加米霉素注射液對靶動物牛的安全性試驗

孫晨明，徐亞亞

（ 江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300 ）

牛呼吸道疾病（bovine respiratory disease，BRD）是犢牛最常見的疾病之一，其發病率和死亡率均很高，對養牛業造成了巨大的經濟損失[1]。目前研究指出，BRD的發病機制較為復雜，致病性細菌如溶血性曼氏菌（Mannheimia haemolytica）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）、睡眠嗜組織菌（Histophilus somni）和支原體（Mycoplasmaspecies）是導致該病發病率和死亡率高的主要因素[2]。加米霉素屬于第二代大環內酯類抗生素，其注射劑在美國已批準用于在非泌乳牛治療由溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌和牛支原體引起的BRD[3-4]。加米霉素具有吸收快、體內分布廣泛、體內殘留低和安全性高等優點[5-6]，國內也已成功研制了加米霉素注射劑。本研究參考《VICH獸藥靶動物安全性研究指導原則》中針對牛的安全性評價內容，進行了加米霉素注射液在靶動物牛的安全性試驗，旨在根據加米霉素注射液在犢牛多次給藥后的體重、血液學、血液生化、病理學檢查和皮下注射刺激性的結果，綜合評價加米霉素注射液在牛的安全性[7]，以期為加米霉素應用于臨床治療畜禽相關疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥品與試劑

加米霉素注射液，規格為50 mL∶7.5 g（15%），批號為1304001，由齊魯動物保健品有限公司生產；瑞士染液、結晶紫染液、中性紅染液和磷酸鹽緩沖液購自默克公司；冰醋酸和氯化鈉購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

日立7150 全自動生化分析儀（日本日立公司）、Sysmex KX-21血細胞分析儀（日本Sysmex公司）、生物顯微鏡（德國Zeiss 公司）；組織切片機及其他病理學檢查常用儀器設備。

1.1.3 試驗動物

24只日齡、體重一致且具有相似背景的健康犢牛，雌、雄各半，采用耳號標記，適應性飼養1 w，于試驗前1 d經獸醫檢查確認處于良好的健康情況。

1.2 試驗設計

采用多劑量水平給藥進行研究，24只犢牛隨機分為空白對照組、最大推薦劑量組、3倍最大推薦劑量組和5倍最大推薦劑量組，每組6只，雌、雄各半。空白對照組犢牛皮下注射0.9%氯化鈉溶液0.2 mL/kg BW，注射體積與5倍最大推薦劑量一致；最大推薦劑量組、3 倍最大推薦劑量組、5 倍最大推薦劑量組犢牛皮下注射加米霉素注射液2、6、10 mL/50 kg BW（即6、18、30 mg/kg BW，以加米霉素計）。每個處理組共計給藥3 次，分別于第0、第5 和第10 d 同一時間各給藥一次。每次注射后應標記注射部位，以避免相同部位重復注射，每個注射部位的注射體積不大于10 mL。初次注射時，所有犢牛均于左頸中部皮下注射，用于評價注射部位的刺激性。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 臨床觀察

給藥后4 h 內每小時觀察一次，末次給藥后繼續觀察5 d，除給藥后觀察外，試驗期間每天上、下午各觀察1 次。臨床觀察內容包括動物脫水、排便情況，如是否出現稀糞、軟糞或便秘等，以及精神情況、毛發狀態和攝食情況等[8]。

1.3.2 體重

試驗期間，于第0 d給藥前及第5、第10和第15 d分別稱量并記錄各處理動物體重，計算增重和平均日增重。

1.3.3 血常規及血液生化指標

試驗期間，于第0 d給藥前及第5、第10和第15 d分別采集血液樣品，每頭犢牛采集10 mL，其中5 mL 抗凝血用于血常規各項指標的檢測，5 mL未抗凝血用于血液生化各項指標的檢測[9]。

血常規指標包括：白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血細胞比容（HCT）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細胞分布寬度（RDW）、血小板（PLT）。

血液生化指標包括：鉀離子（K+）、鈉離子（Na+）、氯離子（Cl-）、氯化鈣（CaCl2）、葡萄糖（GLU）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、直接膽紅素（DBIL）、乳酸脫氫酶（LD）、堿性磷酸酶（ALP）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）。

1.3.4 病理學檢查

試驗期間，所有死亡犢牛均需進行尸檢，通過相關診斷技術明確死亡原因。試驗第15 d 采血后對所有存活的犢牛進行安樂死，進行與藥物損傷相關的眼觀病理學檢查，采集主要臟器和組織進行組織病理學檢查。眼觀和組織病理學檢查的臟器組織包括：肝臟、腎臟、心臟、脾臟、胃臟、肺臟、胸腺和淋巴結。

如主要臟器組織的病理學檢查結果顯示出與藥物相關的毒性，則需增加對其余臟器組織的檢查；若與空白對照組相比，5 倍最大推薦劑量組未出現與藥物相關的組織病理學變化，則最大推薦劑量組和3倍最大推薦劑量組無須進行組織病理學檢查。

1.3.5 注射部位刺激性

試驗期間，分別在第1、第4、第5、第10 d 眼觀評估初次注射部位，并于第15 d病理學檢查時對注射部位進行剖檢，通過眼觀和剖檢對注射部位評估[10-11]，評估分級標準見表1。

