度計 上海儀電科學儀器股份有限公司；HZB-12/A家用制冰機 寧波惠康國際工業有限公司；TGL-16D冷凍高速離心機 常州中捷實驗儀器制造有限公司；JX-CL冷凍研磨儀 上海凈信實驗設備有限公司；HHS-21-6電熱恒溫水浴鍋 上海四藍儀器設備有限公司；EL×800酶標儀 美國BioTek公司；WIXEP300垂直電泳儀 韋克斯科技（北京）有限公司；SH-100凝膠圖像分析儀 上海四星生物技術公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

宰前遵循動物管理規定，屠宰后立即用滅菌刀取下右側背最長肌，剔除可見脂肪與結締組織后，分割成100 g左右肉樣，快速存入液氮作0 h樣品。剩下的肉樣切成100 g左右大小一致的肉塊，隨機分為2 組，第1組不作處理，為空白對照組，第二組注射30 mg/L LPS溶液（肉樣和處理液的質量體積比為1∶1），裝入密閉自封袋，在4 ℃條件下分別成熟0、6、12、24、72 h，并在對應時間節點測定pH值等指標，對凋亡酶活性和凋亡因子表達量等不便立即測定的指標，在相應的時間節點上取樣，用液氮快速凍結，放入-80 ℃冷凍待測。

1.3.2 pH值測定

剔除樣品可見脂肪與結締組織，使用便攜式pH計測定成熟期間肌肉pH值。

1.3.3 細胞凋亡率的測定

細胞凋亡率采用TUNEL凋亡試劑盒進行測定。將樣品處理為1 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉塊，在質量分數4%多聚甲醛溶液中進行固定，石蠟包埋、切片（厚度約為5 μm）、脫蠟，用體積分數3%過氧化氫溶液封閉。隨后將切片浸入1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗3 次，每次5 min。每個樣本上滴加100 μL蛋白酶K工作液，37 ℃反應30 min；切片再次浸入1×PBS漂洗3 次，每次5 min；切片周圍用吸水紙吸干，每個切片上滴加50 μL末端脫氧核苷酸轉移酶反應液，37 ℃避光反應1 h，反應后的切片浸入1×PBS漂洗3 次，每次5 min，注意避光；將切片放入Streptavidin-FITC標記工作液中，37 ℃避光反應30 min；然后將切片放入過氧化物酶-conjugated Anti-FITC工作液中，37 ℃避光反應30 min，與二氨基聯苯中避光顯色10 min。顯色后的樣本切片浸入1×PBS漂洗3 次，每次5 min，注意避光，用熒光顯微鏡進行觀察和計數。

1.3.4 細胞凋亡酶活力的測定

按照Caspase-3和Caspase-9活力檢測試劑盒說明書操作測定Caspase-3和Caspase-9活力。Caspase-3和Caspase-9活力以熒光強度來表示。

1.3.5 線粒體的提取

線粒體的提取參照趙亞亞[11]的方法并稍作修改。取灘羊背最長肌2 g肉樣，剪碎后置于20 mL線粒體分離介質中，用低溫研磨儀勻漿（10 000×g、2 min），勻漿液離心（4 ℃、1 000×g、10 min）而后取上清液進一步離心（4 ℃、1 000×g、10 min），后取上清液再離心（4 ℃、8 000×g、20 min），棄上清液所得沉淀即為線粒體，用BCA法測定蛋白質量濃度。

1.3.6 Cyt-c氧化還原狀態的測定

Cyt-c氧化還原狀態的測定參照Borutaite等[12]的方法并稍作修改。取2 g灘羊肌肉加入8 mL預冷的提取緩沖液（300 mmol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.5%牛血清白蛋白，pH 7.4）進行勻漿。勻漿液于低溫研磨儀10 000×g勻漿2 min，取上清液于10 000×g離心2 min，上清液再次于8 000×g離心15 min。最終得到的上清液采用雙縮脲法測定胞漿Cyt-c質量濃度。上清液分別于550 nm和535 nm波長處測定吸光度。Cyt-c還原狀態水平以550 nm波長處吸光度與535 nm吸光度之差與Cyt-c質量的比值表示。