1.4 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析，采用t檢驗比較空白對照組與各給藥組間各項評價指標的差異顯著性[12]。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 不同劑量加米霉素對靶動物牛健康情況的影響

試驗期間無犢牛死亡。注射后10 min 時，3 倍最大推薦劑量組和5倍最大推薦劑量組中個別犢牛出現注射部位不適，表現為躁動不安，后癥狀逐漸緩解。除此之外，試驗期間未觀察到與處理相關的其他異常情況，犢牛精神、飲食與糞便等均良好。

2.2 不同劑量加米霉素對靶動物牛體重的影響（見表2）

由表2 可知，與空白對照組相比，5 倍和3 倍最大推薦劑量組犢牛的體重增加均稍有減緩，最大推薦劑量組平均日增重最高，但不同階段3個給藥組犢牛體重與空白對照組相比差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同劑量加米霉素對靶動物牛血常規及血液生化指標的影響（見表3、表4）

表3 不同劑量加米霉素對靶動物牛血常規指標的影響Tab.3 Effects of different doses of gamithromycin on routine indexes of bovine blood in target animals

表4 不同劑量加米霉素對靶動物牛血液生化指標的影響Tab.4 Effects of different doses of gamithromycin on blood biochemical indices of target animal cattle

由表3可知，與空白對照組相比，各給藥組犢牛血常規指標差異均不顯著（P＞0.05）。

由表4可知，與空白對照組相比，各給藥組犢牛血液生化指標差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 不同劑量加米霉素對靶動物牛注射部位的影響

眼觀病理學檢查未觀察到與藥物毒性相關的病變，空白對照組與5倍最大推薦劑量組犢牛主要臟器組織病理學切片見圖1。

圖1 空白對照組與5倍最大推薦劑量組犢牛主要臟器組織病理學切片Fig.1 Histopathological sections of major organs of calves in blank control group and five times maximum recommended dose group

由圖1可知，除5倍最大推薦劑量組牛肺輕度瘀血外，其余組織均未觀察到病理學變化。

2.5 不同劑量加米霉素對靶動物牛注射部位的刺激性評估

試驗期間，3 倍和5 倍最大推薦劑量組中均有個別犢牛在每次注射后表現出注射部位不適癥狀，觸摸注射部位時犢牛呈現敏感和輕微的疼痛癥狀，但數分鐘后即緩解。試驗期間給藥組注射部位觀察結果包括一過性腫脹、發熱、水腫、疼痛以及注射部位硬度增加。第15 d 對注射部位進行組織病理學檢查，眼觀病理變化主要為注射部位皮膚增厚，高劑量組腫脹較明顯，空白對照組則吸收較迅速。試驗結束時，空白對照組與最大推薦劑量組均恢復良好，3 倍最大推薦劑量組中2 頭犢牛可以觀察到輕度皮膚增厚，5 倍最大推薦劑量組中4 頭犢牛仍能觀察到注射部位外表稍微腫脹。組織病理學結果顯示，5 倍最大推薦劑量組注射部位肌肉變性、組織纖維化，損傷面積在6 cm2。綜上所述，加米霉素注射液最大推薦劑量在犢牛皮下注射，注射部位具有較好的耐受性。

3 討論

本試驗根據相關指導原則的規定，設最大推薦劑量組、3 倍最大推薦劑量組和5 倍最大推薦劑量組以及一個空白對照組，按既定的給藥方案皮下注射加米霉素注射液和0.9%氯化鈉溶液，給藥后根據犢牛臨床表現、體重和增重、血常規和血液生化指標以及眼觀和組織病理學檢查，綜合評價加米霉素注射液的安全性[7]。試驗期間所有受試牛存活，除注射后10 min 內3 倍和5 倍最大推薦劑量組犢牛出現一過性的注射部位不適外，未觀察到與藥物安全性相關的其他異常，所有處理組犢牛健康情況均良好。試驗各階段，給藥組犢牛體重與空白對照組比較無統計學差異，且呈現與劑量相關的明顯變化趨勢。給藥組與空白對照組紅細胞、白細胞和血小板等7項血常規指標以及鉀離子、肌酐和總膽固醇等16項血液生化指標均無顯著統計學差異。組織病理學檢查顯示，5 倍最大推薦劑量組肺輕度瘀血，除此之外眼觀和組織病理學檢查均發現與加米霉素安全性相關的病理變化。

目前關于加米霉素在豬和牛的安全性研究相對較多，無加米霉素對肺有損傷的報道。本試驗中對其余給藥組犢牛肺部進行額外的組織病理學檢查，亦無病變，因此5倍最大推薦劑量組觀察到的輕度肺瘀血可能與采樣操作、動物生理情況等有關，而非由藥物毒性導致[13-15]。試驗期間，3 倍和5 倍最大推薦劑量組犢牛注射部位表現出一過性的刺激，且臨床觀察和病理學結果均顯示注射部位刺激性；而最大推薦劑量組和空白對照組犢牛注射部位均未呈現刺激性，恢復良好。

4 結論

加米霉素注射液在靶動物犢牛安全性試驗結果表明，加米霉素注射液按照5倍最大推薦劑量給藥未呈現毒性，按推薦劑量給藥具有較大的安全性；最大推薦劑量皮下注射無刺激性，3 倍和5 倍最大推薦劑量皮下注射給藥會對皮膚產生一定的損傷。