1.3.7 ATP含量的測定

按照ATP含量檢測試劑盒的要求測定ATP含量。

1.3.8 線粒體標志酶活力的測定

按照SDH、CS檢測試劑盒的要求測定SDH、CS活力。

1.3.9 Bcl-2家族蛋白表達量的測定

凋亡關鍵因子Bax、Bcl-2表達量按照ELISA試劑盒說明書測定。

1.3.10 Western blot樣品的提取

參照Philchenkov[13]的方法提取Western blot樣品。取宰后肉樣各1 g，加入2 mL分離緩沖液（0.225 mol/L甘露醇、0.075 mol/L蔗糖、0.2%牛血清白蛋白、1 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 7.5），用玻璃勻裝器勻漿，1 000×g離心10 min取上清液，然后14 000×g離心10 min取上清液，最后10 000×g離心15 min，上清液即為全蛋白提取物，用于測定蛋白表達。

1.3.11 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot分析

參考孫志昶[14]的方法進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠和濃縮膠的質量分數分別為12%和5%。將目標蛋白轉印到聚偏二氟乙烯膜上，隨后用5%的脫脂奶粉TTBS溶液于25 ℃封閉1 h，用TTBS溶液漂洗，再與用含5%脫脂奶的TTBS溶液以500 倍稀釋的Cyt-c、Caspase-3和GAPDH抗體4 ℃反應過夜。TTBS溶液洗去多余抗體后與相對應的二抗在25 ℃條件下孵育1 h，TTBS浸洗后采用DBA試劑盒顯色。

使用掃描儀獲取圖像，然后用ImageJ分析軟件進行定量分析，計算出目的條帶的光密度值。

1.4 數據處理與分析

每個指標重復測定3 次，結果以平均值±標準差表示，采用Excel軟件統計數據，采用SPSS Statistics 26軟件對數據進行方差分析，采用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 宰后成熟過程中pH值變化

宰后肌肉pH值的下降會造成內環境的酸化，從而影響肌肉保水性，是衡量宰后初期肉品質的重要指標之一[15]。從圖1可以得出，宰后0～72 h內，對照組的pH值顯著下降了5%（P＜0.05）；12～24 h內對照組pH值顯著高于LPS處理組（P＜0.05）。LPS處理組在0～24 h內呈現顯著下降趨勢（P＜0.05），并在24 h達到極限pH值，隨后開始上升。Tao Yingmei[16]及姬琛[17]等的研究表明宰后成熟期間灘羊pH值變化范圍為5.4～6.3，本實驗研究結果符合這一規律。

圖1 灘羊宰后成熟過程中pH值的變化Fig.1 Changes of pH during postmortem aging of Tan sheep meat

2.2 宰后成熟過程中細胞凋亡率的變化

由圖2可知，綠色熒光的細胞核為TUNEL陽性細胞核。隨著宰后成熟時間的延長，TUNEL陽性細胞核數量呈現增多的趨勢，且同一成熟時間LPS處理組的TUNEL陽性細胞核數量多于對照組。可見LPS會誘導細胞凋亡。如圖3所示，宰后成熟過程中，細胞凋亡率整體呈顯著上升的趨勢（P＜0.05）；0～72 h，對照組和LPS處理組細胞凋亡率分別上升至31.70%和42.47%；成熟期間對照組細胞凋亡率均顯著低于LPS處理組（P＜0.05），表明LPS處理灘羊促進了細胞凋亡進程，對細胞凋亡具有誘導作用。

圖2 LPS處理對宰后灘羊肉成熟過程中TUNEL陽性細胞核染色免疫熒光圖Fig.2 Effect of LPS on immunofluorescence image of TUNEL-positive cell nuclei in Tan sheep meat during postmortem aging

圖3 宰后灘羊肉成熟過程中細胞凋亡率的變化Fig.3 Changes in cell apoptosis rate during postmortem aging of Tan sheep meat

2.3 宰后成熟過程中細胞凋亡酶活力的變化

線粒體凋亡通路中，Caspae-9和Caspae-3作為重要的效應酶，與凋亡的發生密切相關。由圖4A可知，LPS處理組Caspase-9活力在0～12 h顯著上升并達到最大值1.413，隨后顯著下降（P＜0.05）；6～12 h內對照組Caspase-9活力顯著上升并在12 h達到最大值1.306；0～72 h，LPS處理組Caspase-9活力均顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖4B所示，對照組Caspase-3活力在宰后成熟過程中顯著上升（P＜0.05），并于24 h達到最大值，隨后呈現顯著下降趨勢（P＜0.05）；0～72 h內，LPS處理組Caspase-3活力呈先升后降趨勢，并于24 h達到最大值；0～72 h內，LPS處理組Caspase-3活力均顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖4 宰后灘羊肉成熟過程中Caspase-9（A）和Caspase-3（B）活力變化Fig.4 Changes in Caspase-9 (A) and Caspase-3 (B) activities during postmortem aging of Tan sheep meat

2.4 宰后成熟過程中Cyt-c的氧化還原狀態的變化

研究表明Cyt-c的氧化還原狀態對于細胞凋亡的啟動具有重要影響。只有氧化型Cyt-c能夠激活Caspase，還原型Cyt-c沒有啟動細胞凋亡的作用[18]。圖5反映了宰后灘羊肉成熟過程中Cyt-c氧化還原狀態變化，宰后0～72 h，對照組和LPS處理組中Cyt-c還原水平顯著降低（P＜0.05）。LPS處理組的下降速度較對照組更快。Cyt-c還原水平的下降表明Cyt-c氧化水平升高，由此介導細胞凋亡發生。

圖5 宰后灘羊肉成熟過程中Cyt-c還原水平的變化Fig.5 Changes in cytochrome c reduction level during postmortem aging of Tan sheep meat

2.5 宰后成熟過程中線粒體ATP含量的變化

灘羊宰后細胞內環境改變，阻斷了氧氣進入，缺氧使線粒體的氧化還原電位降低，造成呼吸鏈功能紊亂，ATP不能正常合成，磷酸原體系中的肌酸磷酸也會在很短的時間內被耗盡，無氧酵解途徑開啟，最終產生大量的乳酸[19]。由圖6可知，線粒體ATP含量在宰后成熟過程中整體呈現顯著下降的趨勢（P＜0.05）；0～72 h內，對照組ATP含量顯著降低了47.34%，LPS處理組的ATP含量顯著下降了56.02%，LPS處理組ATP含量顯著低于對照組（P＜0.05），這可能是LPS加快了細胞從有氧呼吸向無氧糖酵解的進程。

圖6 宰后灘羊肉成熟過程中ATP含量的變化Fig.6 Changes in mitochondrial ATP content during postmortem aging of Tan sheep meat

2.6 宰后成熟過程中線粒體標志酶活力的變化

SDH和CS作為線粒體的標志酶，均與能量代謝相關。SDH作為連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為呼吸鏈提供電子，是參與三羧酸循環的關鍵酶，SDH活力可以有效反映線粒體的功能[20]。CS作為三羧酸循環的關鍵調控酶，其活性及變構效應受到ATP的抑制[21]。由圖7A可知，成熟早期（0～6 h），LPS處理組SDH活力均顯著低于對照組（P＜0.05），呈顯著上升趨勢（P＜0.05）；隨后6～72 h呈顯著下降趨勢，可能是因為LPS處理加劇了線粒體能量的消耗，從而引起SDH活力短暫升高。如圖7B所示，LPS處理組CS活力在0～6、12～72 h內呈現顯著下降趨勢（P＜0.05），6～12 h內呈顯著上升趨勢（P＜0.05）；對照組CS活力在0～12、24～72 h內呈顯著下降趨勢（P＜0.05），12～24 h顯著上升趨勢（P＜0.05）。

圖7 宰后灘羊肉成熟過程中SDH活力（A）和CS活力（B）的變化Fig.7 Changes in SDH activity (A) and CS activity (B) during postmortem aging of Tan sheep meat

2.7 宰后成熟過程中Bcl-2家族蛋白水平的變化

Bax和Bcl-2都屬于Bcl-2蛋白家族，通過調節線粒體膜通透性參與線粒體凋亡途徑并發揮關鍵作用[22]。成熟期間Bax水平的變化如圖8A所示，在宰后成熟過程中，Bax水平整體呈現先上升后下降趨勢，6 h為最高值。這與Ma Jibing等[23]在牛肉宰后成熟期間觀察到Bax的水平呈現先上升后下降的趨勢結果一致。成熟期間Bcl-2水平的變化如圖8B所示，在宰后成熟期間Bcl-2水平整體呈現顯著下降的趨勢（P＜0.05）；其中LPS處理組水平顯著低于對照組（P＜0.05），劉暢[24]的研究也表明蒙古羊宰后成熟過程中Bcl-2水平呈現下降趨勢。

圖8 宰后灘羊肉成熟過程中Bax（A）和Bcl-2（B）水平的變化Fig.8 Changes in Bax (A) and Bcl-2 (B) levels during postmortem aging of Tan sheep meat

Bcl-2家族蛋白是線粒體凋亡途徑的主要調控者，Bax和Bcl-2含量的比值（Bax/Bcl-2）可用來評估LPS其對誘導凋亡發生的作用。目前普遍認為，高Bax/Bcl-2表明促凋亡能力更強，低Bax/Bcl-2表明抗凋亡能力更強[23,25]。如圖9所示，在宰后成熟過程中，LPS處理組的Bax/Bcl-2顯著高于對照組（P＜0.05）。綜上說明，LPS可以調控Bcl-2家族蛋白含量，誘導凋亡的發生。

圖9 宰后灘羊肉成熟過程中Bax/Bcl-2的變化Fig.9 Changes in Bax/Bcl-2 ratio during postmortem aging of Tan sheep meat

2.8 宰后成熟過程中線粒體信號通路關鍵因子釋放的情況

由圖10、11可知，在宰后成熟過程中，LPS處理組的胞漿Cyt-c表達量在宰后12 h顯著升高，24～72 h內LPS處理組胞漿Cyt-c表達量呈下降趨勢。這是由于宰后前期Cyt-c大量釋放，而隨著線粒體損傷的加重，Cyt-c的合成量不斷減少，且一部分Cyt-c與Apaf-1結合，最終導致Cyt-c含量在宰后24 h后逐漸減少[26]。

圖10 宰后灘羊肉成熟過程中Cyt-c的免疫印跡表達Fig.10 Changes in protein expression of Cyt-c during postmortem aging of Tan sheep meat

圖11 宰后灘羊肉成熟過程中Cyt-c的表達Fig.11 Changes in Cyt-c expression during postmortem aging of Tan sheep meat

Caspase-3可以切割細胞骨架蛋白，它的激活標志著細胞凋亡的發生[27]。孫志昶[14]研究發現牦牛宰后成熟過程中確實存在細胞凋亡現象，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9均發生活化。本實驗測定了Caspase-3活化蛋白的相對表達量，以分析LPS處理對宰后細胞凋亡的影響。Caspase-3酶原本身并沒有誘導凋亡的活性，只有裂解為17～20 kDa的活化片段才能參與誘導細胞凋亡。

圖12為不同處理組分別成熟0、6、12、24、72 h后Caspase-3的免疫印跡圖譜，可以看出，經過LPS處理后，灘羊肉骨骼肌中Caspase-3活化片段的灰度均高于對照組。這說明在凋亡誘導劑LPS處理加快了Caspase-3酶原被激活并降解成活性片段的速度，故LPS是通過加速Caspase-3酶原的激活促進細胞凋亡。對活化片段進行光密度值的定量分析，結果如圖13所示。LPS處理組的Caspase-3活化片段蛋白相對含量始終高于對照組，表明LPS處理組灘羊肉中Caspase-3裂解成活性片段的程度強于對照組，因此，LPS處理有利于加速宰后Caspase-3的激活。

3 討論

細胞凋亡過程中DNA會發生降解形成碎片化，從而產生大量的黏性3’-OH末端，可通過TUNEL熒光標記，觀察綠色熒光變化，以此了解細胞凋亡情況[28]。本研究中，通過觀察TUNEL陽性細胞核數量以及計算細胞凋亡率得出，隨著成熟時間的延長，細胞凋亡率呈現上升趨勢，在同一成熟時間內LPS處理會加快細胞凋亡的進程。Cyt-c介導細胞凋亡通常伴隨著線粒體損傷[29]。研究發現Cyt-c氧化還原狀態與細胞凋亡的發生密切相關。本研究結果表明，宰后0～72 h，隨著宰后時間的延長，Cyt-c還原水平逐漸降低，氧化水平逐漸升高，表明Cyt-c釋放介導細胞凋亡發生在宰后早期。Cyt-c在線粒體介導的細胞凋亡途徑中發揮核心作用[30]。Caspase-9活力整體呈現先上升后下降的趨勢，這可能是由于宰后前期LPS處理影響Cyt-c氧化還原的活性，氧化型Cyt-c含量增多，從而介導Caspase級聯反應信號不斷放大，致使Caspase-9的活力上升。以上研究說明，LPS通過促進氧化型Cyt-c形成凋亡小體的作用，間接促進Caspase-9和Caspase-3的激活。Caspase-9的活化早于Caspase-3發生。即Caspase-9作為線粒體凋亡通路中凋亡啟動酶，能啟動下游的效應酶Caspase-3，進而引起線粒體通路細胞凋亡的發生。

本研究中LPS處理組肌肉pH值隨成熟時間延長先下降后上升，并在24 h達到極限pH值，這可能是宰后內環境改變切斷了與外界的聯系，有氧呼吸轉變為糖酵解生成乳酸所致。宰后ATP含量整體顯著下降，這是因為宰后氧氣的阻斷導致線粒體中氧化還原電位下降，呼吸電子傳遞鏈發生功能障礙，不能正常地通過三羧酸循環合成ATP，細胞由有氧呼吸途徑進入無氧酵解途徑，導致細胞內ATP的生成量迅速降低[31-32]。這一能量變化的過程會影響線粒體標志酶——SDH和CS的活性，本研究發現宰后成熟早期處理組SDH活力高于對照組，CS活力在0～12 h隨著成熟時間的延長呈現先下降后上升的趨勢。宰后成熟過程中Bax含量整體呈現先上升后下降趨勢，Bcl-2含量整體呈現下降趨勢。Bax和Bcl-2分別是促凋亡和抗凋亡蛋白，研究發現在凋亡條件下，Bax激活后在線粒體外膜積累，并發生寡聚化，從而導致促凋亡因子如Cyt-c的釋放[33]。Bax/Bcl-2可用來評估凋亡發生的程度，本研究結果表明，Bax/Bcl-2呈現上升趨勢，且LPS處理組顯著高于對照組。通過對Cyt-c和Caspase-3活化蛋白表達量的測定，發現LPS處理加快了Cyt-c的釋放和Caspase-3活化，對凋亡進程起到促進作用。

綜上，宰后成熟過程中LPS 誘導劑是通過激活Caspase-9和Caspase-3活性、降低細胞能量代謝水平進而影響SDH和CS的活性，促使Cyt-c釋放，提高Bax/Bcl-2比值，從而誘導細胞通過線粒體信號通路發生凋亡。